用於執行自動化離心分離的設備、系統和方法與流程
2023-12-01 18:07:56 2
本申請要求提交於2014年5月16日的標題為「用於執行自動化離心分離的設備、系統和方法(APPARATUS,SYSTEM AND METHOD FOR PERFORMING AUTOMATED CENTRIFUGAL SEPARATION)」的第61/994,728號美國臨時申請的優先權，所述美國臨時申請的全部內容通過引用併入本文中。
技術領域
本公開涉及流體的樣品製備、離心分離和微流體處理。
背景技術：
使用分子技術在全血樣品中進行病原體檢測需要產生目標核酸的懸浮液的樣品處理過程，所述懸浮液充分地不含PCR抑制劑、幹擾物和非目標核酸。樣品處理過程與所利用的擴增和檢測過程密切相關，且因而對目標微生物的敏感和特異檢測至關重要。例如，血細胞(大約1010/mL)大大超過全血中的目標微生物細胞的數目(大約為101CFU/mL)。因此，血細胞是大量背景DNA、PCR抑制劑、核糖核酸酶和螢光猝滅劑的來源。此外，因先前治療的感染，樣品中還可能存在死微生物和來自此類微生物的核酸。這對基於核酸的病原體檢測平臺強加了嚴格的功能性需求。
對全血樣品執行樣品製備的現有方法通常由以下步驟組成：(i)相對於目標微生物選擇性地或者非選擇性地使血液樣品經受溶解血細胞和微生物細胞的一些方法；(ii)移除或滅活抑制劑和幹擾物以進行PCR和檢測；以及(iii)移除非目標核酸或提高擴增和檢測策略以增加相對於目標微生物和活微生物與死微生物的特異性。
這些步驟通常單獨地或者組合地執行，並且根據下遊過程的耐受特性具有不同的效力水平。大多數現有病原體檢測平臺依賴於在使用PCR或RT-PCR擴增和檢測之前對目標核酸的提取和純化，且在涉及低病原體濃度的應用中不適合於自動化。
技術實現要素：
提供了用於樣品的自動化離心處理的系統、方法和裝置。在一些實施方式中，提供了一種集成式流體處理盒，其中離心室通過其橫向表面與微流體裝置以流體方式接口連接，以及其中所述集成式流體處理盒配置成插入到離心機中以進行離心。可採用盒接口組件來與集成式流體處理盒進行接口連接，以執行各種流體處理步驟(諸如，控制流體流入和流出離心室以及控制流體流入微流體裝置中，以及可選地對提取到微流體裝置的流體進行進一步流體處理)。集成式流體處理盒可包括：上清液室，上清液被提取到所述上清液室；以及稀釋液室，其用於稀釋離心室中所收集的懸浮液。
因此，在一個方面中，提供一種使用集成式流體處理盒來執行離心分離和微流體處理的方法；
集成式流體處理盒包括：
宏觀流體離心室，其中所述宏觀流體離心室的遠側區域配置成在離心力的施加下收集沉澱物；
微流體裝置，其具有內表面和外表面，其中所述內表面附接至宏觀流體離心室的橫向表面，以及其中微流體裝置包括配置成通過外表面致動的一個或多個流體部件；
其中沉澱物提取埠設置於宏觀流體離心室內，以及其中所述沉澱物提取埠通過橫向表面與微流體裝置的沉澱物提取通道流體連通以將沉澱物提取到微流體裝置；
所述方法包括：
將液體樣品提供於宏觀流體離心室內；
利用離心裝置對集成式流體處理盒進行離心，使得沉澱物被收集在遠側區域內；
在微流體裝置的沉澱物提取通道與宏觀流體離心室之間施加壓力差，使得包括至少一部分沉澱物的濃縮懸浮液流經沉澱物提取埠並流入微流體裝置中，由此將濃縮懸浮液轉移到微流體裝置；以及
通過經由外表面致動流體部件中的一個或多個來流體處理微流體裝置內的濃縮懸浮液。
在另一個方面中，提供了一種用於執行離心分離和微流體處理的系統，所述系統包括：
集成式流體處理盒，其包括：
宏觀流體離心室，其中所述宏觀流體離心室的遠側區域配置成在離心力的施加下收集沉澱物；
微流體裝置，其具有內表面和外表面，其中所述內表面附接至所述宏觀流體離心室的橫向表面，以及其中所述微流體裝置包括配置成通過所述外表面致動的一個或多個流體部件；
其中沉澱物提取埠設置於所述宏觀流體離心室內，以及其中所述沉澱物提取埠通過所述橫向表面與所述微流體裝置的沉澱物提取通道流體連通以將沉澱物提取到所述微流體裝置；以及
離心裝置，其包括：
轉子；以及
容器，樞轉地連接到所述轉子，其中所述容器配置成接收所述集成式流體處理盒使得當所述轉子處於靜止時所述外表面相對於所述轉子的旋轉軸被橫向地和向外地定向；
盒接口組件，其配置成當所述轉子處於靜止時與所述集成式流體處理盒可移除地接口連接；以及
控制和處理單元，其與離心裝置和盒接口組件可操作地接口連接，其中所述控制和處理單元配置成：
控制所述離心裝置以對所述集成式流體處理盒進行離心；
控制所述盒接口組件以當所述離心裝置處於靜止時使所述盒接口組件與所述集成式流體處理盒接口連接；
控制所述盒接口組件以促使在所述宏觀流體離心室與所述沉澱物提取通道之間施加壓力差，以將包括至少一部分沉澱物的濃縮懸浮液提取到微流體裝置上；以及流體處理微流體裝置上的濃縮懸浮液。
控制所述盒接口組件以致動一個或多個流體部件，從而流體處理微流體裝置上的濃縮懸浮液。
在另一個方面中，提供了一種用於執行宏觀流體分離和微流體處理的集成式流體處理盒，所述集成式流體處理盒包括：
