單克隆抗體、雜交瘤、免疫測定法和診斷試劑盒的製作方法

2023-12-09 02:34:41

專利名稱：單克隆抗體、雜交瘤、免疫測定法和診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及識別作為抗原的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)過氧化氫酶的單克隆抗體，一種產生所述單克隆抗體的雜交瘤，一種免疫測定法和診斷試劑盒。
背景技術：
幽門螺桿菌是一種在人胃黏膜中發現的細菌。幽門螺桿菌感染率與社會和經濟因素密切相關，在發展中國家中較高，而在發達國家中較低。然而在發達國家中，日本的感染率特別高，甚至有報導80％的40至40歲以上的人被感染過。近年來，已揭示幽門螺桿菌可導致各種胃和十二指腸疾病，如胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎和更嚴重的胃癌。
由於證實可通過根除幽門螺桿菌減少被這些疾病折磨的可能性，對根除幽門螺桿菌針對的疾病已進行了國際討論。因此，目前認為這種根除所針對的疾病包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍、惡性胃淋巴瘤、早期胃癌切除後的剩餘胃。
鑑於幽門螺桿菌根除治療是治療胃和十二指腸疾病的一種新方法，日本胃腸道病學學會已提出了治療試驗的指導原則和診斷幽門螺桿菌感染發生，和判斷細菌根除的方法(The Japanese Journal of Gastroenterology，vol.96，199-207，1999)。根據上述治療試驗的指導原則，指出對發生的診斷應基於侵襲性測試法，即培養胃部的活組織標本，顯微鏡檢和尿素酶測試來進行，而對細菌根除的判斷主要需要培養胃部的活組織標本，顯微鏡檢和尿素呼氣測試，它是非侵襲性試驗。在特殊情況下，例如在兒科病人中，它指出這種判斷應基於結合血液中的抗幽門螺桿菌抗體和發生性診斷進行。
然而這些幽門螺桿菌感染的測試法有下列問題。侵襲性測試法在胃鏡插入和活組織檢查時給病人帶來很大的痛苦。對於非侵襲性測試法，病人中的疼痛感大大減少，但是尿素呼氣測試需要在測試前禁食。另外，在進行尿素呼氣測試時，需要質譜儀、紅外分光光度計等儀器，因此測試僅能在特別的機構中進行，而導致的高成本也是個缺點。抗體測試不適合判斷細菌的根除，因為血液中的抗體滴度在細菌根除後的很長一段時間內仍然維持在高水平。因此，期待一種非侵襲性測試法的到來，它能代替上述測試法，並可直接和特異性的以高準確度檢測幽門螺桿菌感染。
在本領域內，採用選擇培養基培養分離了來自消化道排洩物，特別是糞便的感染性細菌的培養物，作為消化道內感染性細菌的直接測試法。然而，對於幽門螺桿菌，雖然進行了大量試驗，對於通過培養分離來自糞便的幽門螺桿菌幾乎沒有報導。可能的原因是該微生物在下消化道中已經經過轉化，成為粒狀體，不能通過培養分離，因為幽門螺桿菌在體外經過形態變化，從原來的螺旋形變成了球菌形，它無法在不理想的環境條件，如低溫、營養缺陷和氧缺陷下培養。
另一方面，對於用基於抗原-抗體反應的免疫學方法直接從糞便中檢測幽門螺桿菌，有一篇報導通過使用針對幽門螺桿菌的多克隆抗體檢測排洩物標本，如糞便中的幽門螺桿菌(J.Clin.Microbiol.，vol.33，2162-2165，1995；日本專利公開出版物號平-10-10128(JP3043999))。
然而，多克隆抗體通常具有交叉反應性，在特異性上較差，另外，缺點還在於抗體滴度和特異性可以隨抗血清的批次而變化。因此，問題在於使用多克隆抗體的診斷測試特別難於控制質量。事實上，對於檢測糞便中幽門螺桿菌抗原的「HpSA」試劑盒(Meridian的產品，日本3043999號的專利人)，和其中使用的多克隆抗體，已提出了遇到假陽性事件和低特異性的問題(Medical Tribune，4-5，1999年6月3日號；Am J.Gastroenterol.，94卷，1830-1833，1999)。
相反，在日本專利公開出版物號平-10-10128中描述了由於幽門螺桿菌易於變異，僅能與各抗原單獨反應的單克隆抗體不適用於檢測幽門螺桿菌，但是可與各種抗原或表位反應的多克隆抗體反而適合檢測幽門螺桿菌。
發明簡述根據上述現有技術，本發明的目的是提供一種診斷方法，通過它可以低成本的診斷幽門螺桿菌感染，而且不對病人造成痛苦，也不需要特別的裝置，而且由於使用了一種抗體，沒有交叉反應性，特異性良好，在批與批之間沒有變化，便於質量控制，而且當使用一種單克隆抗體時，也顯示良好的靈敏度。
本發明提供了一種識別作為抗原的幽門螺桿菌過氧化氫酶的單克隆抗體。
本發明提供了一種雜交瘤，它產生識別作為抗原的幽門螺桿菌過氧化氫酶的單克隆抗體。
本發明的雜交瘤優選是21G2(FERM BP-7336)、41A5(FERM BP-7337)或82B9(FERM BP-7338)。
由本發明的雜交瘤產生的單克隆抗體構成了本發明的一個方面。
用至少一種本發明的單克隆抗體進行的免疫測定法構成了本發明的一個方面。
本發明的免疫測定法優選用任何一種上述提到的單克隆抗體進行。
本發明的免疫測定法優選用於判斷幽門螺桿菌感染。
本發明的免疫測定法的標本優選是消化道排洩物。
本發明的免疫測定法優選用ELISA或免疫層析技術進行。
含有至少一種本發明的單克隆抗體的診斷試劑盒也構成了本發明的一個方面。
本發明的診斷試劑盒優選含有任何一種上述的單克隆抗體。
本發明的診斷試劑盒優選用於判斷幽門螺桿菌感染。
本發明的診斷試劑盒標本優選是消化道排洩物。
本發明的診斷試劑盒優選用ELISA或免疫層析技術進行。
本文所稱的過氧化氫酶不含有對應於通過變性劑，如SDS變性、分離或立體結構解旋後得到的亞基的那些蛋白質。
附圖簡述

圖1說明了實施例9觀察到的親和層析柱的洗脫曲線。
圖2說明了實施例11觀察到的親和層析的洗脫曲線。
發明詳述在下文中詳細描述了本發明。
本發明的單克隆抗體識別幽門螺桿菌作為抗原。
本發明的單克隆抗體可通過本發明的雜交瘤產生，因此是可以從培養本發明的雜交瘤的培養液中獲得的。然而，產生本發明的單克隆抗體的方法不受特別限制，但如果基因工程化的抗體如能與幽門螺桿菌過氧化氫酶特異性結合，它也在本發明的範圍內。
本發明的雜交瘤產生識別幽門螺桿菌過氧化氫酶作為抗原的單克隆抗體，並可通過經幽門螺桿菌免疫的動物的脾細胞或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞融合獲得。
本發明的雜交瘤可以用本領域已知的細胞融合技術產生。因此，用幽門螺桿菌作為免疫原免疫除了人以外的動物，將該動物的脾細胞或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤，從其選出產生識別幽門螺桿菌的單克隆抗體的雜交瘤，從而獲得了本發明的雜交瘤。
