生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法及標準指紋圖譜的製作方法
2023-12-02 01:57:01
專利名稱：生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法及標準指紋圖譜的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製品的質量控制方法，具體涉及生物纖維蛋白膠高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的構建方法和得到的標準指紋圖譜。
背景技術：
現代外科手術中，創口止血和癒合是一個需要能有效解決的問題，傳統的方法一般使用結紮、縫合和電凝進行止血。傳統縫合易導致針眼感染和滲漏，脆性較大的組織撕拉極易造成組織破壞；電凝會增加組織破壞，造成組織壞死。因此，長期以來科學家們致力於尋找一種既能快速有效止血，又能促進組織癒合的新型止血材料。纖維蛋白封閉劑(FS)應運而生，它的出現正好滿足了這種外科手術的需求。
纖維蛋白封閉劑是一種從血液中提取的新型生物止血材料。其作用機制是模擬了人體自身凝血反應最後階段，由纖維蛋白單體聚合形成具有三維立體網狀結構的膜，能夠有效的網絡住紅細胞和創面滲液，起到止血防滲、促進癒合的作用。並且因為是生物材料製品，具有良好的組織相容性，安全無毒副作用；在人體自身酶作用下，術後兩周可自動降解吸收，大大縮短了住院時間，減輕病患痛苦。
目前，國外同類產品以人血為原料，本申請人首創開發出以豬血為原料的產品，避免了人血製品所帶來的愛滋病、肝炎等血液傳染病傳播的危險。同時豬血資源豐富，豬的基因序列同人的基因序列極為相似，而攜帶人類的傳染性疾病傳播風險極小，極大的降低了成本，使產品具有很強的市場競爭力。但生物纖維蛋白膠為蛋白質、多肽及無機鹽組成，而該類產品目前質量控制在蛋白含量及純度等技術指標方面水平較低，產品的蛋白含量多為以總氮量測定來反映總蛋白含量，對具體蛋白的分子數量及各分子的相對含量均不清楚，產品缺乏較為準確的量化數據。
有關生物纖維蛋白膠的質量研究報導不多，特別是能從高效液相色譜的整體特徵面貌上把握生物纖維蛋白膠的品種和質量情況未見報導。
發明內容
為了有效地控制生物纖維蛋白膠質量，本發明的目的是提供一種生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法及標準指紋圖譜，為生物纖維蛋白膠質量控制和產品真偽鑑別提供一種全新的方法。
本發明的目的是這樣實現的 一種生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，包括下列步驟
供試品溶液的製備A、主體膠供試品溶液的製備取主體膠適量，精密稱重，置量瓶中，加水或流動相溶解並定容，搖勻，過濾，取續濾液作為主體膠供試品溶液；或B、催化劑供試品溶液的製備取生物纖維蛋白膠催化劑適量，精密稱定，置量瓶中，加水或流動相溶解並定容，搖勻，過濾，取續濾液作為催化劑供試品溶液。
主體膠參照物溶液的製備取豬血纖維蛋白對照品適量，用水或流動相稀釋，製成主體膠參照物溶液，理論塔板數以豬血纖維蛋白峰計算並作為主體膠參照物；催化劑參照物溶液的製備取豬血白蛋白對照品適量，用水或流動相稀釋，製成催化劑參照物溶液，理論塔板數以豬血白蛋白峰計算並作為催化劑參照物；
測定精密吸取各供試品溶液及參照物溶液，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜
法測定，色譜條件色譜柱採用Protein-PakTM300SW分子排阻色譜柱；流動相為20mmol/L磷酸鈉的水溶液；紫外光190-280nm帶二極體陣列檢測器檢測；並以面積歸一化法計算各峰的相對峰面積，分別得到生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜及生物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜。
