一種植物抗逆鋅指蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
2023-12-01 20:21:01 3
專利名稱：一種植物抗逆鋅指蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物生物工程領域中一種植物抗逆鋅指蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
植物在生長過程中常常會受到各種環境因子的刺激，諸如一些乾旱、低溫、高鹽等非生物脅迫因子和病菌侵染、機械傷害、蟲害等生物脅迫因子，植物在抵抗這些逆境的過程中已經進化形成了一系列抗逆應答反應和防衛機制。轉錄因子在調控植物這些抗逆和防衛反應的過程中處在一個中心調控的地位。鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZnF)是植物中較大的轉錄因子家庭之一，參與植物的形態建成、配子產生、胚及花器官的發育、光及抗逆反應等多種調控過程。從資料庫中的數據推測，擬南芥中編碼C2H2型和C3H型的鋅指蛋白轉錄因子基因分別有231個和33個。
近年來，越來越多的證據表明鋅指蛋白參與了一些與乾旱、低溫、高鹽及病蟲害等逆境脅迫的相關反應，而且在這些反應中所起的作用也是多種多樣的，有些是作為激活子激活相關基因的表達，有些是作為抑制子抑制一些基因的表達，也有些能與其它轉錄因子結合成同源或異源二聚體在調控逆境脅迫中發揮作用。目前，有關鋅指蛋白的研究主要集中在擬南芥、矮牽牛、金魚草和水稻等模式物種，在小麥等基因組複雜的作物中有關鋅指蛋白開展的研究極少。
發明內容
本發明的目的是提供一種植物抗逆鋅指蛋白及其編碼基因。
本發明所提供的植物抗逆鋅指蛋白，名稱為TaZnF(Triticum aestivum Zincfinger protein)，來源於普通小麥(Triticum aestivum L.)，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的由(a)衍生的蛋白質。
序列表中序列2由165個胺基酸殘基組成，如圖7所示，共含有兩個鋅指結構域，其中N端(序列2的自氨基端第22位至41位胺基酸殘基)編碼A-20鋅指(C2C2型)，C端(序列2的自氨基端第106位至138位胺基酸殘基)編碼AN-1鋅指(C2H2型)。圖7中，下劃線分別表示N端的A20鋅指和C端的AN-1鋅指結構域，陰影部分表示形成鋅指結構的保守胺基酸。
所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述兩個鋅指結構域之外進行一至十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物抗逆鋅指蛋白的編碼基因(TaZnF)也屬於本發明的保護範圍。
所述植物抗逆鋅指蛋白編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質的多核苷酸。
所述植物抗逆鋅指蛋白編碼基因的編碼序列(ORF)為序列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
所述植物抗逆鋅指蛋白編碼基因，具體可為如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物抗逆性相關的蛋白質的DNA分子。
所述嚴格條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交並洗膜。
序列表中的序列1由2147個脫氧核苷酸組成。自5′端第1位至1354位脫氧核苷酸為啟動子區，自5′端第1355位至1852位脫氧核苷酸為編碼序列，自5′端第1853位至2147位脫氧核苷酸。
含有本發明基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
擴增TaZnF中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內，其中，上遊引物和下遊引物之間的距離在50到5000個鹼基之間；該引物對中的每一個引物的長度為15到30個鹼基。如，引物15』-GCGGGATCACAAGCAGGAG-3』；引物25』-GCCGCCGGAACATCAGCAT-3』。