宏觀流體離心室，其中所述宏觀流體離心室的遠側區域配置成在離心力的施加下收集沉澱物；
微流體裝置，其具有內表面和外表面，其中所述內表面附接至所述宏觀流體離心室的橫向表面，以及其中所述微流體裝置包括配置成通過所述外表面致動的一個或多個流體部件；
其中沉澱物提取埠設置於所述宏觀流體離心室的所述遠側區域內，以及其中所述沉澱物提取埠通過所述橫向表面與所述微流體裝置的沉澱物提取通道流體連通以將沉澱物提取到所述微流體裝置。
在另一個方面中，提供了一種微流體隔膜閥，其包括：
基底層，其具有形成於其表面中的埠；
微流體層，其具有第一表面和相對的第二表面，其中所述微流體層設置於所述基底層上使得所述第二表面附接到所述基底層的所述表面，
所述微流體層包括與閥座孔口流體連通的橫向微流體通道，其中所述閥座孔口定位於所述埠之上，以及其中所述閥座孔口延伸穿過所述微流體層；
粘附到所述微流體層的所述第二表面的膜，所述膜包圍所述閥座孔口；以及
柱塞，定位成接觸所述膜的外部表面，使得一旦將充分向內導引的力施加到所述柱塞後，所述柱塞便被接收於所述閥座孔口內且所述膜形成對所述埠的密封。
在另一個方面中，提供了一種使用集成式流體處理盒來執行離心分離的方法；
集成式流體處理盒包括：
宏觀流體離心室，其中所述宏觀流體離心室的遠側區域配置成在離心力的施加下收集沉澱物，以及其中上清液提取埠設置於所述宏觀流體離心室的遠側區域內；
上清液室，其具有形成於其中的上清液遞送埠；以及
微流體裝置，其具有內表面和外表面，其中所述內表面附接至宏觀流體離心室的橫向表面；
其中上清液提取埠通過橫向表面與微流體裝置的上清液遞送通道流體連通，以及其中上清液遞送埠通過橫向表面與微流體裝置的上清液遞送通道流體連通以將大部分的上清液從宏觀流體離心室提取到上清液室中；以及
所述方法包括：
將液體樣品提供於宏觀流體離心室內；
利用離心裝置對集成式流體處理盒進行離心，使得沉澱物被收集在遠側區域內；
在上清液室與宏觀流體離心室之間施加壓力差，使得上清液流經上清液遞送通道，由此將上清液轉移到上清液室。
對本公開的功能和有利的方面的進一步理解可以參考以下詳細描述和附圖來實現。
附圖說明
現將參考附圖僅通過舉例說明來描述實施方式，在附圖中：
圖1示出了用於利用集成式流體處理盒執行自動化離心和清洗的示例系統的示意圖。
圖2A至圖2C示出了用於離心和清洗的示例集成式流體處理盒的不同視圖。
圖2D示出了適合於在離心期間執行上清液提取的集成式流體盒的示例實施例。
圖3提供了示出用於執行自動化離心和清洗的示例方法的流程圖。
圖4A和圖4B提供了包括用於提取沉澱顆粒或其懸浮液的埠的示例集成式流體處理盒的實施方式的主視圖。
圖5是配置成用於從收集管直接提取樣品並隨口進行離心和清洗以獲得微生物細胞的經濃縮和純化的懸浮液的示例集成式流體處理盒的圖示。
圖6示出了裝備有旨在用於保留細胞的過濾器的通道的示意性橫截面圖。
圖7A是根據本公開的一個示例實施方式示出存在於溶解物質中的核酸的樣品製備、電溶解和多路復用分子檢測的方法的流程圖。
圖7B是根據本公開的一個示例實施方式的示出樣品製備的方法的流程圖。
圖7C是根據本公開的一個示例實施方式的示出樣品製備和電溶解的方法的流程圖。
圖7D是根據本公開的一個示例實施方式的示出樣品製備、電溶解和蛋白提取(可選地隨後進行MALDI-TOF分析)的方法的流程圖。
圖8是示例集成式流體處理盒的一部分的示意圖，其中提供附加流體部件以處理經分離和濃縮的微生物細胞。
圖9A至圖9B示出了熱處理室的各示例實施方式。
圖9C是與熱處理室一起使用的示例加熱器元件的圖示。
圖9D至圖9E示出了熱處理室陣列的各示例實施方式。
圖10A是示例集成式流體處理盒的圖示，其從等距視圖示出主橫向表面和後橫向表面。
圖10B是示出示例集成式流體處理盒的分解圖的圖示。
圖10C至圖10K是示例多層集成式流體處理盒的圖示，其示出主要層的細節。
圖11A至圖11I提供了閥和關聯的柱塞的示例實施方式的圖示。
圖12A至圖12B示出了埠和關聯的空氣置換機構的示例實施方式的圖示，其示出(A)橫截面圖和(B)俯視圖。
圖13A示出了集成式流體處理盒插入到容器中。
圖13B和圖13C示出了根據示例實施方式的吊桶式離心機。
圖14A和圖14B示出了涉及盒接口組件與容納在轉子中的集成式流體處理盒的接合的示例實施方式。
圖15A至圖15E示出了用於致動閥柱塞的替代性示例實施方式。
圖16示出了用於經由軌道式運動使集成式流體處理盒渦旋的機構的示例實施例。
圖17A至圖17C示出了示例閥閉鎖機構。
圖18A示出了支承於容器中的集成式流體處理盒的示例實施例。
圖18B至圖18C示出了盒接口組件的示例實施例，其中圖18C示出了盒接口組件與支承集成式流體處理裝置的容器的接合。
圖19示出了可以與盒接口組件可選地集成的示例光學系統。
具體實施方式
將參考下文所論述的細節來描述本公開的各實施方式和方面。以下描述和附圖為本公開的說明且將不被解釋為限制本公開。描述了許多具體細節以提供對本公開的各實施方式的全面理解。然而，在某些例子中，並未描述眾所周知的或常規的細節以提供對本公開的實施方式的簡潔討論。