所述生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜中，共有峰有5個，其中超過總峰面積10%的指紋峰有3個，以豬血纖維蛋白原的色譜峰的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間並計算相對峰面積，上述3個指紋峰分別是1號峰豬血纖維蛋白原即參照峰的RT為1.000， 相對峰面積範圍為38.86%~51.64%; 2號峰的平均RT為1.456，相對峰面積範圍為12.27%~15.49%; 5號峰的平均RT為2.258,相對峰面積範圍為34.51%~44.64% ;所述生物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜中，共有峰有7個，其中超過總峰面積3%的指紋峰有3個，以豬血白蛋白的色譜峰的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間並計算相對峰面積，上述3個指紋峰分別是4號峰的平均RT為0.865，相對峰面積範圍為3.45%~11.06%; 5號峰豬血白蛋白即參照峰的RT 1.000,相對峰面積範圍為61.34% 89.40%; 7號峰的平均RT 1.501，相對峰面積範圍為3.01% 5.06%。
所述的方法，在製備供試品溶液A時加水或流動相的量不少於10倍主體膠重量，；在製備供試品溶液B時，加水或流動相的加入量不少於10倍催化劑重量；流動相為20mmol/L磷酸鈉的水溶液，流動相的流速為0.3ml/min-0.8ml/min;參照物濃度為每lml含0.1 2.0mg。
所述的標準指紋圖譜是通過比較10批生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜及生物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜色譜圖，由其共有特徵峰構成的生物纖維蛋白膠主體膠標準指紋圖譜及生物纖維蛋白膠催化劑標準指紋圖譜。
所述的生物纖維蛋白膠主體膠標準指紋圖譜，5個共有峰的相對保留時間的相對標準偏差RSD均小於3X， 1號峰豬血纖維蛋白即參照峰的RT為1.000， RSD為0.00%,相對峰面積範圍為38.86%~51.64%; 2號峰的平均RT為1.456， RSD為0.62%,相對峰面積範圍為12.27%~15.49%; 3號峰的平均RT為1.998， RSD為0.63%,相對峰面積範圍為0.18% 0.48%; 4號峰的平均RT為2.135, RSD為0.61%,相對峰面積範圍為0.22%~0.84%; 5號峰的平均RT為2.258， RSD為2.94%,相對峰面積範圍為34.51% 44.64%。生物纖維蛋白膠催化劑標準指紋圖譜，7個共有峰的相對保留時間的相對標準偏差RSD均小於2%， 1號峰的平均RT為0.669， RSD為0.23%,相對峰面積範圍為0.77% 1.84%; 2號峰的平均RT為0.731， RSD為0.25%,相對峰面積範圍為1.06%~2.52%; 3號峰的平均RT為0.799， RSD為0.43%,相對峰面積範圍為0.32%~2.58%; 4號峰的平均RT為0.865，RSD為0.55%,相對峰面積範圍為3.45%~11.06%; 5號峰豬血白蛋白即參照峰的RT為1.000， RSD為0.00%,相對峰面積範圍為61.34% 89.40%; 6號峰的平均RT為1.409, RSD為0.64%，相對峰面積範圍為0.36%~25.70%;7號峰的平均！1丁為1.501, RSD為0.18%,相對峰面積範圍為3.01%~5.06%。
本發明的原理是根據生物纖維蛋白膠的主要組成部分一主體膠與催化劑中的主要化學組成成分為蛋白質或多肽類成分，用分子排阻色譜將蛋白質或多肽類成分按分子量的大小分離，建立起生物纖維蛋白膠主體膠及催化劑的HPLC指紋圖譜，從色譜的整體面貌特徵上把握生物纖維蛋白膠的品種和質量情況。
本發明的優點如下
(1) 以生物纖維蛋白膠建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著生物纖維蛋白膠大部分蛋白質或多肽類成分的組成及活性，能有效地表徵生物纖維蛋白膠的質量。對生物纖維蛋白膠的主要化學成分進行檢測，既可以表徵出生物纖維蛋白膠活性成分的組成數量，又可以表徵出生物纖維蛋白膠活性成分的相對含量。故用生物纖維蛋白膠建立起來的HPLC指紋圖譜作為監控指標具有代表性。