上述免疫原不受特別限制，但是可以是任何含有幽門螺桿菌過氧化氫酶的免疫原。因此例如可能提到通過在合適的培養基上培養幽門螺桿菌菌株，培養物可獲得螺旋形的細胞、球形的細胞、破裂產物、裂解產物或這些細胞的抽提物及其片段。
上述過氧化氫酶不受特別限制，但可以是例如滅活的、具有部分破壞的立體結構的、或部分缺失的。然而，優選具有四個亞基的，更優選天然的。
本文所用的術語「天然酶」指維持在近似生理條件下發現的固有結構，從而具有全部亞基和活性的酶。
在上述提到的免疫原中，優選球菌的破碎產物。因為在體外，幽門螺桿菌形態從原來的螺旋形變成球形，不能被培養，在低溫、營養缺陷、氧缺陷等不良環境條件下不能被培養，因此認為它轉化成球菌型，不能培養分離，在消化道排洩物中也一樣。還認為幽門螺桿菌細胞在下消化道中以破碎形式存在。
用作上述免疫原的幽門螺桿菌菌株不受特別限制，但包括例如ATCC 43504和NCTC 11638，它們是標準菌株，還包括其他從感染的病人分離的菌株。用作上述免疫原的幽門螺桿菌基因型不受特別限制。因此例如它可以具有或不具有vacA或cagA，另外，vacA可以具有序列S1a、S1b和S2任一，並具有序列m1和m2任一。
經免疫產生本發明的雜交瘤的動物不受特別限制，但包括例如山羊、綿羊、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔。在其中優選的是小鼠。
可用任何本領域已知的方法免疫上述要免疫的動物。在免疫小鼠中，例如，可能提到方法包括將1-100微克，優選50-100微克/劑的免疫抗原乳化在等體積(0.1毫升)生理鹽水和弗氏完全佐劑，或RIBI佐劑系統中，將該乳液施給上述動物，在背側或腹部位皮下免疫，或每隔2-3周腹膜內免疫3-6次。
在本發明的實踐中，免疫上述動物後選擇抗體滴度高的個體，最後一次加強免疫3-5日後切下它們每一隻的脾臟或淋巴結，將這些組織中所含的產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞通過本領域已知的細胞融合法，在融合促進劑存在下融合。
上述融合促進劑不受特別限制，但包括例如聚乙二醇(下文稱為「PEG」)，仙臺病毒等。然而PEG是優選的。
上述骨髓瘤細胞不受特別限制，但包括例如小鼠衍生的細胞，例如P3U1、NS-1和P3x63.Ag8.653細胞；和大鼠衍生的細胞，例如AG1和AG2細胞。
上述細胞融合方法不受特別限制，但可以包括方法以1∶1-10∶1之比混合脾細胞和骨髓瘤細胞，加入分子量為1,000-6,000的PEG至濃度10-80％，在20-37℃，優選30-37℃下孵育該混合物3-10分鐘。
在本發明的實施中，產生識別幽門螺桿菌的單克隆抗體的雜交瘤的選擇可通過例如在雜交瘤單獨能生長的選擇培養基(如HAT培養基)上培養雜交瘤，並用酶聯免疫吸附分析(ELISA)法測定各雜交瘤培養上清液中的抗體活性來進行。另外，在本發明中，可通過限制性稀釋等方法重複克隆產生識別幽門螺桿菌的單克隆抗體的雜交瘤，從而實現能產生識別幽門螺桿菌的單克隆抗體的雜交瘤的建立。
作為本發明的雜交瘤，提到例如21G2(保藏號FERM BP-7336)、41A5(保藏號FERM BP-7337)和82B9(保藏號FERM BP-7338)。這些雜交瘤於1999年8月14日被保藏在工業科學技術局，國立生命科學和人體技術研究所(1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)。
大量製備本發明的單克隆抗體的方法不受特別限制，方法可以是例如將雜交瘤移植到預先施用降植烷的小鼠腹腔中，回收腹水並從其獲得抗體。可通過本領域已知的方法，用蛋白A柱或蛋白G柱等純化腹水中的單克隆抗體。
本發明的單克隆抗體識別過氧化氫酶作為抗原。
上述過氧化氫酶不受特別限制，但可以是任何保留表位的。例如，可以是滅活的、具有部分破壞的立體結構的、或部分缺失得到的。然而，優選具有4個亞基的，更優選天然的。上述過氧化氫酶包括那些有一個突變的酶等。
產生上述過氧化氫酶的幽門螺桿菌菌株不受特別限制。
產生上述過氧化氫酶的幽門螺桿菌的基因型也不受特別限制。例如，它可以具有或不具有vacA或cagA，而且vacA可以是序列S1a、S1b和S2任一，並可具有序列m1和m2任一。
上述產生過氧化氫酶的幽門螺桿菌的形態不受特別限制，但包括例如幽門螺桿菌的螺旋狀形式和幽門螺桿菌的球菌形式。
本發明的單克隆抗體的家族和亞家族不受特別限制，但可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA1、IgA2和IgD任一。L鏈也不受特別限制，但可以是λ鏈或κ鏈。
本發明的單克隆抗體不受特別限制，但可以是任何能與幽門螺桿菌過氧化氫酶特異性結合的抗體。例如，可以是F(ab』)2、Fab』或Fab，它是本發明單克隆抗體的降解產物，或嵌合抗體。
上述雜交瘤株21G2(保藏號FERM BP-7336)、41A5(保藏號FERM BP-7337)和82B9(保藏號FERM BP-7338)分別產生單克隆抗體(下文有時分別稱為「單克隆抗體21G2」、「單克隆抗體41A5」和「單克隆抗體82B9」)，它們識別天然類型的幽門螺桿菌過氧化氫酶。
本發明人用單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9分別對幽門螺桿菌細胞破碎產物進行了固定化抗體的親和層析，隨後檢測到包含在幽門螺桿菌破碎產物中的分子量為270kDa的蛋白。在用SDS-聚丙烯醯胺凝膠對該蛋白電泳後，檢測到分子量為59kDa的單一條帶。測序後，該蛋白的N-末端胺基酸與幽門螺桿菌過氧化氫酶的胺基酸序列相符。已知幽門螺桿菌過氧化氫酶具有200kDa的分子量，並具有分子量各為50kDa的4個亞基的四聚體結構(J.Gen.Microbiol.(1991)，137，57-61)。
因此基於上述結果，用單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9檢測到的蛋白質被鑑定為具有4個亞基的幽門螺桿菌過氧化氫酶，並揭示每一種上述抗體都識別具有4個亞基的過氧化氫酶。
過氧化氫酶活性試驗揭示上述固定化抗體的親和層析中檢測到的過氧化氫酶具有活性，該過氧化氫酶是所謂的天然酶。
單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9都不與解離得到的過氧化氫酶亞基反應。
粗略的根據純化過氧化氫酶過程中比活力的增加計算，過氧化氫酶佔幽門螺桿菌中全蛋白的比例最多是0.5％，如J.Gen.Microbiol.(1991)，137，57-61所述。