如本文中所使用，術語「包括(comprises)」和「包括(comprising)」將解釋為具包含性的且為開放式而非排他式。具體來說，當用於說明書和權利要求書時，術語「包括(comprises)」和「包括(comprising)」及其變型意指包括具體的特徵、步驟或部件。這些術語將不解釋為排除其他特徵、步驟或部件的存在。
如本文中所使用，術語「示例性」意指「用作示例、例子或說明」，且不應解釋為優先於或優勝於本文中所公開的其他配置。
如本文中所使用，術語「約」和「近似」意指涵蓋可存在於所述值範圍的上限和下限中的變化，諸如性質、參數和尺寸方面的變化。除非另有規定，否則術語「約」和「近似」意指±25％或更少。
將理解，除非另有說明，否則任何指定的範圍或組都是所提及的單獨的範圍或組中的每個成員以及其中所涵蓋的每個可能的子範圍或子組和與其中的任意子範圍或子組相類似的情況的簡略形式。除非另有規定，本公開涉及且明確包含子範圍或子組的各個和每個具體成員和組合。
如本文中所使用，術語「大約」在結合數量或參數使用時是指跨越所規定的數量或參數的近似十分之一到十倍的範圍。
除非另有定義，否則本文中所使用的所有技術和科學術語旨在具有與本領域普通技術人員所通常理解的意義相同的意義。除非另有指定(諸如，通過上下文)，否則如本文中所使用以下術語旨在具有以下意義：
如本文中所使用，措辭「離心分離」是指對含微粒或固體材料的樣品流體進行離心的過程，藉以發生此類微粒或固體材料的沉澱，從而產生沉澱物。措辭「沉澱物」一般是指在施加離心力之後在離心裝置的遠側區域內收集的一種或多種顆粒。沉澱物的一個非限制性示例是一種或多種微生物細胞。沉澱物無需被收集在離心室的底表面處，而是可替代地形成於離心室的底部附近或在上清液與緩衝液體之間的界面處，如下文詳細描述。
如本文中所使用，措辭「清洗(wash)」和清洗(「washing)」是指涉及以下各項的過程：將稀釋液(或清洗液體/緩衝液)添加到固體或懸浮液樣品中；將稀釋液與樣品混合(可選地使沉澱物再懸浮)以獲得懸浮液；以及對懸浮液進行離心。
如本文中所使用，術語「微流體通道」是指具有小於1mm的橫截面尺寸的流體通道。
如本文中所使用，術語「微流體裝置」是指具有至少一個微流體通道的流體裝置。
如本文中所使用，術語「宏觀流體室」是指流體室或室，其中所述流體室或室的所有尺寸超過1mm，並且其中所述室的體積超過500微升。
用於離心和清洗的集成式設備
現參考圖1，提供了用於執行自動化離心分離或自動化離心分離與清洗的示例集成式系統100的圖示。示例系統100包括離心機110，所述離心機接收用於進行離心分離的一個或多個集成式流體處理盒120。離心機110包括連接到機動化轉子114且被配置成接收集成式流體處理盒120的一個或多個容器112。盒容器112例如可為實驗室離心機中常見的固定角類型或搖擺桶式類型(例如，每個容器112可樞轉地連接到機動化轉子114)。
盒接口組件(單元)130被配置成當機動化轉子114處於靜止時與集成式流體處理盒120可移除地接合(或接口連接)，以控制集成式流體處理盒120內的流體的流動。例如，可經由盒接口組件與集成式流體盒120之間的直接接口或例如經由離心機110上(例如，機動化轉子114或盒容器112上)的接口(例如，致動接口)來產生盒接口組件與集成式流體盒的接口連接。離心機110和盒接口組件130經由控制和處理單元140來控制。
如下文進一步詳細描述，每個集成式流體處理盒120包括用於在機動化轉子114旋轉期間進行離心分離的離心室。在一些實施方式中，離心室可為微流體室。在下文所描述的各示例實施方式中，離心室是能夠對超過500微升的流體體積執行離心分離的宏觀流體離心室。
集成式流體處理盒120可包含在集成式流體處理盒120容納在離心機110內時能夠從宏觀流體離心室移除上清液及可選地將所移除的上清液存儲在盒上的埠、導管、閥和室。集成式流體處理盒120還可包括在集成式流體處理盒120容納在離心機110內時能夠進行自動化清洗的埠、導管、閥和室。
圖2A至圖2C中示出了集成式流體處理盒120的示例實施方式的圖示，其中圖2A、圖2B和圖2C分別示出了俯視圖、主視圖和後視圖(圖2C示出裝置的外橫向表面)。在該實施方式中，集成式流體處理盒120包括宏觀流體離心室200、稀釋液室210和上清液室220。在所示的示例實施方式中，宏觀流體離心室200具有圓錐形或圓形底部形狀和平滑的內表面以便最小化在離心期間對沉澱微粒物質的吸收或俘獲。離心室200被定向於離心機轉子110中，使得離心力在室的圓錐形或圓形底部的方向上起作用。稀釋液室210包括稀釋液體，其組合物被選擇為符合最終介質(顆粒將被再懸浮到所述最終介質中)的要求，所述最終介質可由後續處理要求決定。稀釋液室210可具有使得能夠以最小殘留來提取清洗液體的圓錐形或收窄的底部尖端。可包括一個或多個附加的稀釋液室連同所需的導管和閥，以使得能夠在清洗過程中使用不同組合物的一種或多種稀釋液體。上清液室220可為空的，或可包括吸附劑材料(諸如，芯吸材料)。可採用上清液室來收集上清液，和/或上清液室可被用作廢液室。