(2) 以生物纖維蛋白膠整個指紋圖形作為一個整體看待，注重各個構成指紋特徵峰的前後順序和相互關係，注重整體面貌特徵，既避免了因只測定總蛋白成分而判定生物纖維蛋白膠整體質量的片面性，又減少了為質量達標而人為處理的可能性。本發明為完整、準確評價生物纖維蛋白膠的質量提供了新的對照標準，將為提高生物纖維蛋白膠製劑的質量及療效做出貢獻。(3沐發明具有方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易於掌握的特點。能從色譜的整體特徵面貌上把生物纖維蛋白膠的品種和質量情況，為生物纖維蛋白膠質量控制和真偽鑑別提供了一種全新的方法。
圖1是豬纖維蛋白原對照品製成的參照物溶液圖譜；圖2是10批生物纖維蛋白膠主體膠0-60分鐘的指紋圖譜；圖3是豬血白蛋白對照品製成的參照物溶液圖譜；圖4是10批生物纖維蛋白膠催化劑0-60分鐘的指紋圖譜；圖5是生物纖維蛋白膠主體膠0-60分鐘的標準指紋圖譜。圖6是生物纖維蛋白膠催化劑0-60分鐘的標準指紋圖譜；圖7是生物纖維蛋白膠主體膠0-60分鐘的DAD檢測三維圖譜；圖8是生物纖維蛋白膠催化劑0-60分鐘的DAD檢測三維圖譜。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明，下述實施例僅用於說明本發明而並非對本發明的限制。
實施例1 (生物纖維蛋白膠主體膠HPLC標準指紋圖譜的建立方法)
U義器與試藥
惠普1100高效液相色譜儀(美國)；紫外光帶DAD (二極體陣列)檢測器(美國)；
美國奧泰色譜之星工作站。豬纖維蛋白原對照品(廣州倍繡生物技術有限公司製備提供)，
純度大於98%;蒸餾水(自製)，磷酸鈉(分析純，廣東光華化學廠有限公司)；生物纖維
蛋白膠主體膠，編號080901、 080902、 080903、 081008， 081010、 081101、 081102， 081103、081104、 081115，廣州倍繡生物技術有限公司製備提供。
2. 色譜條件
色譜柱Protein-PakTM300SW色譜柱，7.5X300鵬；流動相為20mmol/L磷酸鈉的水溶液；紫外光220nm及二極體陣列檢測器檢測器(190nm-400nm)檢測；流速0.4ml/min;柱溫25'C;理論塔板數以豬纖維蛋白原峰計算，應不低於2000。
3. 指紋圖譜測定
3.1生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜製備
參照物溶液的製備選用豬纖維蛋白原為參照物，取豬纖維蛋白原對照品適量，用流動相稀釋，製成每lml中含豬纖維蛋白原1.05mg的溶液，作為參照物溶液。生物纖維蛋白膠主體膠供試品溶液製備取生物纖維蛋白膠主體膠20.4mg，置10ml量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為生物纖維蛋白膠主體膠供試品溶液。
分別取參照物溶液及生物纖維蛋白膠主體膠供試品溶液各20ul進樣，照高效液相色譜法測定，記錄60分鐘的色譜圖，見附圖1-2。以豬纖維蛋白原的色譜峰(S峰)的相對保留時間和相對峰面積為1計算其它色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。3.2共有峰確定
通過10批生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜測定，比較其色譜圖，確定共有峰為5個，其中超過總峰面積10%的指紋峰為1號峰(豬血纖維蛋白即參照峰的RT為1.000); 2號峰(平均RT為1.456); 5號峰(平均RT為2.258)。 10批生物纖維蛋白膠主體膠共有峰相對峰面積及相對保留時間統計結果見表l、表2、表3。
表1 10批生物纖維蛋白膠主體膠樣品相對保留時間統計
峰號樣1樣2樣3樣4樣5樣6樣7樣8樣9樣10均值RSD%
1l扁l細I細l扁l細l細l細l細l扁l細l働0.00
21.4461.4651.4591.4631.4481.4641.4631.4471.4411.4601.4560.62
31.9852.0112.0052.0071.9862.0092駕l駕1.9762.0031.9980.63
42.1202.1512.1452.1442.1242.1492.1422.1252.1132.1412.1350.64