利用可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明的TaZnF基因導入植物細胞，或將TaZnF基因過表達，植物表現為對各種非生物脅迫逆境(乾旱、低溫、高鹽等)的抗性增強。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因對培育植物抗逆新品種具有重要意義。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
圖1為TaZnF因的脅迫誘導表達模式圖2為TaZnF與GFP的融合蛋白的亞細胞定位結果圖3為轉化pGEX-4T-1-TaZnF和pGEX-4T-1的大腸桿菌細胞脅迫條件下的生長變化曲線圖4為野生型和轉基因株系在乾旱處理一個月，重複澆水一周後，植株恢復生長的狀態照片圖5為野生型和轉基因植株在低溫處理前，以及低溫處理後置於正常生長環境中恢復生長5天及10天後的植株生長狀態照片圖6為野生型和轉基因植株在高鹽處理前，以及處理後7天和14天的植株生長狀態照片圖7為TaZnF的胺基酸序列具體實施方式
下述實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、TaZnF基因的克隆(1)小麥TaZnF基因序列的電子克隆以水稻中OSISAP1基因的全長cDNA序列為查詢序列，然後登錄GenBank資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，對EST資料庫進行序列同源性比對進行查找(blastn)，共得到12個與水稻的序列高度同源的小麥的EST序列，分別為CD904159、CD934857、CA733262、BQ803525、BQ802055、BQ800826、CD870668、CD868128、BQ838331、AL825727、BJ322156、BJ320036，用DNAMAN軟體進行序列拼接；利用第一次拼接的結果進行第二次序列同源性比對查找(blastn)，得到25個小麥的EST序列，利用DNAMAN軟體把這25個EST序列分別與第一次比對的結果進行拼接，其中的1個EST序列(BJ27846)與第1次拼接的結果拼接後延伸序列的最長，然後把此拼接結果提交到NCBI，利用blastx預測功能域。
(2)小麥TaZnF基因的cDNA及非翻譯區序列克隆根據電子克隆得到的序列設計引物，以小麥品種農大3432(Triticum aestivumL.)(購自北京市通州區種子公司)葉片的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR產物經過測序驗證後，得到TaZnF基因的ORF區段。利用3』RACE得到TaZnF基因的3』端的非翻譯區序列為295bp，帶有19個polyA尾巴。利用Genome walker技術得到5』端的啟動子區域1354bp，全序列信息見序列分析表中的SEQ ID №1，同時對啟動子區域的順式作用成分進行了分析；TaZnF的ORF序列編碼的蛋白質序列如序列表中的SEQ ID №2，共含有兩個鋅指結構域，其中N端(序列2的自氨基端第22位至41位胺基酸殘基)編碼A-20鋅指(C2C2型)，C端(序列2的自氨基端第106位至138位胺基酸殘基)編碼AN-1鋅指(C2H2型)，並且TaZnF基因是一個不含有內含子的鋅指蛋白基因。
實施例2、TaZnF基因的脅迫誘導表達模式以25％PEG-6000、250mM NaCl、4℃低溫及100uM ABA分別處理小麥幼苗，並取不同處理時間的小麥根系，提取RNA反轉錄cDNA後，用引物15』-GCGGGATCACAAGCAGGAG-3』和引物25』-GCCGCCGGAACATCAGCAT-3』，採用實時螢光定量PCR檢測TaZnF基因的時空表達特徵。其中脅迫處理的具體方法為如下實驗材料為普通小麥品種農大3432(Triticum aestivum L.)，種子表面消毒採用5％的次氯酸鈉處理10分鐘，用蒸餾水衝洗4遍後，置於4℃冰箱中暗培養一周。培養瓶的底部事先放好浸溼的棉花，把小麥的種子移入培養瓶，置於培養室中(溫度25℃，相對溼度60％-70％，光強7000-8000Lux)水培養。在小麥生長至二葉一心期以後，進行脅迫處理高鹽處理在培養瓶中加入NaCl溶液至終濃度為250mM。
PEG處理在培養瓶中加入PEG-6000溶液至終濃度為25％(質量百分含量)。
ABA處理把ABA溶解在DMSO中製成10mM貯存液，然後加入到培養瓶中至終濃度為100uM。
在加入上述溶液以後，分別在處理0.5、1、2、12，24小時選取小麥的根系，用吸水紙吸乾殘餘溶液後迅速置於液氮中，於-80℃冰箱中保存，待用。同時以未處理的小麥根系(即只生長在水中)，作為對照組。
低溫處理是將小麥的幼苗置於4℃低溫光照培養箱中，處理的時間和取材方法同上，對照組為在正常培養室的溫度(25℃)和光照條件(7000-8000Lux)。