在宏觀流體離心室200內通過以下步驟來執行懸浮液的自動化分離：對懸浮液中的微粒材料執行離心沉澱，隨後使上清液從宏觀流體離心室200流到上清液室220。可通過以下附加順序步驟來執行一次或多次清洗：使稀釋液體從稀釋液室210流入宏觀流體離心室200中；可選地將稀釋液與殘留上清液混合；執行離心；以及使上清液從宏觀流體離心室200流到上清液室220。如在下文所提供的附加實施方式中所描述，集成式流體處理盒可包括附加特徵和部件，諸如但不限於溶解室和/或對經清洗樣品進行後續處理和/或測定的一個或多個測定室或井。
在本公開的一些示例實施方式中，集成式流體處理盒被配置成以封閉式配置支持自動化離心分離和可選地稀釋/清洗。在本公開中，術語「封閉式配置」是指在流體處理期間防止從盒添加或移除液體的盒結構。然而，各種示例實施方式可採用通氣孔以及將空氣(或其他氣體)注射到盒中或將空氣(或其他氣體)從盒排空，可將具有足夠小的孔隙大小的透氣膜或過濾器放置在此類空氣路徑中以防止或最小化有害顆粒或流體的外出和汙染物或幹擾物的進入。
在圖2A至圖2C中所示的示例實施方式中，室與微流體裝置205接口連接，所述微流體裝置具有提供室之間的流體連接的內部流體通道。在下文所描述的各種示例實施方式中，微流體裝置205包括一個或多個微流體層，且具有內表面和外表面。在本示例實施方式中，內表面附接到宏觀流體離心室、稀釋液室210和上清液室220的橫向表面，如圖2A和圖2B中所示。微流體裝置205通過穿過室的壁形成的埠(孔、孔口或通孔)而與室流體連通。微流體裝置205包括通道(其可為微流體通道)，所述通道用於室與埠之間的流體流動從而允許流體式移至室中或允許流體式移出室。微流體裝置205還可包括用於控制流體流動的一個或多個閥。可由任何合適的流動機構產生流體流動。在一個示例實施例中，使用至氣體(例如，空氣)置換裝置的接口來產生集成式流體處理盒內的不同位置之間的流體流動，所述氣體置換裝置在室之間產生壓力差以用於由流體式移動引發的氣體置換。
在一個示例實施例中，室200、210和220可使用製造工藝各自地或者組合地由塑料材料(諸如但不限於，聚碳酸酯、聚丙烯、PET、聚苯乙烯、環烯烴、丙烯酸、聚乙烯、聚氨酯、PTFE、PEEK、PVC)形成，上述製造工藝諸如注射成型、鑄造、機械加工、3D列印或本領域技術人員已知的其他方法和材料。除成形過程之外，室200、210或220中的一些或全部可以可選地需要作進一步精加工或表面處理以確保平滑的低結合表面。此類精加工可通過各自地或者組合地使用各種過程(諸如，機械拋光，或用矽酮、非離子矽烷、導致表面呈疏水性的處理、導致表面呈親水性的處理、BSA、PEG、SAM或其他類似化合物對內表面的化學塗覆)經由塗覆過程、噴塗或本領域技術人員已知的其他方法(根據使用的工藝的需要而具有或不具有後面的固化步驟)來實施。所述室可經形成為擁有後表面，每個室具有形成於其中的一個或多個埠，所述埠通過微流體裝置205的內表面與微流體裝置的流體通道接口連接。
在旨在用於檢測全血(或例如，添加到培養介質的血)中的病原體微生物細胞的一個示例實施方式中，離心室、稀釋液室和上清液室的體積可分別在0.1-60mL、0.5-120mL和0.6-120mL的範圍中。稀釋液室和上清液室的更優選的示例範圍分別是0.5-10mL、1.5-20mL和1.5-20mL。根據各種示例實施例，取決於室的幾何結構和大小，可將其關聯的孔、埠和通氣孔的直徑選擇為在0.1mm-3mm的範圍中。根據各種示例實施例，導管的寬度可在0.1mm到3mm的範圍中變化。根據各種示例實施例，導管的高度可在0.025mm到1mm範圍中變化。
在一個示例實施例中，微流體裝置205可為由多個層形成的層壓結構，所述多個層包含流體通道(導管)、室和可外部致動的流體部件(諸如，可用於流體控制的閥和可透氣接口)。
可經由多種製造過程來形成微流體裝置。製造過程的非限制性示例包括注射成型、熱壓成形、微機械加工、衝壓、模切、軟刻蝕、雷射切割、水射流切割、繪圖切割機或本領域技術人員已知的其他方法。可由多種材料製成層，這些材料例如但不限於聚碳酸酯、PET、聚丙烯、PDMS、環烯烴、PMMA、光阻劑、矽片、玻璃、箔(諸如，鋁)或本領域技術人員中已知的其他材料。
可通過多種方法對微流體裝置205的構成層進行層壓來形成微流體裝置205，這些方法例如但不限於粘附劑結合、熱結合、超聲結合、或本領域技術人員已知的其他結合方法。另外，如本領域技術人員所已知的，所述層中的一些或全部層還可能可選地需要表面處理以提供附加性質，諸如低能量非結合、增強的親水性質或增強的疏水性質，以防止樣品內的化合物粘附到裝置的壁、或允許流體在室或通道中容易通過、或充當被動式流體控制元件。這些性質可以通過用化合物對材料進行化學處理來確立這些性質，這些化合物例如但不限於矽酮、矽烷、PEG、BSA或本領域技術人員已知的其他材料。微流體裝置205的內表面可結合到室的橫向表面以形成集成式流體處理盒120。在一些實施方式中，室的後表面是共平面的，且微流體裝置205的內表面是平面表面。
