一種產鐵載體類芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-12-02 05:05:51

一種產鐵載體類芽孢桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種產鐵載體類芽孢桿菌，該菌株為伊利諾伊類芽孢桿菌(Paenibacillus illinoisensis)，於2014年8月29日保藏中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：CGMCC No.9620。本發明菌株在限鐵培養基中可以產生鐵載體。在盆栽和大田條件下，用本發明的產鐵載體菌株的菌懸液在花生播種前浸種處理和生長期灌根處理後，在石灰性土壤中能明顯改善花生生長時期的鐵營養，並且能增加花生葉綠素含量，增強花生的根系活力，促進花生植株體內氮、磷、鉀的積累，提高植株生物量，改善花生品質，提高花生產量。CGMCC No.96202014.08.29
【專利說明】一種產鐵載體類芽孢桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產鐵載體類芽孢桿菌及其應用。

【背景技術】
[0002] 花生是中國重要的油料作物和經濟作物，中國北方地區是花生最大的栽培地區之 一。近年來，花生缺鐵性黃化病的發生越來越嚴重，這對花生的產量和質量都造成了很大 損害。目前人們防治花生缺鐵性黃化病主要是依靠農業防治和化學防治的方法，但農業防 治方法費時費力，而且很難從根源上有效防治病害的發生，化學防治方法對環境汙染大，並 且對人體健康也有一定的傷害。因此，利用生物學方法來防治花生缺鐵性黃化病的發生已 經逐漸成為人們關注的熱點，而找到對花生缺鐵性黃化病有很好防治作用的菌種資源是關 鍵，其中產鐵載體菌株的篩選和應用是目前微生物學工作者的研究熱點之一。
[0003] 鐵載體是微生物和部分植物在低鐵應激條件下合成的一類對三價鐵離子有高效 親和能力的低分子量（l_2kDa)有機化合物，它可以從各種水溶性和非水溶性的化合物中 奪走Fe3+。近幾年，產鐵載體微生物在植物方面的生防和促生作用越來越受到國內外研究 者的關注。很多研究成果討論了土壤微生物在植物根系吸收鐵中可能的作用機理，這種機 理可能包括以下幾種：（1)缺鐵植物根系分泌小分子有機化合物，如酚類和黃素類等化合 物，這些化合物可以作為抑菌劑和（或）直接作為微生物生長的碳源來改變植物根際微生 物的群落結構，並在植物根際形成特異性的微生物種群，這種特異性微生物種群就會通過 分泌鐵載體來增加土壤中有效鐵的含量，從而提高植株對鐵的吸收。（2) -些與植物根系共 生的微生物也會改善增強植物對鐵的吸收利用，比如根瘤菌（Rhizobium)可以通過結瘤作 用來增強植物鐵脅迫的生理響應；侵染根系的菌根真菌通過增加植物根系的養分吸收面積 和分泌對鐵載體來改善植物的鐵營養。
[0004] 目前，關於產鐵載體的假單胞菌和真菌在改善植物鐵營養和促生方面的報導較 多，但關於類芽孢桿菌對植物鐵營養的改善和促生方面的報導卻沒有。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種產鐵載體類芽孢桿菌及其應用，主要在花生鐵營養的改 善和促生方面的應用。
[0006] 為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現：
[0007] -種產鐵載體類芽孢桿菌，該菌株分類命名為伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)YZ29,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月29日， 保藏編號：CGMCC No. 9620。
[0008] 該菌株的菌落及菌體特徵為：本發明的產鐵載體類芽孢桿菌在LB平板培養基（酵 母浸膏，5g ;蛋白腖，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g;12rC滅菌20min ; PH7.0。）上培養24h後菌落呈圓形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑。菌體呈長杆狀， 大小為0· 5-0. 7X1. 2-2. O μ m，產芽孢，革蘭氏陽性。
[0009] 該菌株的生理生化特徵為：伏-普試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陰性，硝酸鹽還原 試驗陰性，D-葡萄糖發酵試驗陰性，甘露醇發酵試驗陰性，L-阿拉伯糖發酵試驗陽性，澱粉 水解試驗陽性，明膠液化試驗陽性，接觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性。