實時定量螢光PCR的結果如圖1所示，TaZnF基因受PEG(25％)、高鹽(NaCl，250mM)、低溫(4℃)及ABA(100μM)處理均有相應的響應。對於PEG(25％)的處理，在處理的初期(0.5小時)，基因的表達迅速增加到最高水平，然後隨著處理時間的延長，基因的表達量開始下降，到了後期(12小時)，基因表達量基本上保持在一個相對穩定的水平上(圖1中A)。在植物激素ABA處理以後(100uM)，基因的表達逐漸升高到最高水平後(2小時)，緩慢下降(圖1中B)。低溫處理時(4℃)，在最初處理的階段(0.5小時)，基因的表達迅速增加到最高水平，然後又快速下降，到後期(12小時)又略有升高，然後維持在一個相對穩定的水平上(圖1中C)。高鹽處理時(NaCl，250mM)，基因表達隨著處理時間的增加緩慢升高到最高(12小時)，然後開始下降，直到後期(24小時)表達量甚至要低於本底水平(圖1中D)。圖1中，橫坐標脅迫處理的時間分別為0.5、1、2、12、24小時，縱坐標表示在不同處理條件下TaZnF基因的相對表達水平。
實施例3、TaZnF基因的亞細胞定位為驗證TaZnF基因在細胞中的作用部位，將TaZnF的編碼區插入pEGAD(Sean R.Cutler，David W.Ehrhardt，Joel S.Griffitts，and Chris R.SomervilleRandom GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structuresin cells of Arabidopsis at a high frequency，PNAS，2000，(97)3718-3723)的35S啟動子和綠色螢光蛋白GFP基因之間得到含有GFP-TaZnF融合基因的重組表達載體pEGAD-TaZnF，通過GFP表達部位確定TaZnF蛋白在細胞內的定位情況，同時以pEGAD表達載體為對照。將上述兩種載體分別經基因槍法轉入洋蔥表皮細胞，結果顯示轉pEGAD-TaZnF的洋蔥表皮的綠色螢光分布在細胞核中(圖2中A～C)，而對照組的GFP蛋白發出的綠色螢光均勻地分布在整個細胞中(圖2中D)。表明TaZnF基因編碼的蛋白是一個核蛋白。圖2中，A、B、C分別表示TaZnF蛋白定位在洋蔥表皮細胞的細胞核中，A是暗場照片，B是明場照片，C是A和B疊加後的照片。D為空載體pEGAD在洋蔥表皮細胞的定位情況，均勻地分散在整個細胞中。
實施例4、TaZnF基因的表達增強原核生物大腸桿菌細胞的抗逆性為了驗證TaZnF在原核生物中抗滲透、抗高鹽和抗低溫的作用，構建了原核表達載體pGEX4T-1-TaZnF。pGEX4T-1-TaZnF的構建方法如下以小麥品種農大3432(Triticum aestivum L.)葉片的cDNA為模板，利用引物25』-CGGAATTCATGGCGCAGCGGGATCACAG-3』和5』-CCCAAGCTTTCAGAACCTGACGATCTTGGC-3』，PCR擴增得到TaZnF的編碼序列(序列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脫氧核苷酸)，將得到的TaZnF片段插入pGEX-4T-1(購自Pharmacia公司)的限制型內切酶EcoRI與HindIII酶切位點之間，得到含有TaZnF編碼區片段的重組表達載體pGEX4T-1-TaZnF。
用pGEX4T-1-TaZnF轉化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)細胞，同時用pGEX-4T-1(購自Pharmacia公司)轉化大腸桿菌細胞(E.coli)BL21(DE3)，作為對照。將轉化的大腸桿菌在LB培養基、37℃培養至OD600值為0.6時，加入0.1mmol/L IPTG進行誘導。IPTG誘導2hr後分別對培養液進行下述任一種處理1)在培養液中加入1M甘露醇；2)在培養液中加入0.3M LiCl溶液；3)把菌液置於10℃的低溫振蕩培養箱中培養24hr後取出置於37℃的振蕩培養箱中恢復生長。分別檢測pGEX4T-1-TaZnF轉化的大腸桿菌細胞和pGEX-4T-1轉化的大腸桿菌細胞在高滲、高鹽和低溫環境中的生長情況。實驗結果如圖3中A-C所示圖3中A表示在加入1M的Mannitol以後，每隔兩小時測菌液的OD600值；圖3中B表示在加入300mM的LiCl以後，每隔兩個小時測菌液OD600值；圖3中C表示在10℃條件下培養24小時後，移到37℃的環境中培養，每隔1小時測菌液的OD600值。