根據該觀點，令人驚奇而且出乎意料的發現單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9可以識別具有4個亞基的過氧化氫酶。
過氧化氫酶在不同的生物中都是非常保守的，已知幽門螺桿菌過氧化氫酶與其他細菌過氧化氫酶種類也高度同源(J Bacteriol.(1996)，178(23)，6960-6967)。然而如實施例3中所示，單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9完全不與除了幽門螺桿菌以外的其他細菌菌株衍生的過氧化氫酶反應。
雖然也已知存在各種幽門螺桿菌突變株(Molecular Microbiology(1996)，20，833-842)，單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9令人驚奇的與所有幽門螺桿菌菌株反應良好，如實施例3所示。
根據本發明的單克隆抗體與各種幽門螺桿菌突變株反應良好的事實，被本發明的單克隆抗體識別的表位似乎是在突變株內的過氧化氫酶非常保守的位點。
在下文詳述中，本發明的單克隆抗體可以用於以糞便作為樣品來判斷幽門螺桿菌感染的存在與否，準確率非常高。
用單克隆抗體21G2、單克隆抗體41A5和單克隆抗體82B9對糞便樣品進行免疫測定。上述單克隆抗體都僅與感染有幽門螺桿菌的個體的糞便反應。因此，揭示了具有4個亞基的幽門螺桿菌過氧化氫酶存在於感染有幽門螺桿菌的個體糞便中。本領域尚未清楚存在於糞便中的幽門螺桿菌過氧化氫酶尚未解離成各個亞基，而維持4亞基狀態。根據蛋白質通常被消化道中的蛋白酶消化的事實來看，這是非常令人驚訝的。
通過固定化單克隆抗體21G2製備了層析柱，將患有幽門螺桿菌的人糞便作為樣品進行親和層析，並用洗脫組分進行ELISA和過氧化氫酶活性測定。過氧化氫酶活性與抗原性一致。
根據上文，揭示了被幽門螺桿菌感染的人糞便中含有具有4個亞基和有過氧化氫酶活性的天然過氧化氫酶。十分出乎意料的是幽門螺桿菌過氧化氫酶在消化道中不被消化，而是以具有活性的天然酶形式被排洩，因此出現在糞便中。
在日本公開出版物號平-09-322772和Infect.Immun.(1997)，65，4668-4674中，公開了單克隆抗體，它們與對應於通過SDS-PAGE變性和解離幽門螺桿菌過氧化氫酶獲得的各解旋亞基的蛋白質反應。然而，不清楚這些單克隆抗體是否與維持立體結構並具有活性的天然過氧化氫酶反應，或是否能檢測排洩物標本，如糞便中的幽門螺桿菌。
相反，本發明的單克隆抗體可以用消化道排洩物，如便於收集的糞便作為標本識別幽門螺桿菌感染的存在與否。
本發明的單克隆抗體的應用領域不受特別限制，但能用於免疫測定，用於判斷幽門螺桿菌感染。
本發明的免疫測定法用至少一種本發明的單克隆抗體進行，方法可僅用一種抗體進行。
通常作為用於免疫測定方法的單克隆抗體，考慮靈敏度高超的單克隆抗體作為優選抗體，因為與特異性低而背景噪聲高的多克隆抗體相比較，特異性高而背景噪聲低。
然而已知幽門螺桿菌存在各種突變體。因此已考慮用一種單克隆抗體檢測感染或存在非常困難。如日本公開出版物號平-10-10128所述，也有一種觀點認為可以與各種抗原反應的多克隆抗體更適合檢測具有各種抗原的細菌菌種的感染或存在。另外，已公開了(WO 00/26671)用多種多克隆抗體檢測幽門螺桿菌的方法。然而，還未開發出任何用一種多克隆抗體檢測幽門螺桿菌的方法。
相反，令人驚奇的是發現本發明的單克隆抗體能以非常高的準確率，用一種抗體檢測幽門螺桿菌。
WO 00/26671中所述的單克隆抗體識別尿素酶、熱休克蛋白、鹼性過氧化氫酶還原酶、20kDa蛋白(3-脫氫激酶2型)、16.9kDa蛋白(親核激活蛋白)和33.8kDa蛋白(果糖-二磷酸酶醛縮酶)作為抗原。完全未提到過氧化氫酶。WO 00/26671中所述的試驗方法在檢測靈敏度上不能令人滿意。
作為本發明的免疫測定法，提到例如酶免疫測定(EIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、螢光免疫測定(FIA)、蛋白質印跡、免疫層析等技術。上述各種免疫測定法可用於以競爭法或夾心法，用標記物標記的抗原或抗體測定靶抗原或抗體。
在上述各種免疫測定法中，ELISA和免疫層析技術是優選的。
上述競爭性方法基於例如測試標本中幽門螺桿菌過氧化氫酶和已知量的標記的幽門螺桿菌過氧化氫酶與本發明的單克隆抗體定量競爭性結合反應。在上述特別提到的競爭性方法中，在含有幽門螺桿菌過氧化氫酶的標本溶液中加入預定量的固定在載體上的抗體和預定量的用標記劑標記的幽門螺桿菌過氧化氫酶。然後，測定保留在載體上的標記劑活性或未保留在載體上的標記劑活性。對此，優選幾乎同時加入抗體和標記抗原。
上述夾心法包括例如將幽門螺桿菌過氧化氫酶夾在本發明固定的單克隆抗體和用標記劑標記的本發明的單克隆抗體之間，然後加入針對標記物(例如酶)的底物等，顯示顏色等，從而檢測了標本中的幽門螺桿菌過氧化氫酶。
對於上述標記劑，提到放射性同位素(下文縮寫成「RI」)，例如125I、酶、酶底物、磷光物質、螢光物質、生物素和著色物質。在將這些標記劑與抗原或抗體結合中，可使用馬來醯亞胺法[J.Biochem.(1976)，79，233]，活化生物素法[J.Am.Chem.Soc.(1978)，100，3585]或疏水鍵法。
對於上述提到的酶，提到例如過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對於用於該場合的底物，可選擇適合該場合所用的酶的底物，提到例如ABTS、魯米諾-H2O2、o-苯二胺-H2O2(針對過氧化物酶)、磷酸對硝基苯酯、磷酸甲基繖形酯、3-(2』-螺環金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷醯氧基)苯基-1，2-二氧雜環丁烷(針對鹼性磷酸酶)、對硝基苯基-β-D-半乳糖(針對β-半乳糖苷酶)。
可在4-40℃反應1分鐘-18小時，然後測定結果顯示的顏色或螢光、磷光或顯色量，進行上述試驗。另外，可使用所謂的速率試驗，它在4-40℃範圍內保溫進行。
用市售的Bolton-Hunter試劑可方便的進行對上述抗原或抗體的放射性標記。例如，可通過將Bolton-Hunter試劑加到溶液中(該溶劑是通過將抗原或抗體溶於0.1M碳酸氫鈉水溶液中製備的)，然後經過1-2小時，用G-25脫鹽柱等除去未反應的Bolton-Hunter試劑部分。
另外，可使用氯亞明T法、碘原法等，方便的進行125I放射性標記。
如上述磷光物質，可提到例如異魯米諾和吖啶酯，如上述螢光物質，可提到例如螢光素和羅丹明。就此，可方便的使用活化酯法或異氰酸酯法(「酶免疫測定技術」，Igaku Shoin1987年出版)進行標記。對於上述著色物質，可提到例如著色乳膠顆粒和膠體金。