[0010] 上述產鐵載體類芽孢桿菌在改善花生鐵營養和促生方面的應用。
[0011] 所述產鐵載體類芽孢桿菌的應用方法，製備菌懸液，將上述菌懸液（濃度為 IO8Cfu ?ml/1，菌液體積為能浸沒所有種子）浸泡花生種子25-35min (優選30min)後播種； 或者在花生定苗後和開花前（或後）用菌懸液灌根；或者是將上述菌懸液浸泡花生種子播 種後，在花生定苗後和開花前（或後）用菌懸液灌根。
[0012] 所述菌懸液的濃度為IO8Cfu · mL'
[0013] 灌根時的用量為：盆栽試驗中每株25mL，田間試驗每株200mL。
[0014] 菌懸液的製備方法：將斜面保存的CGMCC9620轉接到裝有5-10mL(優選IOmL) 液體培養基（盆栽試驗為LB培養基；田間試驗為豆芽汁培養基）的試管中，放在恆溫 搖床中培養12-16h(優選12h)，溫度：37°C ;轉速：180-200rpm。將活化好的菌液按1% 接種量接入到l〇〇-2〇〇mL(優選200mL)培養基中，放入搖床培養24h，溫度：37°C ;轉速： 180-200rpm(180rpm)，然後8000rpm離心IOmin,棄去上清液，加入適量的無菌去離子水，制 成菌懸液。
[0015] LB培養基：酵母浸膏，5g ;蛋白腖，IOg ;氯化鈉，IOg ;蒸饋水，IOOOmL ;121°C滅菌 20min ;pH7. 0。
[0016] 豆芽汁培養基：黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾水，IOOOmL ; 121 °C滅菌 20min ;pH7.0。
[0017] -種生物防治菌劑，包括上述的伊利諾伊類芽孢桿菌（Paenibacillus illinoisensis)〇
[0018] 上述生物菌劑在改善花生鐵營養和促生方面的應用。
[0019] 本發明所產生的有益效果：
[0020] 經研究表明，在盆栽和大田條件下，用本發明的產鐵載體菌株的菌懸液在花生播 種前浸種處理和生長期灌根處理後，在石灰性土壤中能明顯改善花生生長時期的鐵營養， 並且能增加花生葉綠素含量，增強花生的根系活力，促進花生植株體內氮、磷、鉀的積累，提 商植株生物量，改善花生品質，提商花生廣量。
[0021] 本發明的產鐵載體類芽孢桿菌能明顯改善花生生長時期的鐵營養狀況，促進花生 生長。
[0022] 本研究篩選的CGMCC9620菌株在盆栽條件和大田條件下對花生鐵營養和促生效 果的研究，所採用的試驗方法和條件與已有的文獻報導相比，更貼近實際應用狀態（很 多報導研究的假單胞菌和真菌是在水培條件下驗證對花生的影響的，而不是在石灰性土 壤中），這也有力地說明了對花生鐵營養的吸收和促生方面的效果是很明顯的。另外， 目前未見關於類芽孢桿菌對植物鐵營養的改善和促生方面的報導，這說明本研究篩出的 CGMCC9620菌株豐富了防治花生缺鐵性黃化病的菌種資源。類芽孢桿菌是一種能夠形成芽 孢的細菌它比假單胞菌更容易在土壤中生存，比真菌生長速度快更容易發揮作用。

【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0024] 實施例1
[0025] -種產鐵載體類芽孢桿菌，該菌株分類命名為伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月29日，保藏 編號：CGMCC No. 9620。
[0026] CGMCC9620 篩選過程：
[0027] (1)分離和純化
[0028] 該菌種從花生根際土壤中分離篩選得到。
[0029] 土壤樣品採自山東省兗州市寨子窪（35° 44'N，116° 75'E)花生種植地。將花生 根際土壤小心抖落到無菌袋裡，放於低溫保鮮盒，帶回實驗室後立即進行處理。稱取根際土 壤樣品l〇g，放入90mL無菌水中，振蕩30min後製成土壤懸浮液。分別吸取ImL懸浮液，按 照10倍比例梯度稀釋後，各取1(Γ 4、1(Γ5和KT6倍稀釋液200yL塗布於牛肉膏蛋白腖平板 (牛肉膏，5g ;蛋白腖，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g ;121°C滅菌20min ; pH7. 2-7. 4)上，靜置IOmin後倒置於37°C恆溫培養箱中培養約24h。挑選代表性菌落於平 板上再通過三區劃線法純化，純化後的微生物分離物為：CGMCC9620,分離物保存於斜面中 備用。
[0030] (2) CGMCC9620產鐵載體性能的檢測