在替代性示例實施方式中，微流體裝置205的流體部件中的一些或全部可與室整體形成，由此形成具有橫向表面的中間裝置，且微流體裝置205的任何剩餘層可結合到所述橫向表面以形成集成式流體處理盒120。
在其他示例實施方式中，上清液室和稀釋液室(或多個)中的一個或多個可相對於集成式流體處理盒設置於外部，且在外部與集成式流體處理盒接口連接。例如，設置於離心室的橫向表面上的埠可包括流體連接器，所述流體連接器適合於與一個或多個外部稀釋液室、上清液室或其他外部流體儲存器(例如，外部溶解緩衝液、外部試劑和/或外部生長介質)形成流體連接(直接或間接地)。在一個示例實施例中，一個或多個外部室可設置於盒接口組件上(例如，容納或接納於盒接口組件內)，使得一個或多個外部室可與集成式流體處理盒可移除地流體式接口連接。在一個示例實施例中，如上所述，宏觀流體離心室內的埠可與微流體裝置流體式接口連接，且微流體裝置可包括流體連接器，使得宏觀流體離心室通過微流體裝置與外部室流體連通。在此類示例實施方式中，微流體裝置可包括一個或多個閥以可選地限制宏觀流體離心室與外部室之間的流體流動。
再次參考圖2A至圖2C中所示的非限制性示例實施方式，稀釋液室210和上清液室220各自通過微流體裝置205分別經由稀釋液遞送通道230和上清液遞送通道240連接到宏觀流體離心室200。稀釋液遞送通道230流體式連接到形成於宏觀流體離心室200的橫向壁中的稀釋液遞送埠252和形成於稀釋液室210中的稀釋液提取埠251，以將稀釋液從稀釋液室210遞送到宏觀流體離心室200。類似地，上清液遞送通道240流體式連接到上清液提取埠256和上清液遞送埠257，以將上清液從宏觀流體離心室210提取到上清液室220。
在圖2A至圖2C中所示的示例實施方式中，稀釋液室210和上清液室220各自還分別包含(可選地，可刺穿的)通氣孔270和275，所述通氣孔容納在微流體裝置205中且通過集成式流體處理盒的表面通氣到大氣壓力。在一個示例實施例中，可通過微流體裝置205的外橫向表面進入所述通氣孔中的一個。在另一個示例實施例中，可通過相應室的橫向表面進入所述通氣孔中的一個或多個，其中通氣孔位於橫向表面的未附接到微流體裝置的一部分中。在另一個示例實施例中，可通過相應室的上表面或下表面進入所述通氣孔中的一個或多個，其中所述通氣孔位於所述上或下表面中(與通過橫向表面相反)。室210和220還分別包含埠251和257，且可以以其他方式閉合。宏觀流體離心室200還與容納在微流體裝置205中且可通過集成式流體處理裝置的表面進入的埠260流體連通。宏觀流體離心室200還可包含埠256和252，且可以其他方式閉合。
在一個示例實施例中，可施加壓力差連同閥的協調致動，以實現到集成式流體處理裝置的室的液體轉移以及從集成式流體處理裝置的室的液體轉移。可由稀釋液控制閥250來控制稀釋液遞送通道230中的流動，所述稀釋液控制閥可位於沿稀釋液遞送通道230的任何位置處，但可優先地位於稀釋液提取埠251的近側。可由上清液控制閥255來控制上清液遞送通道240中的流動，所述上清液控制閥可位於沿上清液遞送通道240的任何位置處，但可優先地位於上清液提取埠256的近側。可通過微流體裝置205的外表面來致動閥250和255，如圖2C中所示。
在一個示例實施例中，可通過選擇性地打開稀釋液控制閥250和在埠260處相對於稀釋液室210選擇性地施加負差壓來實現從稀釋液室210到宏觀流體離心室200的稀釋液轉移。類似地，可通過選擇性地打開上清液控制閥255和在埠260處相對於上清液室220選擇性地施加正差壓來實現從宏觀流體離心室200到上清液室220的液體轉移。因此，可通過在宏觀流體離心室內的埠260處施加正或負表壓力結合選擇性地致動宏觀流體離心室與各個室之間的閥來控制集成式流體盒內的液體的移動。
在替代性實施方式中，通氣孔270和275可配置為空氣置換裝置(例如，或氣體置換裝置)可在此處接合的埠，且埠260可配置為空氣通氣孔。在這種情況下，可通過在埠270處相對於室200施加正差壓來執行從室210到室200的液體轉移，且通過在埠275處相對於室200施加負差壓來執行從室200到室220的液體轉移。閥250和255在這些相應的液體轉移操作期間打開且如果因其他原因或對於本文中所描述的操作模式是不需要的，則可以可選地從集成式流體處理盒省略掉。
流體式連接到埠260的空氣置換裝置(氣體置換裝置)(和/或可選地被配置成與埠270或275接口連接)例如可為注射泵、蠕動泵、波紋管泵或可以經由所連接的埠可控地遞送空氣或從盒移除空氣的任何其他泵或空氣置換裝置。將理解，在下文提供的示例實施方式中所描述的空氣置換裝置可採用空氣或任何其他氣體，以便由於集成式流體處理盒120的不同部分之間壓差的建立來誘發液體的流動。例如，在一些實施方式中，氣體源可與加壓裝置(例如，泵)接口連接以控制液體的流動。