52.2302.2422.2542.2472.2232.2482.4452.2332.2242.2382.2582.94
表2 IO批生物纖維蛋白膠主體膠樣品的相對峰面積值(％)
峰號樣l樣2樣3樣4樣5樣6樣7樣8樣9樣io
148.5238.8651.6451.4450.2848.1743.2451,2350.5650.27
214.4915.4912.2713.0213.3212.7413.4013.5014.0112.42
30.270.480.360.370.180,420.470.230.200.26
40.390.490.430.670.220.730.840.220.220.78
535.7844.6435.1634,5135.9937.9041.9534.8234.7636.27
表3生物纖維蛋白膠主體膠樣品的特徵峰相對保留時間及相對峰面積範圍特徵峰 相對保留時間 相對峰面積範圍(％)
3.3指紋圖譜重現性試驗
以生物纖維蛋白膠主體膠080901批為供試品(N^5),按照指紋圖譜重現性規定方法操
8
l細 38.86~51.64
1,456 12.27~15.49
l駕 0.18~0.48
2.135 0.22~0.84
2.258 34.51~44.64
1 2 3 4 5
峰條峰峰峰作，分別對共有峰相對保留時間及共有峰的相對峰面積(所有峰佔總峰面積百分比％)進行
統計，RSDX未超過3X，結果見表4。
_表4重現性實驗結果__(n-5)
特徵峰~相對保留時間OO RSD(%) 相對峰面積 RSD(%)
3.4指紋圖譜精密度試驗
按照指紋圖譜精密度規定方法操作，以生物纖維蛋白膠主體膠01批為供試品，取1份，連續進樣5次，分別對共有峰相對保留時間及共有峰的相對峰面積進行統計，RSD%未超過3%。
3.5指紋圖譜穩定性試驗
按照指紋圖譜穩定性測定方法操作，以生物纖維蛋白膠主體膠01批為供試品，考察24小時溶液穩定性，分別對共有峰相對保留時間及共有峰的相對峰面積進行統計，8小時內RSDX不超過3%。供試品8小時穩定。
以上試驗顯示，該測定方法穩定可靠，指紋圖譜相對穩定。實施例2 (生物纖維蛋白膠催化劑HPLC標準指紋圖譜的建立方法)
1. 儀器與試藥
惠普1100高效液相色譜儀(美國)；紫外光帶DAD (二極體陣列)檢測器(美國)；
美國奧泰色譜之星工作站。豬血白蛋白對照品(廣州倍繡生物技術有限公司製備提供)，
純度大於98%;蒸餾水(自製)，磷酸鈉(分析純，廣東光華化學廠有限公司)；生物纖維蛋白膠催化劑，編號080901、 080902、 080903、 081008， 081010、 081101、 081102， 081103、081104、 081115，廣州倍繡生物技術有限公司製備提供。
2. 色譜條件
色譜柱Protein-PakTM300SW色譜柱，7.5X300咖；流動相為20mmol/L磷酸鈉的水溶液；紫外光220nm及二極體陣列檢測器檢測器(l卯nm-400nm)檢測；流速0.4ml / min;柱溫25°C;理論塔板數以豬血白蛋白峰計算，應不低於1500。
3. 指紋圖譜測定
3.1生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜製備
參照物溶液的製備選用豬血白蛋白為參照物，取豬血白蛋白對照品適量，用水或流
1.0001.449l.卿2,1242.237
0.210,140.330.310.87
48.9214.500.280.3936.01
1.78U70.951.241.75
1 2 3 4 5
峰條峰峰峰動相稀釋，製成每lml中含豬血白蛋白0.98mg的溶液，作為參照物溶液。
生物纖維蛋白膠催化劑供試品溶液製備取生物纖維蛋白膠催化劑20.03mg，置10ml 量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為生物纖維蛋白膠催化劑供試 品溶液。
分別取參照物溶液及生物纖維蛋白膠催化劑供試品溶液各20進樣，照高效液相色 譜法測定，記錄60分鐘的色譜圖，見附圖3-4。以豬血白蛋白的色譜峰(S峰)的相對保留 時間和相對峰面積為1計算其它色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。 3.2共有峰確定