為了用上述競爭性方法進行本發明的免疫測定法，在本發明的單克隆抗體通過已知方法物理或化學結合的固相中加入含有未知量的幽門螺桿菌過氧化氫酶標本，使反應進行。同時，加入用標記劑標記的預定量的幽門螺桿菌過氧化氫酶，使反應進行。
在用上述夾心法實施本發明的免疫測定法中，將本發明中的單克隆抗體通過已知方法物理或化學結合於固相上加入含有未知量的幽門螺桿菌過氧化氫酶的標本中，使反應進行。然後，加入用標記劑標記的本發明的單克隆抗體，使反應進行。
然後在兩種情況下，如需要充分洗滌固相，測量與標記試劑結合的活性。當上述標記劑是RI時，用孔計數器或液相閃爍計數器進行測定。當標記劑是酶時，加入底物，在染色後用比色和螢光測定酶活性。當標記劑是螢光物質、磷光物質或著色物質時，可分別通過本領域已知的方法進行測量。
本發明的免疫測定法使用本發明的單克隆抗體，因此具有傑出的特性，即可識別存在於幽門螺桿菌過氧化氫酶中的表位，而沒有由於交叉反應而錯誤檢測其他物質，因此可進行特異性非常高的測定。
為了實施本發明的免疫測定法，可使用本發明的診斷試劑盒。本發明的診斷試劑盒含有至少一種本發明的單克隆抗體，並可只含一種單克隆抗體。要用於本發明診斷試劑盒的本發明的單克隆抗體不受特別限制，但可以是任何識別幽門螺桿菌過氧化氫酶的單克隆抗體，還可以是本發明的單克隆抗體的分解產物，如F(ab』)2、Fab』、Fab等。
本發明的診斷試劑盒可用免疫學方法檢測幽門螺桿菌細胞或幽門螺桿菌過氧化氫酶，因此可以判斷幽門螺桿菌的感染。
在本發明的診斷試劑盒中，本發明的單克隆抗體可預先固定在固相上，本發明的單克隆抗體還可以用上述標記劑標記。
用於本發明的診斷試劑盒的固相不受特別限制，但包括例如聚合物，如聚苯乙烯、玻璃珠、磁性顆粒、微量滴定板、免疫層析用濾紙、玻璃濾器或其他不溶性載體。
本發明的診斷試劑盒還可含有其他組件。
上述其他組件不受特別限制，但包括例如標記用的酶、其底物、放射性同位素、磷光物質、螢光物質、著色物質、緩衝液和培養皿，以及上述提到的成分。
雖然本發明的診斷試劑盒的形式不受特別限制，但含有本發明的診斷試劑盒所有組分的整合形診斷試劑盒是優選的，以快速、簡單和方便的進行診斷。
上述整合型診斷試劑盒不受特別限制，但可以是盒型、芯型等。
作為上述盒型的實施例，可提到例如一種具體實施方式
，包括使用免疫層析技術，一種反應盒、其中所含的膜、本發明的單克隆抗體一端固定在所述膜上(下遊側)，固定在對側端(上遊側)的膜上的顯色溶液，含有針對上述標記劑並安排在顯色溶液附近，在其下遊側的底物的襯墊，和含有用上述標記劑標記的單克隆抗體，安置在膜中間的襯墊上。
在使用上文舉例所述的具有盒型實施方式的診斷試劑盒中，將標本塗在含有用上述標記物標記的本發明的單克隆抗體的襯墊上，然後使標本中所含的幽門螺桿菌過氧化氫酶和本發明的用標記劑標記的單克隆抗體進行結合產物，通過轉移在本發明單克隆抗體固定的位置形成的結合產物，使上文提到的顯色溶液顯色，在該位置固定有本發明的單克隆抗體，形成幽門螺桿菌過氧化氫酶、用標記劑標記的單克隆抗體和固定化的單克隆抗體形成複合物。然後，上述標記試劑與上述底物反應以顯示顏色等。測定顯示的顏色等，從而進行幽門螺桿菌感染的判斷。
對於用足量顯色溶液稀釋標本，並將得到的溶液滴到膜上的實施例而言，不需要預先將顯色溶劑置於膜上。當用著色乳膠顆粒等著色物質作為上述標記物時，不需要底物，可根據著色物質的顯色來判斷本發明的單克隆抗體固定的位點是否形成上述複合物。
例如，對於用上述競爭性方法進行反應的上述芯型實施方式，可以提到具有多個孔的芯等，它們是整體形成的，包括(a)含有本發明單克隆抗體的孔，(b)含有液體試劑的孔(如緩衝溶液)，該液體試劑中含有上述標記試劑標記的幽門螺桿菌，和(c)含有液體試劑(如緩衝溶液)的孔，該液體試劑含有針對上述標記試劑的底物，為了用夾心法實施反應，提到一種芯等，具有多個整體形成的孔，包括(a)含有不溶性載體的孔，在載體上固定有本發明的單克隆抗體，(b)含有液體試劑(如緩衝溶液)的孔，該試劑含有用上述標記試劑標記的單克隆抗體，和(c)含有液體試劑(如緩衝液)的孔，含有針對上述標記劑的底物。
在使用例如上述本發明的芯型診斷試劑盒中，反應和試驗通常與進行競爭法或夾心法使用的相同方式進行。
本發明的診斷試劑盒可以是用於實施上述競爭性方法或上述夾心法的試劑盒。然而優選的是使用夾心法的試劑盒。上述夾心法具有優點，即靈敏度高，需要的反應時間短，準確率高。用上述免疫層析技術，可以製備一種試劑盒，它使得測試方法方便而簡單，而且用它可以簡單的通過肉眼觀察判斷結果。當以ELISA技術使用上述夾心法時，酶反應產物的形成由試驗目標物質的量決定，因此可建立一種系統，可方便的通過顯色等，以肉眼觀察確定幽門螺桿菌感染陽性。
本發明診斷試劑盒所用的標本不受特別限制，但包括例如胃內容物、胃洗液和消化道排洩物。然而消化道排洩物如糞便是優選的，因為它們可以方便的收集，而不對個體帶來任何負擔。
本發明的診斷試劑盒可以在細菌根除治療前用於檢測感染的存在與否，和/或在細菌根除治療後判斷成功或失敗。
因為本發明的診斷試劑盒使用單克隆抗體，具有高水平的檢測靈敏度，不產生假陰性或假陽性問題，在批與批之間沒有任何差異。
根據本發明，用單克隆抗體識別幽門螺桿菌過氧化氫酶作為抗原，可消除存在於樣品中的其它物質的影響，從而可以非常高的靈敏度和特異性檢測幽門螺桿菌的存在。由於已建立了產生針對幽門螺桿菌的單克隆抗體的雜交瘤，現在可以幾乎半永久性的產生同一單克隆抗體。使用本發明的單克隆抗體的診斷試劑盒可用消化道分泌物作為標本，因此可簡單方便有效的檢測幽門螺桿菌感染，而不對病人造成任何痛苦。另外，在僅使用一種單克隆抗體的情況下，使用本發明的單克隆抗體的診斷試劑盒可穩定的獲得非常高的準確率，而在批與批之間沒有任何差異，因此可以總是特異性的和高度準確的檢測幽門螺桿菌感染。上述診斷試劑盒易於進行測定，對於醫藥護理的部門是非常有用的。
實施本發明的最佳模式下列實施例和測試實施例更詳細的說明的本發明。然而它們不是為了限制本實施例1[單克隆抗體製備](1)幽門螺桿菌球菌型細胞懸液的製備(免疫原)在補充有5％去纖維蛋白馬血的腦心滴注瓊脂培養基(Difco的產品)上分步劃線培養幽門螺桿菌(ATCC 43504)。平板在微氧環境中37℃培養3-4天，然後在無氧環境下37℃培養7天，導致細胞變成球形。用白金環等刮下各菌落，懸浮在磷酸緩衝的生理鹽水(PBS)中。10,000xg4℃離心10分鐘，收集幽門螺桿菌，懸浮在0.5％甲醛中，使懸液在4℃保持4天滅活。然後，用懸浮在PBS中，然後在10,000xg4℃離心10分鐘，然後懸浮在PBS中的方法重複三次，洗滌細胞。
(2)幽門螺桿菌球形細胞破碎產物的製備(免疫原)用超聲破碎器(Seiko Denshi Kogyo，7250型)在3.50％工作循環強度下超聲10分鐘，打碎(1)中獲得的細胞。