圖3中A表明加入1mol/L甘露醇2hr內，被轉化的大腸桿菌繼續生長，2hr後生長速度減慢，部分被轉化的大腸桿菌細胞受甘露醇影響，逐漸死亡；與pGEX4T-1-TaZnF轉化的大腸桿菌菌液吸收值相比，對照菌液吸收值的下降速度快；6hr後大部分細菌細胞開始恢復生長，但是pGEX4T-1-TaZnF轉化的大腸桿菌細胞恢復生長的速度也快於轉化空載體pGEX4T-1的細胞。表明TaZnF提高了大腸桿菌細胞抗滲透的能力。
圖3中B表明加入0.3M LiCl 2hr內，兩類細胞基本上處於一個停滯的生長狀態，2hr後，轉化pGEX4T-1-TaZnF的細胞開始慢慢地恢復生長，而轉化空載體pGEX-4T-1的細胞基本上處於停滯生長的狀態。表明TaZnF增強了大腸桿菌細胞對於鹽離子(Li+)的忍受能力。
圖3中C表明把菌液置於10℃的低溫振蕩培養箱中培養24hr，處理初期部分大腸桿菌細胞生長，而後基本上處於停滯狀態。24hr後取出置於37℃的振蕩培養箱中恢復生長，結果顯示，轉化pGEX4T-1-TaZnF的細胞恢復生長速度比轉化空載體pGEX-4T-1的細胞生長速度快。表明轉化pGEX4T-1-TaZnF的大腸桿菌細胞在低溫脅迫後恢復生長的能力要比含有空載體的大腸桿菌細胞生長快。表明TaZnF增強了大腸桿菌細胞對於低溫的抵抗力。
在正常生長環境中(LB培養基，37℃)，轉化pGEX4T-1-TaZnF的大腸桿菌細胞與對照細胞的生長狀態和生長速度基本一致，沒有很大的差別，但是在高滲、高鹽或低溫脅迫下，轉化pGEX4T-1-TaZnF的大腸桿菌細胞比對照組細胞普遍表現出較強的生長能力和較快的生長速度。
實施例5、野生型和轉基因植物在不同脅迫處理條件下的表型及生理鑑定1、轉基因植株的獲得(1)pCAMBIA-35S-TaZnF表達載體的構建以小麥品種農大3432(Triticum aestivum L.)葉片的cDNA為模板，利用引物35』-GCTCTAGAATGGCGCAGCGGGATCACA-3』和5』-GGGGTACCTCAGAACCTGACGAGCTTG-3』，PCR擴增得到TaZnF的編碼序列(序列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脫氧核苷酸)，將得到的TaZnF片段經限制性內切酶XbaI和KpnI消化後，插入質粒pCAMBIA-1300(購自CAMBIA公司)的限制型內切酶XbaI和KpnI酶切位點之間，得到含有TaZnF編碼區片段的表達載體pCAMBIA-TaZnF；以限制性內切酶Hind III和Xba I消化質粒pBI121(購自Clontech公司)，回收CaMV35S片段，並插入質粒pCAMBIA-TaZnF的限制型內切酶Hind III和XbaI酶切位點之間，得到含有CaMV35S啟動子和TaZnF編碼區片段的超表達載體pCAMBIA-35S-TaZnF。
用pCAMBIA-35S-TaZnF轉化根癌農桿菌LBA4404，利用農桿菌侵染方法轉化Columbia生態型擬南芥(Arabidopsis Biological Resource Center)，經50ug/l潮黴素和PCR篩選共得到了30個轉pCAMBIA-35S-TaZnF株系(簡稱轉TaZnF基因株系)(T3代)。將野生型(WT)和T3代轉TaZnF基因植株種子平鋪在MS培養基上，4℃下春化5d後，移入生長箱中(22℃恆溫，24hr光照，光強為30-40umol.m-2s-1)培養十天後移入土壤中。與野生型對比，轉TaZnF基因株系沒有明顯的表型變化。選取30個轉TaZnF基因株系中的5個株系(#2、#4、#13、#14、#28)進行下述步驟2的轉基因植株抗逆性鑑定。
其中，得到的第一代轉基因植株為T1代，T1代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T2代，依此類推，T3表示轉基因植株第3代。
2、轉基因植株的抗逆性鑑定(1)過表達TaZnF的轉基因擬南芥抗旱性分析通過35S啟動子啟動TaZnF基因在轉基因植株中的表達，來檢測TaZnF基因在乾旱脅迫中的作用。具體方法如下首先將WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)種子種在培養皿中春化5天，移入培養箱中(22℃恆溫，24小時光照，光強為30-40umol.m-2s-1)培養十天後移入土壤中再生長14天。在乾旱處理之前，挑選同樣大小，生長狀態一致的WT和#2、#4、#13、#14、#28轉TaZnF基因株系植株(各81株)置於同一託盤中，設置3個重複；停止澆水30天進行乾旱處理，然後重複澆水7天，統計株系的存活率(見表1)，從存活率的統計結果來看，野生型的存活率為22.38％，轉TaZnF基因株系的存活率分別為53.73％，65.15％，76.47％，89.87％和100％，T-檢測的結果表明轉TaZnF基因株系#2、#4、#14、#28的存活率和野生型相比均有顯著的差異(P＜0.05)。