在一些實施方式中，當集成式流體處理盒120處於靜止並處於盒接口組件130的控制下時，執行閥的打開和在埠260與通氣孔270或275之間施加壓力差，其中，當集成式流體處理盒120容納在離心裝置內時，所述盒接口組件可與微流體裝置205的外表面選擇性地接合，如下文將進一步詳細描述。在這種情況下，閥250和255可被配置成當盒接口組件130脫離接合時且當離心機110執行離心時處於封閉配置(下文提供了此類閥的示例)。
附加的閥(未示出)可設置在埠260與宏觀流體離心室200之間的流體路徑上，以便在可選的混合操作期間防止流體進入空氣路徑。另外或替代地，防止流體通過的可透氣膜可放置在宏觀流體離心室200與埠260之間的路徑中，以防止流體到達埠260。這個透氣膜還可被配置成用作過濾器，以防止空氣微生物從環境或空氣置換裝置的進入。替代地，埠260與宏觀流體離心室200之間的路徑可以設計成擁有高流體阻力，使得在佔上風條件下將防止液體一路前進到埠260。同樣，附加的閥、可透氣膜或高流體阻力導管可放置在室210與通氣孔270之間以及室220與通氣孔260之間以防止液體經由這些埠從盒的外出和/或病原體和其他汙染物經由這些埠的外出或進入。
在離心步驟期間，確保液體在室之間不流動通常將是重要的。應注意，如果埠252和257在離心期間分別保持高於室200和220中的液體的表面且閥255和250保持打開，那麼來自室200和210的液體將把通道240和230填充到相應室中的自由液面但液體將不分別流入室220和200中。因此，在一些示例實施例中，除非針對上述流體轉移模式或其他原因或操作模式是需要的，否則閥255和250可以可選地從盒中省略。
在一些示例實施例中，閥255和250可在離心期間閉合以防止液體分別進入通道240和230。在這種情況下，閥優選地被配置成與一個或多個閉鎖機構協作，使得當盒接口組件130不與盒120接合時閥保持閉合。應注意，在離心之前閉合所述閥中的一個或多個可能是優選的，因為高流體壓力可在通道240和230室以及200和210的遠側區域中發展。例如，由於高的離心速度，可出現在100psi、200psi或400psi或更大範圍中的壓力。因此，可以將室形成為使得可以承受住該壓力。用於承受住該壓力的室的適當材料和幾何結構對本領域技術人員將是已知的。然而，用於建構微流體裝置205的一些方法可能不能夠承受這些壓力，例如，利用壓敏性粘附劑結合的層壓物。因此，且根據所施加的離心力，可能有必要將閥定位在通向室的開口處以在離心期間防止流體退出室和進入導管。在此類情況下，在離心之前將液體從導管排空也可以為優選的。
當採用自鎖閥(例如，具有集成式閉鎖機構的閥，或被配置成由閉鎖機構致動的閥)時，可採用盒接口組件130以在盒接口組件130與集成式流體處理盒接口連接時根據需要主動地和選擇性地接合閉鎖機構以打開閥，且然後在從盒脫開之前閉合和重新鎖住閥以進行後續離心操作。一些閥和關聯的閉鎖機構可被配置成自鎖式，使得其在盒接口組件一脫離接合後便閉鎖到閉合位置中。
合適的閉鎖機構的非限制性示例包括：棘輪裝置，其將閥鎖定為閉合且被盒接口組件釋放以打開閥；或彈簧加載組件，其通過彈簧力保持閥閉合且由盒接口組件克服以打開閥。可由本領域技術人員針對本目的來調節此類機構和其他類型的已知閉合機構。閉鎖機構可集成到盒120中或可集成到被包括作為圖1中的離心機110的一部分的盒容器112中。
根據許多不同的實施方式和方法，可將樣品(例如，原始樣品或經預先處理的樣品)引入到集成式流體處理盒120中。在一個示例實施方式中，集成式流體處理盒120可包括可移除蓋或帽，該可移除蓋或帽可打開以將樣品引入到盒中，例如，直接引入到宏觀流體離心室200中，其中所述可移除帽或蓋可以氣密方式密封(例如，用O形環或其他合適的機構)。替代地，蓋或帽可包含可刺穿膜，可刺穿膜允許以針刺穿該膜並將樣品沉積到宏觀流體離心室中。該可刺穿膜應是可再密封的，且能夠將密封維持到可以在微流體離心室中維持上述可選的液體轉移實施方式所需的壓力的程度。替代地，該可刺穿膜可設置在盒120或微流體裝置205上的其他處，且裝備有導管以允許流動到離心室並且可選地裝備有切斷閥以在後續操作期間防止流體或壓力的損失。
在另一個示例實施方式中，最初可將樣品提供於集成式流體處理盒120內的另一個室中，例如樣品接收室中，並且在該室中根據本文中所描述的閥調和流致動方法可將樣品可控地引入到宏觀流體離心室中。用於將樣品引入到集成式流體處理盒120中的另外的替代性示例實施方式示出於圖5中且下文予以進一步詳細描述。
在離心分離和可選地清洗操作後，可以類似方式通過打開可移除蓋或帽並使用注射器、移液管或其他裝置從宏觀流體離心室抽出最終樣品來移除所沉澱的樣品。同樣，可刺穿膜可設置於蓋上以允許使用針和注射器或其他抽吸裝置來移除最終樣品。