[0031] 將菌株用牙籤點接在CAS平板，在37°C恆溫培養箱中培養2-5d，觀察菌落周圍產 生橙黃色變色圈者為能夠產生鐵載體的菌株，若沒有形成變色圈說明菌株不能產生鐵載 體。
[0032] 所述CAS平板製備：
[0033] @取0.0128〇45(〇11'〇11163211〇1'18，北京瀛海精細化工廠）溶於1〇1]11^雙蒸水中，並 與2mLlmmol/L的FeCl 3溶液混勻，得溶液a ;
[0034] ②取 0· 015gHDTMA(Hexadeeyltrimethylammoniumbormide，北京索萊寶科技有限 公司）溶於8mL雙蒸水中，得溶液b ;
[0035] ③將a溶液緩慢加入b溶液中，充分混勻即得染液c ;
[0036] ④將 IOXMM9 鹽溶液（Na2HP0430g，KH2PO4L 5g，NaCl 2. 5g，NH4Cl 5g，雙蒸水 500mL)20mL，哌嗪二乙醇磺酸（pipes, Sigma公司出品）6. 04g加入盛有150mL雙蒸水的潔 淨三角瓶裡，混勻後用質量濃度為50% NaOH調節pH至6. 8,再加入瓊脂粉3. 2g，得培養基 d ；
[0037] ⑤將染液 c、培養基 d、及 lmmol/L CaCl2、lmmol/L MgSO4 · 7H20、質量濃度為 20% 葡萄糖、質量濃度為10%水解酪素分別滅菌（115°c，20min)後，置於50°C水浴鍋內保溫待 用；
[0038] ?分別量取上述1臟〇1/1〇3(：120.211^、1臟〇1/1]\%50 4*7!120 411^、質量濃度為20% 葡萄糖2mL及質量濃度為10 %水解酪素6mL加入培養基d中，再沿瓶壁加入染液c，充分搖 勻（勿產生氣泡），即得藍色定性檢測培養基。
[0039] 然後按每皿20mL倒入培養皿中，待凝固後備用。
[0040] CGMCC9620擴大培養方法：
[0041] 將斜面保存的CGMCC9620轉接到裝有IOmL液體LB培養基（酵母浸膏，5g ;蛋白腖， IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸饋水，IOOOmL ;121°C滅菌20min ;pH7. 0。）的試管中，放在恆溫搖床中 培養12h (溫度：37°C;轉速：180rpm)。將活化好的菌液按1%接種量接入到IOOOmL的盛有 200mL液體LB培養基或豆芽汁培養基（黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾水，IOOOmL ; 121°C滅菌20min;pH7.0。）的三角瓶中，放入搖床培養24h(溫度：37°C;轉速：180rpm)。
[0042] CGMCC9620 的鑑定
[0043] (1)菌落特徵及菌體形態
[0044] 該菌株的菌落及菌體特徵為：在LB平板培養基上（酵母浸膏，5g;蛋白腖，IOg;氯 化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g ;121°C滅菌20min ;ρΗ7· 0。）培養24h後菌落呈圓 形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑。菌體呈長杆狀，大小為（〇. 5-0. 7) μ mX (1. 2-2. 0) μ m，產芽孢，革蘭氏陽性。
[0045] (2)生理生化特徵
[0046] 伏-普試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陰性，D-葡萄糖發酵試 驗陰性，甘露醇發酵試驗陰性，L-阿拉伯糖發酵試驗陽性，澱粉水解試驗陽性，明膠液化試 驗陽性，接觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性。
[0047] (3)16S rDNA 序列分析
[0048] 16S rDNA基因序列，見序列表所示。將所測16S rDNA序列與GenBank資料庫中的 序列比對，結果表明：本發明的菌株與Paenibacillus illinoisensis(AB073192)同處於 一個最小分支上，其 16S rDNA 基因序列與 Paenibacillus illinoisensis (JQ579623)的菌 株序列相似度為99%，結合上述生理生化特徵結果，鑑定本發明的菌株為伊利諾伊類芽孢 桿菌（Paenibacillus illinoisensis) 〇
[0049] 為了明確CGMCC9620在花生鐵營養的改善和促生方面的應用，進行了如下試驗：
[0050] 盆栽試驗和田間試驗