從外觀上觀察，轉TaZnF基因株系和野生型的表型一致。WT和轉TaZnF基因株系在乾旱處理以後，植株的葉片都逐漸失水萎蔫，轉TaZnF基因株系的植株失水的速度稍比WT植株慢一些，但是差別不明顯，但是在乾旱以後，重複澆水一周以後，大部分WT植株葉片開始變黃，發白，逐漸死去，而轉TaZnF基因株系大部分植株能恢復正常的生長水平，並完成整個生活周期(圖4)。以上的結果證明，轉TaZnF基因株系的存活率普遍大於WT，重複澆水後恢復生長的能力遠遠大於WT，說明在擬南芥中過表達TaZnF基因顯著地提高了轉基因植株的抗旱能力。
表1野生型(WT)和轉TaZnF基因株系在乾旱條件下的存活率
注*代表顯著性差異(P＜0.05)(2)抗低溫鑑定①低溫條件下的存活率測定WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株的前期培養同前，在低溫處理之前，挑選同樣大小，生長狀態一致的WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)(各81株)置於同一託盤中，設置3個重複；將植株置於-10℃培養箱中4小時，取出後置於-5℃的培養箱中低溫處理30個小時，然後取出置於正常培養條件下(22℃)生長10天後，統計整個株系的存活率(表2)。從外觀上觀察，轉TaZnF基因株系植株和野生型的表型一致。WT和轉TaZnF基因株系在低溫處理以後，植株的葉片都有不同程度的凍傷，WT和轉TaZnF基因株系差別不明顯，但是在正常環境中培養5天以後，大部分的WT植株葉片開始變白，並逐漸死去，而大部分轉TaZnF基因株系植株基本上可以恢復正常的生長水平，並完成整個生活周期(圖5)。T-檢測的結果表明轉TaZnF基因株系在低溫脅迫以後恢復生長的存活率普遍大於WT，並且有三個株系(#4、#13和#28)的存活率與野生型相比均有顯著的差異(P＜0.05)，一個株系(#14)與野生型和相比為極顯著性的差異(P＜0.01)，而且低溫脅迫後TaZnF基因株系恢復生長的能力也大於WT，說明在擬南芥中過表達TaZnF基因顯著地提高了轉基因植株的抗低溫的能力。
②低溫脅迫處理下離體葉片電導率的測定植物的細胞膜對維持細胞的微環境和正常的代謝起著重要作用，在正常情況下，細胞膜對物質具有選擇透性能力，當植物受到低溫等逆境影響時，細胞膜會遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內的電解質外滲，以致植物細胞浸提液的電導率增大。電導率的變化與植物在相同脅迫條件下的抗逆性有關，即抗逆性強的品系細胞膜受傷害的程度小，細胞膜的穩定性(Cell membrane stability，CMS)強。
對WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株(每株系各5株)在低溫脅迫時離體葉片的電導率進行了測定，CMS＝[1-(T1/T2)]/[1-(C1/C2)]。電導率的測定採用如下方法1)用打孔器從轉基因和野生型植株的第5片和第6片葉子上打下直徑為0.5釐米的圓盤(每個基因型做五個重複，分別取自五株不同的植株，每株取下兩片葉子，一片葉子作為處理組，一片葉子作為對照組)，用去離子水衝洗2-3次，吸水紙吸乾後，置於10ml的離心管中，加入去離子水5ml，置於-10℃條件下暗處理24小時。2)對照組的葉片的電導率的測定是直接向離心管中加入去離水5ml，使整個葉片全部浸沒在水中後，放在4℃冰箱中24小時後，在室溫下平衡1-2小時，然後用電導率儀測定每個離心管中溶液的電導率，記下的電導率的讀數為C1；然後，在15Psi，121℃條件下滅菌15分鐘，再用電導率儀測定此時溶液的電導率，記為C2。3)處理組的電導率的測定按如上操作進行，高壓滅菌前後的電導率為T1和T2。
結果顯示野生型植株葉片在低溫處理後的CMS值為27.04％，而轉TaZnF基因株系的CMS值都分別為53.35％、54.94％、57.78％、64.72％和73.77％，並且3個轉TaZnF基因株系(#2、#4和#13)的CMS值與野生型相比有顯著性差異，2個轉TaZnF基因株系(#14和#28)有極顯著性差異(表2)，說明在低溫脅迫條件下，轉TaZnF基因株系的細胞膜的穩定性普遍要高於野生型。
表2野生型(WT)和轉TaZnF基因株系在低溫條件下的存活率和離體葉片的CMS值測定