在引入樣品之前，可利用緩衝液、稀釋液、清潔劑或其他專門調配的樣品預處理溶液預填充宏觀流體離心室200。樣品預處理溶液可以是包含用於使樣品的一種或多種雜質或其他組分改性的一種或多種組分或活性劑的溶液或緩衝液。例如，樣品預處理溶液可對樣品起作用以用於對可能駐留在樣品內的雜質或其他組分的移除、失活、消化或其他改性。在另一個實施方式中，所需的組分以乾燥形式包括在室中，且在將液體樣品引入到宏觀流體離心室後，這些組分立即溶解於液體樣品中。
在其他示例實施方式中，最初可將該預處理液體提供於集成式流體處理盒120內的另一個室中，例如預處理存儲室中，並且在預處理存儲室中根據本文中所描述的閥調和流動致動方法可將預處理液體可控地引入到宏觀流體離心室中。
在另外的實施方式中，在將樣品引入到盒中之前，可將樣品預處理溶液與樣品預混合。如在2013年11月26日提交的標題為「用於微生物樣品的預處理的設備和方法(APPARATUS AND METHOD FOR PRE-TREATMENT OF MICROBIAL SAMPLES)」的第PCT/CA2013/000992號PCT專利申請中所描述的，樣品預處理液體的示例是血溶解液體，所述申請通過引用整體地併入本文中。
在又另一個示例實施方式中，可將預處理溶液從外部室引入到宏觀流體離心室中，所述外部室經由流體連接器與集成式流體處理盒流體式接口連接，如本文中其他處所描述。
再次參考圖1，其示出了控制和處理單元140的示例實施例。控制和處理單元140可包括：一個或多個處理器145(例如，CPU/微處理器)；總線142；存儲器155，其可包括隨機存取存儲器(RAM)和/或只讀存儲器(ROM)；一個或多個內部存儲裝置150(例如，硬碟驅動器、緊湊光碟驅動器或內部快閃記憶體)；電源供應器180；一個或多個通信接口160；外部存儲器165；顯示器170；以及各種輸入/輸出裝置和/或接口175(例如，接收器、發射器、揚聲器、顯示器、輸出埠、用戶輸入裝置(諸如，鍵盤、小鍵盤、滑鼠、位置跟蹤觸筆、位置跟蹤探針、腳踏開關和/或用於捕獲語音命令的麥克風))。
儘管圖1中僅示出了每種部件中的一個，但任何數目的每種部件可以包括在控制和處理單元140中。例如，計算機通常包括多個不同的數據存儲媒體。此外，儘管總線142被描繪為所有部件之間的單個連接，但應了解，總線142可表示連結兩個或兩個以上部件的一個或多個電路、裝置或通信通道。例如，在個人計算機中，總線142通常包括母板。
在一個實施方式中，控制和處理單元140可以是或包括通用計算機或任何其他硬體等同物。控制和處理單元140還可實現為通過一個或多個通信通道或接口聯接到處理器145的一個或多個物理裝置。例如，可以使用專用集成電路(ASIC)來實現控制和處理單元140。替代地，可以將控制和處理單元140實現為硬體與軟體的組合，其中軟體從存儲器或通過網絡連接被加載到處理器中。
可用一組指令來程序化控制和處理單元140，當在處理器中執行時，所述一組指令導致系統執行本公開中所描述的一種或多種方法。控制和處理單元140可包括比示出的部件更多或更少的部件。
儘管已在全功能計算機和計算機系統的環境下描述了一些實施方式，但本領域技術人員將了解，各種實施方式能夠以多種形式分布為程序產品且能夠被應用，而不管實際上用於實現分布的機器或計算機可讀介質的特定類型如何。
計算機可讀介質可以用來存儲軟體和數據，當由數據處理系統執行時，所述軟體和數據導致系統執行各種方法。可以將可執行軟體和數據存儲在各個位置中，包括例如ROM、易失性RAM、非易失性存儲器和/或高速緩衝存儲器。可以將該軟體和/或數據的多個部分存儲在這些存儲裝置中的任一者中。通常，機器可讀介質包括以機器(例如，計算機、網絡裝置、個人數字助理、製造工具、具有一組一個或多個處理器的任何裝置等)可訪問的形式提供(即，存儲和/或傳輸)信息的任何機構。
計算機可讀介質的示例包括但不限於可記錄和不可記錄類型的介質，諸如易失性和非易失性存儲器裝置、只讀存儲器(ROM)、隨機存取存儲器(RAM)、快閃記憶體裝置、軟盤和其他可移除式磁碟、磁碟存儲介質、光學存儲介質(例如，光碟(CD)、數字通用光碟(DVD)等)。可以將指令具體化在用於電、光學、聲學或其他形式的傳播信號(諸如，載波、紅外信號、數位訊號等)的數字和模擬通信鏈路中。
本公開的一些方面至少可以部分地具體化在軟體中。也就是說，可以在計算機系統或其他數據處理系統中響應於其處理器(諸如，微處理器)正執行包含在存儲器(諸如ROM、易失性RAM、非易失性存儲器、高速緩衝存儲器、磁碟和光碟或遠程存儲裝置)中的指令序列來實施所述技術。此外，可以通過數據網絡以編譯和連結版本的形式將指令下載到計算裝置中。替代地，執行如上文所論述的過程的邏輯可在附加的計算機和/或機器可讀介質中實現，諸如作為大規模集成電路(LSI)的離散硬體部件、專用集成電路(ASIC)或固件(諸如，電可擦可編程只讀存儲器(EEPROM)和現場可編程門陣列(FPGA))。
現參考圖3，其提供了示出使用圖2A至圖2C中所示的集成式流體處理盒實施方式來執行樣品的自動化離心分離和清洗的示例方法的流程圖。應理解，本示例方法僅示出了一種非限制性示例方法，且根據本公開的教導可採用多種其他方法(例如，不需要如上所述的閥的方法，或在離心期間不需要閉鎖閥的方法)。根據本示例實施方式，閥250和255被配置成當未由盒接口組件130的閥致動機構接合時被閉鎖在閉合配置中。下文詳細地描述了描述此類閥的操作的具體示例實施方式。