通過10批生物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜測定，比較其色譜圖，確定共有峰為7個，
其中超過總峰面積3%的指紋峰為4號峰(平均RT為0.867)， 5號峰(豬血白蛋白即參照
峰的RT為1.000); 7號峰(平均RT為1.501)。 10批生物纖維蛋白膠催化劑共有峰相對峰
面積及相對保留時間統計結果見表5、表6、表7。
表5 10批生物纖維蛋白膠催化劑相對保留時間統計
峰號樣l樣2樣3樣4樣5樣6樣7樣8樣9樣10均值RSD%
10.6710.6690.6700.6680.6670.6670.6680.6700.6710.6700.6690.23
20.7320.7290.7310.7330.7320.7280.7310.7300.7340.7300.7310.25
30.7980.8030細0.7960.7990.7930細0.8030.7980.8040.7990.43
40.8670細0.8670.8580.8560.8610.8630,8670.8690.8690.8650.55
5l扁l細l細l細l細l細l細l扁l細l細1.0000.00
61.4151.4151.4151.4091.3971.3931.3981.4151,4141.4151.4090.64
71,5011.5061.5011,4991.4971.4971.4991.5021.5031.5011.5010.18
表6 10批生物纖維蛋白膠催化劑樣品的相對峰面積值(％ )
峰號樣1樣2樣3樣4樣5樣6樣7樣8樣9樣IO
11.741.840.860.820,900.971.231.640.771,52
22.521.791.251.221.261.311.462.121.061.64
32.582"401.100.660.320.660.321.720.761.80
411.0610.767.495.123.453.818,9310.436.1510.12
570.26783161.9487.8989.40歸380.1272.8361.3480.49
67.670,7924.301.650.630.362.887.0625.700.41
73,,843.643.013.073.823.745.064.144.033.73
表7生物纖維蛋白膠催化劑樣品的特徵峰相對保留時間及相對峰面積範圍 特徵峰 相對保留時間 相對峰面積範圍(％)
峰1 0,669 0.77~1.84
峰2 0.731 1.06-2.52
峰3 0.799 0.32 2.583.3指紋圖譜重現性試驗
以生物纖維蛋白膠催化劑080901批為供試品(N-5)，按照指紋圖譜重現性規定方法操
作，分別對共有峰相對保留時間及共有峰的相對峰面積(所有峰佔總峰面積百分比％)迸行
統計，RSDX末超過3X。結果見表8
表8重現性實驗結果 (n-5) 特徵峰~相對保留時間OOSD(%) 相對峰面積 RSD(%)
3.4指紋圖譜精密度試驗
按照指紋圖譜精密度規定方法操作，以生物纖維蛋白膠催化劑080901批為供試品， 取1份，連續進樣5次，分別對共有峰相對保留時間及共有峰的相對峰面積進行統計，RSD %末超過3%。 3.5指紋圖譜穩定性試驗
按照指紋圖譜穩定性測定方法操作，以生物纖維蛋白膠催化劑080901批為供試品， 考察24小時溶液穩定，分別對共有峰相對保留時間及共有峰的相對峰面積進行統計，12 小時RSDX不超過3%。供試品12小時穩定。
以上試驗顯示，該測定方法穩定可靠，指紋圖譜相對穩定。
實施例3
取生物纖維蛋白膠主體膠081201，按實施例1生物纖維蛋白膠主體膠HPLC標準指紋 圖譜的建立方法中的條件和方法，取生物纖維蛋白膠主體膠19.48mg，置10ml量瓶中，加 水溶解並稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為生物纖維蛋白膠主體膠供試品溶液；分 別取實施例1參照物溶液及上述供試品溶液各20ul進樣，照高效液相色譜法測定，記錄 60分鐘的色譜圖及DAD三維圖譜，得指紋色譜圖(見圖5)及DAD三維圖(見圖7)。 以豬纖維蛋白原的色譜峰(S峰)的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間並計算相對峰面積，其3個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積分別為l號峰(豬纖維蛋 白原)RT為1.000，相對峰面積50.79%, 2號峰RT為1.458，相對峰面積13.47%; 5號 峰RT為2.257，相對峰面積35.97% 。