注*和**分別代表顯著性差異(P＜0.05)和極顯著性差異(P＜0.01)(3)抗鹽性鑑定①高鹽脅迫處理下的存活率測定WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)植株的前期培養同前，在高鹽處理之前，挑選同樣大小，生長狀態一致的WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)(各81株)置於同一託盤中，設置3個重複，培養5天後，向託盤中施澆400mM的NaCl溶液，每隔五天澆一次，每次澆500ml，14天後統計整個株系的存活率(表3)。野生型和轉TaZnF基因株系的表型一致。在鹽溶液處理7天以後，野生型和轉TaZnF基因株系植株的個別葉片開始變白，處理14天後，大部分轉TaZnF基因株系植株部分的葉片都變白，但是相比之下WT葉片發白的程度比轉TaZnF基因株系要相對嚴重一些，受傷害的比例也要大一些(圖6)。以上的結果表明，轉TaZnF基因株系在高鹽處理後的存活率稍大於WT，並且葉片變白的速度也比WT慢，說明在擬南芥中過表達TaZnF基因對轉基因植株的抗高鹽的能力略有提高。
②高鹽脅迫條件下葉片葉綠素含量的測定按照文獻《植物生理生化實驗原理和技術》(李合生等，2000，北京，高等教育出版社，134-137)描述的方法對WT和T3代轉TaZnF基因株系(#2、#4、#13、#14、#28)(每株系各5株)在高鹽脅迫後7天的葉片的葉綠素含量進行了測定，結果顯示WT在高鹽處理後的葉綠素的含量為1.30mg/g，而轉基因株系的葉綠素的含量分別為1.48mg/g、1.79mg/g、1.78mg/g、1.94mg/g和1.95mg/g以上(表3)，並且#2、#13、#14和#28轉基因株系在高脅迫後，葉綠素含量和野生型相比均有顯著性差異，這些結果表明，轉TaZnF基因株系在高鹽脅迫下擁有比WT更高的葉綠素含量，也說明轉TaZnF基因株系比WT有更強的忍受鹽離子脅迫的能力。
表3野生型(WT)和轉TaZnF基因株系在高鹽條件下的存活率和葉綠素測定
注*代表顯著性差異(P＜0.05)上述結果說明小麥TaZnF基因在擬南芥中的表達提高了轉基因植株抗乾旱、低溫和高鹽的能力，而且在提高抗性的同時轉基因植株的生長發育過程沒有受到影響。
序列表160221012112147212DNA213小麥屬小麥(Triticum aestivum L.)4001ccgtgggatt agccgtccgc ggaaatgata cggccgccga atttctgctc gccgcgatgc 60gaccttggct tcgtgcggct gctgtctccg ggccggccgg gagaatctgc tggattgctt 120acccagttcg ctctgctgtt ggcctgtctg ttcctgattt gccgccgcgc cctaccgacc 180gaattcagca cctgaagact agctaatgga agtttttttt tccttaaaaa aaagttagca 240gcagctagcc gggatgcgtg ggcagaatgg cccggccgtg cggttgggac tatgcacgag 300tttgccgtgt cgacactcaa atcggatcgt aattgagtat tcccgtctag cgatattttc 360tactagtact attagcgata agataaacga atgggcgaga ggtgaagagg ggagcagccg 420tgctaatccg gacagctcag aggcggacaa ggacggggcg ccgatccagc ttcccttaat 480tttatcccga ccctggccgc aacgtgcggg ctatggtatg gtggtacgta cgcacggaag 540aagccgcgac gacgccttcc aagttccaac tcgcaggccc cgacaagccg acgcgcccga 600tggtttggcc cggtggtttc gtcccaaatt cccagccatc ttctcgctcg ctttcggccg 660ccatactagt cagcttcggg cggcggctac ttgctccccc acacggcgcg gccggccgtg 720cgggtccaac cagcacacgg cacacacggc ccgtccgtgc ccacgaagcg ccacctgacc 780atcctacccc tccttcgcac ctacgcgacg tccgtgcgtg ctccggcgcc cctctggatc 840cagcccagtt gacccttctc cccaccaccc gcggccacgg