(3)免疫和細胞融合如(1)或(2)製備的等量免疫原(幽門螺桿菌球形細胞懸液或幽門螺桿菌細胞的破碎產物)與弗氏完全佐劑混合，得到油狀乳液。將該乳液以0.2毫升的劑量皮下施給BALB/cA小鼠(CLEA Japan的產品，6周齡雄性)的背部位點。第一次免疫7天或14天後增強免疫，然後在細胞融合前3天，腹膜內施用0.2毫升上述免疫原。最後一次增強3天後，從各小鼠上切下脾臟細胞，與骨髓瘤細胞(P3x63.Ag8.653株，RCB 0146，Riken Gene Bank)以10∶1混合，用50％聚乙二醇4000融合。在HAT培養基(Gibco的產品)上選擇性培養雜交瘤。
(4)雜交瘤選擇在融合後第12天，用ELISA法測定各培養上清液中的抗體活性。各取200微升的融合細胞的培養上清液加到96孔ELISA板(Coaster的產品)的孔中，其中每孔固定有10微克/毫升的免疫原的孔中，反應在37℃進行1小時，然後用含0.05％Tween 20的PBS(洗液)洗滌，在各孔中加入200微升過氧化物酶標記的抗-小鼠IgG(Cappel產品，1∶20,000)。反應在37℃進行1小時後，用上述洗液洗滌板。然後在各孔中加入200微升底物溶液(0.1M o-苯二胺和0.012％過氧化氫水溶液)，使反應在室溫下進行15分鐘。然後，在各孔中加入50微升3.5N硫酸終止酶反應，測量492納米的吸光度。選擇產生與上述免疫原反應的抗體，並收穫吸光度不低於0.15的雜交瘤克隆。用限制稀釋法對各克隆進行兩次克隆。克隆後的雜交瘤移植到BALB/cA小鼠中，結果發現32個雜交瘤克隆產生各種可作為腹水回收的單克隆抗體。
實施例2[用夾心ELISA選擇特異性識別消化道排洩物中的幽門螺桿菌的單克隆抗體](1)單克隆抗體固定化的平板的製備用PBS兩倍稀釋32個克隆的腹水，每份各1毫升，滴加2毫升飽和硫酸銨，使混合物在4℃放置4小時。然後3000rpm離心混合物20分鐘，將沉澱懸浮在2毫升PBS中並透析。將這些單克隆抗體以下列方法固定在96孔ELISA平板中。也就是將各單克隆抗體稀釋到5微克/毫升，在96-孔板的各孔中加入0.2毫升稀釋物。4℃放置過夜後，用PBS洗滌平板，然後在各孔中加入0.25毫升1％脫脂牛奶-PBS，使平板在4℃放置1小時，用於封閉。然後，用上述洗液洗滌平板。
(2)生物素標記的單克隆抗體的製備將(1)中製備的32個克隆的單克隆抗體的各3毫克部分與10毫克N-羥基琥珀醯亞胺生物素酯(Zymed的產品)混合，反應在0.1M碳酸氫鈉(pH8)中進行，室溫攪拌3小時。反應混合物對5升PBS4℃透析過夜，得到生物素標記的單克隆抗體。
(3)特異性識別消化道分泌物中的幽門螺桿菌的單克隆抗體選擇將用尿素呼氣測試判斷幽門螺桿菌陽性和幽門螺桿菌陰性的人各250毫克糞便懸浮在0.5毫升0.1％脫脂牛奶-PBS中，各混合物3,000rpm離心10分鐘，然後用如此分離的上清液作為糞便抽提物。在如(1)所述製備的，固定有單克隆抗體的板的各孔中加入各0.2毫升的糞便抽提物。37℃放置1小時後，用5份上述洗液洗滌平板，加入(2)中製備的各0.2毫升生物素標記的單克隆抗體。37℃放置1小時後，用上述洗液洗滌平板，加入0.2毫升過氧化物酶標記的鏈黴親和素(Zymed的產品)。37℃放置1小時後，用上述洗液洗滌平板，在各孔中加入0.2毫升底物溶液(0.1M o-苯二胺和0.012％過氧化氫水溶液)，反應在室溫下進行10分鐘。然後，加入50微升3.5N硫酸終止酶反應，測量492納米的吸光度。如表1所示，發現單獨或組合使用三種單克隆抗體21G2、41A5和82B9的夾心ELISA顯示針對感染後幽門螺桿菌的病人的糞便標本具有高度反應性。
表1


產生各單克隆抗體的雜交瘤已被保藏在工業科學技術局，國立生命科學和人體技術研究所(1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，名稱為雜交瘤21G2(FERM BP-7336)、雜交瘤41A5(FERM BP-7337)和雜交瘤82B9(FERMBP-7338)。用免疫球蛋白配型試劑盒小鼠(Wako Pure Chemical Industries)檢查各單克隆抗體的免疫球蛋白，結果發現所有三種克隆屬於具有κ型L鏈的IgG1。
實施例3[菌株間反應性比較和與其它種類細菌的反應性](1)幽門螺桿菌細胞懸液的製備在補充有5％去纖維蛋白馬血的腦心滴注瓊脂培養基上分步劃線培養各種幽門螺桿菌菌株(ATCC 43504；Tokai大學醫院臨床分離物號130和112；Hyogo醫學院臨床分離物號526、4484、5017、5025、5049、5142、5287、5308、5314和5330)。平板在微氧環境中37℃培養3-4天，得到螺旋形細胞菌落，或在無氧環境下37℃培養7天，導致細胞變成球形。用白金環等刮下各菌落，懸浮在PBS中。10,000xg4℃離心10分鐘，收集細胞，懸浮在0.5％甲醛中，使懸液在4℃保持4天滅活。然後，用懸浮在PBS中，然後在10,000xg4℃離心10分鐘，然後懸浮在PBS中的方法重複三次，洗滌細胞。如此獲得了幽門螺桿菌螺旋細胞懸液和球菌細胞懸液。
(2)人腸桿菌和空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)細胞懸液的製備用下文提到的方法培養可從人糞便中獲得的典型菌株，即兩種腸桿菌普通擬桿菌(Bacteroide vulgatus)和大腸桿菌，以及螺旋細菌空腸彎曲桿菌從獲得的菌落中(1)中所述的相同方法製備各細胞懸液。因此，在補充有5％去纖維蛋白馬血的BL瓊脂培養基(Nissui Pharmaceutical的產品)37℃需氧培養普通擬桿菌(IFO14291)2天。大腸桿菌(ATCC25922)在腦心滴注瓊脂培養基上37℃培養1天。空腸彎曲桿菌(80068，Tokai大學醫院臨床分離物)在補充有5％去纖維蛋白馬血的腦心滴注瓊脂培養基上37℃培養2天。
(3)其它螺桿菌細胞懸液的製備貓螺桿菌(Heliobater felis)(ATCC 49179)和肝螺桿菌(Heliobaterhepaticus)(ATCC 51448)在補充有5％去纖維蛋白馬血的腦心滴注瓊脂培養基上用(1)中的相同方法培養，並且以(1)中的相同方法從如此獲得的螺旋細胞菌落獲得了螺旋形細胞的懸液。
(4)細胞破碎產物的製備用超聲粉碎機(Seiko Denshi Kogyo，7250型)在3.50％工作循環強度下超聲打碎細胞。
(5)夾心ELISA用實施例2(3)(單克隆抗體41A5固定化平板生物素標記的單克隆抗體82B9、單克隆抗體21G2固定化平板生物素標記的單克隆抗體41A5，單克隆抗體21G2-固定化平板生物素標記的單克隆抗體82B9、單克隆抗體21G2-固定化平板生物素標記的單克隆抗體21G2和Meridian’s產品HpSA)對(4)獲得的各細胞破碎產物(0.2毫升；蛋白濃度10微克/毫升)。結果如表2所示。