[0051] 將斜面保存的CGMCC9620轉接到裝有IOmL液體培養基（盆栽試驗為LB培養基，田 間試驗為豆芽汁培養基）的試管中，放在恆溫搖床中培養12h (溫度：37°C ;轉速：ISOrpm)。 將活化好的菌液按1%接種量接入到200mL培養基中，放入搖床培養24h(溫度：37°C ;轉 速：180rpm)，然後8000rpm離心IOmin,棄去上清液，加入適量的無菌去離子水，製成濃度為 IO8Cfu · ι?Γ1的菌懸液。
[0052] 上述LB培養基：酵母浸膏，5g ;蛋白腖，IOg ;氯化鈉，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;121°C 滅菌 20min ;ρΗ7· 0。
[0053] 豆芽汁培養基：黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾水，IOOOmL ; 121 °C滅菌 20min ;pH7. 0。
[0054] 在播種前，將花生種子在IO8Cfu 的菌懸液中浸泡30min，取出種子，將表面的 水陰乾，播種。在花生定苗後和開花前再次用IO8Cfu · ml/1的菌懸液採用灌根法各施菌一 次，盆栽試驗中每株25mL，田間試驗每株200mL。對照組用等量無菌去離子水處理。在花生 各生育期（即幼苗期、開花下針期、莢果期和飽果期）測定花生葉片活性鐵含量和葉綠素含 量、根系活力、植株全氮磷鉀，收穫時統計相關產量因子。結果如下表所示。
[0055] 表1在盆栽試驗中各生育期不同處理組花生葉子的葉綠素含量和活性鐵含量的 差異
[0056]

【權利要求】
1. 一種產鐵載體類芽孢桿菌，其特徵在於，該菌株分類命名為伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月29日，保藏 編號：CGMCC No. 9620。
2. 如權利要求1所述的產鐵載體類芽孢桿菌，其特徵在於，該菌株的菌落及菌體特徵 為：在LB平板培養基上培養24h後菌落呈圓形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑；菌體 呈長杆狀，大小為0. 5-0. 7X1. 2-2. 0 μ m，產芽孢，革蘭氏陽性；所述LB平板培養基：酵母浸 膏，5g，蛋白腖，10g，氯化鈉，10g，蒸餾水，1000mL，瓊脂，15-20g，121°C滅菌 20min，ρΗ7· 0。
3. 權利要求1所述的產鐵載體類芽孢桿菌在改善花生鐵營養和促生方面的應用。
4. 權利要求1所述的產鐵載體類芽孢桿菌在改善花生鐵營養和促生方面的應用方法， 其特徵在於，製備濃度為108cfu · ml/1菌懸液，將上述菌懸液浸泡花生種子25-35min後播 種，所述菌液體積為浸沒所有種子為準；或者在花生定苗後、開花前或開花後用菌懸液灌 根；或者是將所述菌懸液浸泡花生種子播種後，在花生定苗後、開花前或開花後用菌懸液灌 根。
5. 如權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，灌根時的用量為：盆栽每株25mL，田間 每株200mL。
6. 如權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，將上述菌懸液浸泡花生種子30min。
7. 如權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述菌懸液的製備方法：將斜面保存的 CGMCC9620轉接到裝有5-10mL液體培養基的試管中，放在恆溫搖床中培養12-16h，溫度： 37°C，轉速：180-200rpm ;將活化好的菌液按1%接種量接入到100-200mL培養基中，放入搖 床培養24h，溫度：37°C，轉速：180-200rpm，然後8000rpm離心10min，棄去上清液，加入適 量的無菌去離子水，製成菌懸液； 所述液體培養基為LB培養基：酵母浸膏，5g，蛋白腖，10g，氯化鈉，10g，蒸饋水， 1000mL，121°C滅菌20min，pH7.0 ;或豆芽汁培養基：黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾 水，1000mL，121°C滅菌 20min，ρΗ7· 0。
8. -種生物防治菌劑，其特徵在於，包括權利要求1所述的伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)〇
9. 權利要求8所述的生物防治菌劑在改善花生鐵營養和促生方面的應用。
【文檔編號】A01P21/00GK104263684SQ201410499488
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】丁延芹, 杜秉海, 姚良同, 劉娣, 劉凱, 王文銅 申請人:山東農業大學