實施例4
取生物纖維蛋白膠催化劑081201，按實施例2生物纖維蛋白膠催化劑HPLC標準指紋 圖譜的建立方法中的條件和方法，取生物纖維蛋白膠催化劑19.48mg，置10ml量瓶中，加 水溶解並稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為生物纖維蛋白膠催化劑供試品溶液；分 別取實施例2參照物溶液及上述供試品溶液各20iU進樣，照高效液相色譜法測定，記錄 60分鐘的色譜圖及DAD三維圖譜，得指紋色譜圖(見圖6)及DAD三維圖(見圖8)。 以豬血白蛋白的色譜峰(S峰)的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間並計算 相對峰面積，其3個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積分別為4號峰RT為0.866， 相對峰面積7.32%; 5號峰(豬血白蛋白)RT為1.000,相對峰面積78.31%; 7號峰RT 為1.499，相對峰面積3.64%。
權利要求
1.一種生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，其特徵在於包括以下步驟供試品溶液的製備A、主體膠供試品溶液的製備取主體膠適量，精密稱重，置量瓶中，加水或流動相溶解並定容，搖勻，過濾，取續濾液作為主體膠供試品溶液；或B、催化劑供試品溶液的製備取生物纖維蛋白膠催化劑適量，精密稱定，置量瓶中，加水或流動相溶解並定容，搖勻，過濾，取續濾液作為催化劑供試品溶液。主體膠參照物溶液的製備取豬血纖維蛋白原對照品適量，用水或流動相稀釋，製成主體膠參照物溶液，理論塔板數以豬血纖維蛋白原峰計算並作為主體膠參照物；催化劑參照物溶液的製備取豬血白蛋白對照品適量，用水或流動相稀釋，製成催化劑參照物溶液，理論塔板數以豬血白蛋白峰計算並作為催化劑參照物；測定精密吸取各供試品溶液及參照物溶液，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，色譜條件色譜柱採用Protein-PakTM300SW分子排阻色譜柱，流動相為20mmol/L磷酸鈉的水溶液，紫外光190-280nm帶二極體陣列檢測器檢測；並以面積歸一化法計算各峰的相對峰面積，分別得到生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜及生物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜。
2. 根據權利要求1所述的生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，其特徵在於所述生 物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜中，共有峰有5個，其中超過總峰面積10%的指紋峰有3個， 以豬血纖維蛋白原的色譜峰的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間並計算相 對峰面積，上述3個指紋峰分別是1號峰豬血纖維蛋白原即參照峰的RT為1.000，相對 峰面積範圍為38.86% 51.64%;2號峰的平均RT為1.456，相對峰面積範圍為12.27%~15.49 %; 5號峰的平均RT為2.258,相對峰面積範圍為34.51%~44.64% 。
3. 根據權利要求l所述的生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，其特徵在於所述生 物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜中，共有峰有7個，其中超過總峰面積3%的指紋峰有3個， 以豬血白蛋白的色譜峰的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間並計算相對峰 面積，上述3個指紋峰分別是4號峰的平均RT為0.865，相對峰面積範圍為3.45%~11.06 %; 5號峰豬血白蛋白即參照峰的RTl.OOO,相對峰面積範圍為61.34%~89.40%; 7號峰的 平均RT 1.501,相對峰面積範圍為3.01%~5.06%。