表2

如表2所示，發現單克隆抗體21G2、41A5和82B9顯示針對各種幽門螺桿菌的螺旋細胞和球形細胞的高度反應性。另一方面，它們完全不和普通擬桿菌。大腸桿菌、貓螺桿菌或肝螺桿菌反應。相反，Meridian的HpSA還顯示針對貓螺桿菌和肝螺桿菌的反應性。
實施例4[用夾心ELISA在糞便標本中檢測幽門螺桿菌(1)]分別將用尿素呼氣測試判斷為幽門螺桿菌陽性的三個人和判斷為陰性的三個人的糞便標本(各250毫克)懸浮在0.5毫升0.1％脫脂牛奶-PBS中，用實施例2(3)的相同方法測試各標本。還用相同的糞便標本用Meridian的HpSA根據標出的方法進行測試，測量450納米處的吸光度。表3顯示了尿素呼氣測試的各吸光度值。
表3

發現尿素呼氣測試結果陽性的個人(4、5、6號)提供的糞便標本與陰性標本(1、2、3號)比較，吸光度明顯高。
實施例5[用夾心ELISA法在糞便標本中檢測幽門螺桿菌(2)]將從移植了雜交瘤21G2的BALB/cA小鼠收集的腹水(5毫升)2倍稀釋於PBS，滴加10毫升飽和硫酸銨，使混合物4℃放置4小時。然後3,000rpm離心混合物20分鐘，將沉澱溶於10毫升PBS，用PBS透析溶液。
(2)單克隆抗體固定化平板製備將(1)中製備的單克隆抗體21G2溶液以下面的方法固定在96-孔ELISA板上。將抗體用PBS稀釋到濃度為5微克/毫升，將稀釋液以每份0.2毫升加到96-孔ELISA平板的孔中，然後4℃放置過夜，用PBS洗滌板。
(3)過氧化物酶標記的單克隆抗體的製備用馬來醯亞胺法(Eiji Ishikawa「生物化學實驗」，卷27，Enzyme labelingtechnologies，1991年Gakkai Shuppan Center出版)製備了過氧化物酶標記的單克隆抗體。將(1)中製備的單克隆抗體(5毫克)與0.6毫克S-乙醯巰基琥珀酸酐(Aldrich的產品)混合，使反應在0.5毫升0.1M的磷酸緩衝液(pH6.5)中30℃反應30分鐘。在反應混合物中加入20微升0.1M EDTA、0.1毫升Tris鹽酸緩衝液(pH7.0)和0.1毫升1M羥胺(pH7.0)，使混合物在30℃放置5分鐘，然後10,000rpm離心5分鐘得到上清液。用Centricon30(Amicon的產品)進行超濾，除去試劑，用1毫升5mM EDTA-0.1M磷酸緩衝液(pH6.5)置換溶劑，然後得到引入硫醇基團的單克隆抗體。
將過氧化物酶(5毫克，辣根，Toyobo的產物)與1毫升4-(N-馬來醯亞氨甲基)環己烷-1-羧酸N-琥珀醯亞胺(ICN Biochemicals的產品)混合，然後反應在0.5毫升0.1M的磷酸緩衝液(pH7.0)中30℃進行1小時。10,000rpm離心反應混合物5分鐘，得到上清液。用Centricon 30超濾得到上清液，除去試劑，然後用1毫升0.1M的磷酸緩衝液(pH7.0)對上清液超濾，獲得了引入馬來醯亞胺基團的過氧化物酶。
將上述引入硫醇基團的單克隆抗體和引入馬來醯亞胺基團的過氧化物酶以摩爾比1∶5混合，使反應在室溫進行30分鐘。使反應混合物經過凝膠過濾柱(Sephacryl-S 300 HR柱；直徑26×長度870毫米，0.1M磷酸緩衝液(pH6.5))，收集了含有過氧化物酶標記的單克隆抗體的組分。
(4)用夾心ELISA法在糞便標本中檢測幽門螺桿菌將用尿素呼氣測試判斷為陽性的10個病人和判斷為陰性的10個病人的糞便標本(各250毫克)懸浮在0.5毫升0.1％脫脂牛奶-PBS中，各混合物在3,000rpm離心10分鐘，用如此獲得的上清液作為糞便抽提物。將(3)中製備的各50微升糞便抽提物和50微升過氧化物酶-標記的單克隆抗體加到上述單克隆抗體固定的平板各孔中。25℃放置1小時後，用5份洗液(0.05％Tween 20-PBS)洗滌板，在各孔中加入0.1毫升底物底物溶液(四甲基二氨基聯苯+過氧化氫，BioFX的產品)，使反應在室溫下進行10分鐘。然後，在各孔中加入500微升1N硫酸終止反應，測量吸光度(450納米-630納米)。用HpSA測試同一糞便標本，測量吸光度(450納米-630納米)。結果如表4所示。
表4

*1+陽性(＞5每mil)、-陰性*2+陽性(＞0.1)、-陰性*3+陽性(＞0.1)、-陰性如表4所示，用單克隆抗體21G2的夾心ELISA法顯示被幽門螺桿菌感染的人的糞便標本與尿素呼氣測試的結果確實相符。另一方面，HpSA有兩個標本(標本號16和19)不符合(假陽性)。
實施例6[用免疫色譜圖檢測糞便標本中的幽門螺桿菌](1)抗體-固定的載體製備為了製備用抗-幽門螺桿菌單克隆抗體和家兔IgG抗體依次固定在其上的抗體固定的載體上，將硝基纖維素片(Whatman的產品)切成5毫米×20毫米，用BiojetQ3000(Biodot的產品)將單克隆抗體21G2溶液點在離底邊10毫米處的位置，將山羊抗兔IgG單克隆抗體(Cappel的產品)塗在離底邊15毫米處。室溫乾燥2小時後，各片用1％脫脂牛奶(Difco的產品)-0.1％Tween-PBS浸潤10分鐘封閉各片，然後充分乾燥。
(2)著色乳膠顆粒-標記的產品的製備a.紅色乳膠顆粒標記的抗幽門螺桿菌抗體在300微升紅色乳膠顆粒分散體(PL-Latex，10％，450納米，PolymerLaboratories)加入PBS(1.2毫升)，混合物13,000rpm離心5分鐘。在沉澱中加入1毫升單克隆抗體21G2(5毫克/毫升)溶液，充分混合後，反應在室溫下進行1小時。為了除去未反應的單克隆抗體部分，13,000rpm離心5分鐘，將沉澱懸浮在1.5毫升PBS中，上清液再次離心。加入1毫升脫脂牛奶封閉，反應在室溫下進行1小時。然後，離心在13,000rpm進行5分鐘，將沉澱懸浮在含有1％脫脂牛奶-0.01％疊氮化鈉的1.5毫升PBS中。
b.藍色乳膠顆粒-標記的家兔IgG用藍色乳膠顆粒分散體(PL-Latex，10％，450納米，Polymer Laboratories的產品)和家兔IgG(0.5毫克/毫升，Cappel的產品)根據上述的相同步驟製備。
c.著色顆粒標記的產物混合等量的上述兩種著色的乳膠顆粒-標記的抗體，用10微升混合物浸潤5毫米×5毫米的Bemliese(註冊商標)片，然後風乾。
(3)免疫層析測試片的製備將著色乳膠顆粒標記的產物點在抗體固定的載體上，離底邊2.5毫米的位置。另外，將為了浸潤測試溶液的載體再放在著色乳膠-標記的產物上，離底邊2,5毫米的位置。將吸收水的載體(3M Chr，Whatman的產品)放在抗體-固定的載體上，從上離底邊2毫米，最後，覆蓋一層透明粘膠帶固定所有成員，得到免疫層析圖的測試片。