gcgtcgcacg tcgctcacgt 900ttcttccatg gagggcctaa acgggcgtgc ctttaccggc ctgcagcaca gccgtcgctt 960ttcgggggcg gccactgacc gaaacggagg gcagcgtcgc ccatttacgc gagcccccgg1020gtgacgcgag gccaaaaccg gaaatcccaa cccaagacgc ggagggagac ggcagctggg1080caggtcgtta tcgcccctcc tccagggagc gcgtccccgt ccgtctcccg cctagccctc1140ggcaccgata aaaagggccc cggtctcccc tccattcccc acccacgccc atccaattct1200cctctcggcc tctcctcctc tcctcgcatc ggcctcccga tccctcacag accacccgcg1260
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65 70 75 80Ala Glu Leu Ala Arg Pro Ala Val Asp Leu Ala Pro Ala Thr Glu Ala85 90 95Lys Pro Ala Arg Thr Ser Val Asn Arg Cys Ser Ser Cys Arg Lys Arg100 105 110Val Gly Leu Thr Gly Phe Arg Cys Arg Cys Gly Asp Met Phe Cys Gly115 120 125Glu His Arg Tyr Ser Asp Arg His Gly Cys Ser Tyr Asp Tyr Lys Ala130 135 140Ala Ala Arg Asp Ala Ile Ala Arg Asp Asn Pro Val Val Arg Ala Ala145 150 155 160Lys Leu Val Arg Phe16權利要求
1.植物抗逆鋅指蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的由(a)衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的植物抗逆鋅指蛋白，其特徵在於所述植物抗逆鋅指蛋白是由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質。
3.權利要求1或2所述的植物抗逆鋅指蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其特徵在於所述植物抗逆鋅指蛋白編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質的多核苷酸。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於所述植物抗逆鋅指蛋白編碼基因的編碼序列為序列表中序列1的自5′端第1355位至1852位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
6.根據權利要求3、4或5所述的基因，其特徵在於所述植物抗逆鋅指蛋白編碼基因，為如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物抗逆性相關的蛋白質的DNA分子。
7.含有權利要求3至6中任一所述的植物抗逆鋅指蛋白編碼基因的表達載體。
8.含有權利要求3至6中任一所述的植物抗逆鋅指蛋白編碼基因的轉基因細胞系。
9.含有權利要求3至6中任一所述的植物抗逆鋅指蛋白編碼基因的轉基因宿主菌。
10.權利要求3至6中任一所述的植物抗逆鋅指蛋白編碼基因在培育抗逆植物品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物抗逆鋅指蛋白及其編碼基因與應用。該植物抗逆鋅指蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的由(a)衍生的蛋白質。將該植物抗逆鋅指蛋白的編碼基因導入植物中，可提高植物對各種非生物脅迫逆境的抗性。
文檔編號C12N15/63GK1908011SQ20061011249
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月22日 優先權日2006年8月22日
發明者孫其信, 佟少明, 聶秀玲, 倪中福, 彭惠茹, 姚穎垠, 解超傑, 劉志勇 申請人:中國農業大學