4. 根據權利要求1所述的生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，其特徵在於在制 備供試品溶液A時加水或流動相的量不少於10倍主體膠重量；在製備供試品溶液B時， 加水或流動相的加入量不少於IO倍催化劑重量。
5. 根據權利要求l所述的生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，其特徵在於所述的色譜條件中，流動相為20mmol/L磷酸鈉的水溶液，流動相的流速為0.3ml/min-0.8ml/min;參照物濃度為每lml含0.1 2.0mg。
6. 根據權利要求1所述的生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法所得到標準指紋圖譜，是通過比較10批生物纖維蛋白膠主體膠指紋圖譜及生物纖維蛋白膠催化劑指紋圖譜色譜圖，由其共有特徵峰構成的生物纖維蛋白膠主體膠標準指紋圖譜及生物纖維蛋白膠催化劑標準指紋圖譜。
7. 根據權利要求6所述的生物纖維蛋白膠主體膠標準指紋圖譜，其特徵在於5個共有峰的相對保留時間的相對標準偏差RSD均小於3%， 1號峰豬血纖維蛋白即參照峰的RT為1.000， RSD為O.OOX,相對峰面積範圍為38.86%~51.64%; 2號峰的平均RT為1.456，RSD為0.62%，相對峰面積範圍為12.27%~15.49%; 3號峰的平均RT為1.998， RSD為0.63%,相對峰面積範圍為0.18% 0.48%; 4號峰的平均RT為2.135， RSD為0.61%,相對峰面積範圍為0.22% 0.84%; 5號峰的平均RT為2.258， RSD為2.94%,相對峰面積範圍為34.51% 44.64%。
8. 根據權利要求6所述的生物纖維蛋白膠催化劑標準指紋圖譜，其特徵在於7個共有峰的相對保留時間的相對標準偏差RSD均小於2%, 1號峰的平均RT為0.669， RSD為0.23%,相對峰面積範圍為0.77% 1.84%; 2號峰的平均RT為0.731， RSD為0.25%,相對峰面積範圍為1.06%~2.52% ; 3號峰的平均RT為0.799， RSD為0.43%,相對峰面積範圍為0.32%~2.58%; 4號峰的平均RT為0.865， RSD為0.55%, 相對峰面積範圍為3.45°/。~11.06%; 5號峰豬血白蛋白即參照峰的RT為1.000， RSD為0.00%,相對峰面積範圍為61.34%~89.40%; 6號峰的平均RT為1.409, RSD為0.64%，相對峰面積範圍為0.36%~25.70%; 7號峰的平均RT為1.501, RSD為0.18%,相對峰面積範圍為3.01%~5.06%。
9. 權利要求l所述的生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法，應用於生物纖維蛋白膠質量控制和真偽鑑別。
全文摘要
本發明公開了一種生物纖維蛋白膠指紋圖譜的建立方法及標準指紋圖譜。涉及生物纖維蛋白膠製品的質量控制方法。本發明通過對10批生物纖維蛋白膠的高效液相色譜HPLC指紋圖譜進行比較，確定了其共有指紋特徵，得到標準指紋圖譜。本生物纖維蛋白膠除溶解液外分為主體膠與催化劑二個部分，主體膠指紋圖譜中，共有峰有5個，其中超過總峰面積10％的指紋峰有3個，催化劑指紋圖譜中，共有峰有7個，其中超過總峰面積3％的指紋峰有3個。本方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易於掌握，能從色譜的整體特徵面貌上把握物生物纖維蛋白膠的品種質量情況，為生物纖維蛋白膠質量控制和真偽鑑別提供了一種全新的方法。
文檔編號G01N30/00GK101526507SQ20091003853
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月10日 優先權日2009年4月10日
發明者春 向, 李吉來, 江彩霞, 潘小寧, 肖尚志, 星 黃 申請人:廣州倍繡生物技術有限公司