(4)糞便標本中幽門螺桿菌的檢測用6個病人(3個陽性，3個陰性)的糞便如實施例4所述進行測試。取各糞便標本的0.1克份，懸浮在1毫升0.1％BSA-0.05％Tween 20-PBS。3,000rpm離心1分鐘除去雜質，在(3)中製備的免疫層析測試片上的一個位點滴加50微升上清液，以浸潤測試溶液。10分鐘後，判斷是否在抗-幽門螺桿菌單克隆抗體的固定位點出現紅線。結果對於每一個陰性標本應該觀察不到紅線，而對於所有陽性病人可肯定紅線。對於所有的標本都確定的藍線。測試因此是成功的。
實施例7[用乳膠凝集法檢測糞便標本中的幽門螺桿菌](1)乳膠顆粒標記的抗幽門螺桿菌抗體的製備在0.1毫升白色乳膠顆粒分散體(PL-Latex，10％，440納米，PolymerLaboratories)中加入PBS(0.4毫升)，13,000rpm離心混合物5分鐘。在沉澱中加入0.5毫升PBS和0.5毫升單克隆抗體21G2溶液(1毫克/毫升)，充分混合後，使反應在室溫下進行過夜。為了除去單克隆抗體的未反應部分，13,000rpm離心10分鐘，將沉澱懸浮在1毫升PBS中，再次離心懸浮液。加入1毫升1％脫脂牛奶進行封閉，反應在室溫下進行1小時。然後，在13,000rpm下離心5分鐘，將沉澱懸浮在1毫升含有1％脫脂牛奶-0.01％疊氮化鈉的PBS中。
(2)糞便標本中幽門螺桿菌的檢測用實施例4中所述的6個病人(3個陽性和3個陰性)的糞便進行測試。各取0.1克份的糞便標本，懸浮在含有0.1％BSA-0.05％Tween 20的1毫升PBS中。3,000rpm離心1分鐘除去雜質，獲得上清液。將50微升份的該糞便懸液的上清液和50微升(1)中製備的乳膠顆粒標記的抗-幽門螺桿菌滴加到乳膠聚集板上，用玻片轉子混合(Eiken Chemical的產品)。5分鐘後，肉眼觀察判斷聚集的出現與否。結果，在任何陰性標本中未觀察到聚集，而在所有陽性標本中確定聚集。
實施例8[用凝膠過濾確定糞便中抗原的分子量]將20克幽門螺桿菌陽性人群(表3中的4號和5號)的糞便標本懸浮在100毫升冰凍PBS中。10,000xg離心10分鐘，丟棄沉澱，再次90,000xg離心30分鐘，得到上清液。將1.5毫升該上清液加到裝填有Sephacryl-S300HR(Pharmacia的產品)(1.5×140釐米，0.1M磷酸緩衝液，pH6.5)的凝膠過濾柱上，收集1.5毫升組分。所用的分子量標記是甲狀腺球蛋白、鐵蛋白、過氧化氫酶、牛血清白蛋白和細胞色素c。用實施例2(3)中提到的夾心ELISA法檢測各抗原組分(單克隆抗體41A5固定的平板，生物素標記的單克隆抗體82B9、和單克隆抗體21G2固定的平板與生物素標記的單克隆抗體41A5)。結果發現糞便中幽門螺桿菌特異性抗原具有270kDa的分子量。
實施例9[抗原鑑定](1)抗原純化將單克隆抗體82B9根據Amersham Pharmacia Biotech的親和層析手冊固定在CNBr-活化的Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)上，製備柱(10毫升)。超聲破碎幽門螺桿菌(ATCC43504)細胞，進行超聲，將獲得的5毫升上清液加到柱上。室溫放置2小時後，用120毫升PBS洗滌柱(流速約2毫升/分鐘)，用130毫升0.2M甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫。分別收集洗滌物和洗脫液作為10組分，測量各組分的吸光度和抗原性。用實施例2所述的夾心ELISA(固定的21G2和作為標記的82B9)測定抗原性。如圖1所示，確定了各洗脫組分(組分號14-17)中的抗原性。
(2)純化的抗原的純度和分子量將洗脫組分(14號，50微升)與等量的樣品緩衝液(2％SDS-5％巰基乙醇)混合，100℃煮沸混合物5分鐘。對20微升份的該溶液進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(4-20％丙烯醯胺凝膠)。所用的分子量標記是磷酸化酶b、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、羧酸脫氫酶、大豆胰蛋白酶抑制蛋白和α-乳白蛋白。電泳後，用KANTOII(Kanto Chemical)銀染料染色凝膠。結果，純化的抗原得到單一條帶，其分子量是59kDa。另外，1毫升洗脫組分(14號)在Sephacryl-S300HR上用實施例6所述的相同方法進行凝膠過濾。用夾心ELISA測試獲得的組分的抗原性，結果，發現該純化抗原具有270kDa的分子量，與糞便中發現的抗原相同。
(3)純化抗原的胺基酸-末端序列測定用300微升洗脫組分(14號)，用HP G1005A蛋白測序系統(Hewlett-Packard的產品)測定純化蛋白的氨基末端胺基酸序列。發現胺基酸末端的8個殘基序列是Met-Val-Asn-Lys-Asp-Val-Lys-Gln。該序列與幽門螺桿菌過氧化氫酶的氨基末端序列完全一致(J.Bacteriol.(1996)，178，6060-6976)。
(4)純化抗原的過氧化氫酶活性和紫外可見的吸收光譜測定由於純化抗原的氨基末端胺基酸序列與過氧化氫酶的完全相同，測試了各組分的過氧化氫酶活性。所用的反應溶液是含11mM過氧化氫的PBS。用PBS稀釋各組分100倍，將50微升稀釋物加到2毫升反應溶液中，開始反應。反應在室溫下進行。每隔一段時間測量240納米處的吸光度，確定每分鐘吸光度的下降。用PBS作為空白。結果，在抗原組分中檢查到過氧化物酶活性，如圖1所示。
為了鑑定過氧化氫酶所含的，測量了14號洗脫組分的紫外可見光譜。結果，在407和277納米處觀察到吸收最大值。這些值和幽門螺桿菌過氧化氫酶的文獻值非常相似(405納米和280納米，J.Gen.Microbiol.(1991)137，57-61)。
(5)純化抗原的保存穩定性用含0.1％BSA的PBS將洗脫組分(14號)稀釋到1.4微升/毫升，將溶液保存在25℃一周。保存後，用實施例5所述的夾心ELISA測定純化的抗原的抗原性，並用(4)所述的方法測定過氧化氫酶活性。當與冰凍儲藏在-80℃的純化抗原比較時，25℃儲藏後抗原性沒有變化。然而，過氧化氫酶活性顯示顯著下降，剩餘的活性不大於5％。
實施例10[糞便中的抗原亞基與抗-幽門螺桿菌單克隆抗體的反應性]為了估計抗幽門螺桿菌單克隆抗體與糞便中抗原亞基的反應性，將實施例8中描述的各幽門螺桿菌陽性病人的糞便懸液的50微升上清液如實施例9(2)所述進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。作為對照，用相同的方法還電泳了50微升實施例9的純化抗原(洗脫組分號14)。電泳後，用蛋白質印跡技術將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜浸潤在1％脫脂牛奶中1小時，以封閉，然後與單克隆抗體21G2或82B9反應1小時。用5份0.05％Tween 20-PBS洗滌硝酸纖維素膜，然後與過氧化物酶標記的抗小鼠IgG抗體反應。用5份0.05％的20-PBS洗滌硝酸纖維素膜，然後加入底物溶液(過氧化物+3，3』-二氨基聯苯胺)，保溫10分鐘。從糞便抗原和純化的抗原遷移得到的各泳道用任何單克隆抗體沒有顯示任何由於抗原性的顯色反應。為了確定不能檢測亞基分子抗原性的原因，用斑點印跡技術測定是否分離成亞基的處理導致抗原性的改變。因此，將用1％SDS分離處理前後的5微升份標本滴入硝酸纖維素膜。風乾後，測定硝酸纖維素膜上蛋白質吸附的蛋白質。結果，發現糞便抗原和純化的抗原在1％SDS分解處理後抗原性顯著下降。因此提出本發明的單克隆抗體不能識別過氧化氫酶的亞基，即初級結構表位，但識別更天然的高級結構作為表位。
實施例11[糞便中抗原的純化](1)糞便中抗原的分子量將具有最高幽門螺桿菌抗原水平的陽性個體(表4中的標本號8)提供的糞便(165克)懸浮在PBS(糞便重量的4倍)中，離心懸液(7,000xg，30分鐘)得到上清液，再次超離心(30,000rpm，30分鐘)得到上清液。在680毫升上清液中加入硫酸銨(165克)，達40％飽和度，攪拌混合物，用離心除去得到的沉澱(7,000rpm，30分鐘)。在750毫升上清液中加入硫酸銨(214克)達80％飽和度，攪拌混合物，離心收集得到的沉澱(7,000rpm，30分鐘)。將沉澱懸浮在PBS中，針對10升蒸餾水透析。在Sephacryl-S300HR柱上以實施例6的相同方法對2毫升份的透析液(82毫升)進行凝膠過濾。用夾心ELISA，以實施例5的相同方法檢測獲得組分的抗原性。發現糞便抗原的分子量是270kDa，與實施例8的兩個陽性病人的糞便抗原和實施例9所述的純化的抗原的分子量相同。
(2)糞便中抗原的純化將40毫升(1)中所述的透析液用10mM磷酸緩衝液(pH7.0)稀釋到100毫升，將稀釋液加到裝填了陽離子交換樹脂CM-Sephadex C-50(Amersham PharmaciaBiotech)的柱(1×2.5釐米)上，用同一緩衝液平衡。用10毫升相同的緩衝液洗滌後，用10毫升PBS進行洗脫。用含有0.1％脫脂牛奶的PBS各稀釋流出、洗滌和洗脫組分320倍，然後用實施例5所述的夾心ELISA測定抗原性。在洗脫組分中發現抗原性。
將單克隆抗體21G2根據Amersham Pharmacia Biotech的親和層析手冊所述的方法固定在CNBr-活化的Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)上，製備柱(2×3釐米)。室溫放置2小時後，用50毫升PBS洗滌柱，然後用0.2M甘氨酸HCl緩衝液(pH3.0)洗脫，收集10毫升組分。分別用含有0.1％脫脂牛奶的PBS稀釋各組分10倍，用實施例5所述的夾心ELISA測定稀釋液的抗原性。用實施例9所述的方法測定過氧化氫酶活性。結果，如圖2所示，觀察到開始洗脫後(用箭頭表示)立即收集的洗脫組分(組分號7和8)中的抗原性。發現過氧化氫酶活性與抗原性一致。根據上文，該發現該糞便標本可用於獲得具有4個亞基的天然抗原和4個亞基。
工業應用性具有上面的總結的發明可提供能識別特異性存在於幽門螺桿菌過氧化氫酶中的表位的單克隆抗體。另外，通過使用本發明的單克隆抗體，可以非常專一的識別幽門螺桿菌。已成功的建立了產生識別幽門螺桿菌過氧化氫酶的雜交瘤系，因此可以半永久的產生相同的單克隆抗體。使用本發明的單克隆抗體的診斷試劑盒可用消化道排洩物作為標本，能簡單有效的檢測幽門螺桿菌感染，而不對病人造成痛苦。甚至當僅使用一種單克隆抗體時，本發明的診斷試劑盒也顯示非常好的精確性，沒有顯示出批與批之間的差異，是穩定的，而且總是能專一而非常準確的檢測幽門螺桿菌感染。
權利要求
1.一種單克隆抗體，其特徵在於，該單克隆抗體識別幽門螺桿菌過氧化氫酶作為抗原。
2.一種雜交瘤，其特徵在於，該雜交瘤產生識別幽門螺桿菌過氧化氫酶作為抗原的單克隆抗體。
3.如權利要2所述的雜交瘤，其特徵在於，該雜交瘤是21G2FERM BP-7336、41A5FERM BP-7337或82B9FERM BP-7338。
4.一種權利要求2或3所述的雜交瘤產生的單克隆抗體。
5.一種免疫測定法，其特徵在於，該方法是用至少一種權利要求1或4所述的單克隆抗體進行的。
6.如權利要求5所述的免疫測定法，其特徵在於，該方法是用權利要求1或4所述的任何一種單克隆抗體進行的。
7.如權利要求5或6所述的免疫測定法，其特徵在於，用該免疫測定法判斷幽門螺桿菌的感染。
8.如權利要求5-7任一所述的免疫測定法，其特徵在於，標本是消化道排洩物。
9.如權利要求5-8任一所述的免疫測定法，其特徵在於，所述測定法用ELISA技術進行。
10.如權利要求5-8任一所述的免疫測定法，其特徵在於，所述測定法用免疫層析技術進行。
11.一種試劑盒，其特徵在於，該試劑盒含有至少一種權利要求1-4所述的單克隆抗體。
12.如權利要求11所述的診斷試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒含有權利要求1-4所述的任何一種單克隆抗體。
13.如權利要求11或12所述的診斷試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒用於判斷幽門螺桿菌感染。
14.如權利要求11-13任一所述的診斷試劑盒，其特徵在於，所述標本是消化道排洩物。
15.如權利要求11-14任一所述的診斷試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒採用ELISA技術。
16.如權利要求11-14任一所述的診斷試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒採用免疫層析技術。
全文摘要
本發明提供了一種診斷方法,通過它可經濟的診斷幽門螺桿菌感染,而不對病人造成任何痛苦和藉助任何特殊裝置。由於在該方法中使用了一種抗體,可實現高度特異性,而不顯示任何交叉反應性在批與批之間產生的差異,從而便於質量控制。而且可在使用簡單的單克隆抗體的情況下也可實現高靈敏度。本發明還提供了一種以幽門螺桿菌過氧化氫酶為抗原的單克隆抗體。
文檔編號G01N33/569GK1384886SQ00815122
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月27日 優先權日1999年10月29日
發明者若杉昌彥, 持田立子, 平田晴久 申請人:若素製藥株式會社