在300處，根據本公開中所描述的各種方法中的一種，最初將樣品添加到宏觀流體離心室200中，諸如通過宏觀流體離心室200中的可移除蓋或帽直接添加，或通過從與集成式流體處理盒120接口連接的樣品室提取，如下文所提供的示例實施例中所描述。不需要盒上的流體轉移的該操作和後續操作可選地利用處於閉合狀態的閥250和255來執行，以防止樣品進入導管230和240。閥的這種閉合狀態可通過對盒接口組件130進行控制以使得閥被主動致動為閉合狀態或如果閥處於鎖閉的閉合類型則致動機構使閥處於鎖閉的閉合狀態來實現。在將樣品添加到宏觀流體離心室200之後，可以可選地將樣品與可選地預處理液體進行混合(如305處所示)，其中預處理液體可存在於宏觀流體離心室中或在此步驟期間被引入到宏觀流體離心室中。可通過多種機制來提供此類混合，諸如離心機110的循環或隨機旋轉運動、可構建到離心機中或能夠與離心機110和/或集成式流體處理盒120可移除地接合的振動機構。此運動可為軌道式，其具有例如在1mm到10mm的範圍中的軌道直徑和在60RPM到2000RPM的軌道速度。所述運動也可為非圓形的或線性的，並且可僅應用在盒或盒容器的一端處或一端附近，所述盒或盒容器在相對端處或附近以其他方式支承在鉸鏈機構上。還可通過用於循環地倒轉或部分地倒轉集成式流體處理盒的倒轉機構來執行混合。可將混合機構集成於與盒適當接合的盒接口組件130、機動化轉子或包括在機動化轉子中的盒容器中，以賦予集成式流體盒或包含盒的盒容器循環倒轉或部分倒轉。倒轉可以為使得離心室被定向成其頂表面面向下且其軸垂直或被定位成與垂直軸成角度，所述角度在與垂直成0到90度的範圍中。
在可選的混合後，執行離心沉澱310，從而由離心機110對集成式流體處理盒120進行離心，使得宏觀流體離心室200中的微粒物質(例如，諸如微生物細胞的細胞)被沉澱。應理解，離心是在不接合盒接口組件130的情況下執行的，使得離心機110的機動化轉子114可旋轉，且使得閥250和255被閉鎖在閉合配置。
適合於沉澱的機動化轉子114的旋轉速度將取決於與待離心的樣品相關聯的多個參數。例如，第PCT/CA2013/000992號PCT專利申請中提供了用於對在藉助於樣品處理溶液溶解了血細胞之後從血液樣品獲得的微生物細胞進行離心的適當參數。本領域技術人員可以使用目標微粒性質、懸浮液流體溶液性質和轉子幾何結構的知識來確定用於實現微粒的期望沉澱的適當速度和時間。替代地，可以憑經驗確定沉澱速度和時間。在一些實施方式中，期望沉澱液體中的所有或大體上上所有目標微粒，且將沉澱參數選擇為使得所有此類顆粒能夠越過上清液提取埠256到達離心機室的區域或可選地在離心期間到達離心機中的最遠徑向範圍。替代地，在懷疑樣品包含具有不同沉澱係數(由於大小或密度上的差異)的微粒的情況下，可能期望保留具有在期望範圍中的沉澱係數的一部分微粒，並且將沉澱參數選擇為使得此部分微粒能夠越過上清液提取埠256進入到離心室的區域中。
在離心沉澱後，提取了一部分所得到的上清液。在提取上清液之前，允許機動化轉子114靜止下來，且通過微流體裝置205將盒接口組件130與集成式流體處理盒120接合併打開閥255，如315處所示。盒接口組件130還將空氣置換裝置與埠260接合併致動所述空氣置換裝置以在宏觀流體離心室200與通氣的上清液220之間產生正壓力差，從而導致將上清液從宏觀流體離心室200提取到上清液室220，如320處所示。因此，通過上清液提取埠256和上清液遞送通道240發生由空氣置換誘導的上清液流動。可至少近似地通過由空氣置換裝置將等同體積的空氣置換到宏觀流體離心室中來控制由此從宏觀流體離心室200移除的上清液的體積。替代地，可執行將空氣置換到宏觀流體離心室中，直到上清液液面到達上清液提取埠256並且不再可以移除上清液為止。通常，在此操作中必須置換的空氣體積可以根據離心室中的已知液體體積來預定。在後一種情況下，從微流體離心室移除的上清液的體積或替代地保留在宏觀流體離心室中的上清液的體積由離心室中的上清液提取埠256的位置來確定。
在涉及清洗和使經清洗的沉澱物再懸浮的示例實施方式中，針對上清液提取埠256的位置的一些考慮因素可以是在每次清洗之後或在最終的微粒再懸浮步驟342之後所需的殘留上清液的體積和下文更詳細地論述的所需清洗稀釋因數。針對上清液提取埠256的合適位置的另一個考慮因素是上清液的提取不幹擾沉澱的顆粒，例如由於由離開上清液提取埠256的流造成的水動力，所述水動力可使所有或一部分沉澱微粒再懸浮。
在上清液提取後，可通過如342處所示的混合操作使沉澱的微粒物質再懸浮到殘留流體中，並如345處所示進行收集而無需任何清洗步驟。對殘留流體(本文中稱為最終微粒懸浮液)中的再懸浮顆粒的收集可通過移液管或注射器經由離心室200上的可打開帽或可刺穿膜來完成。下文論述替代性實施方式，其中離心室中的附加打開允許以與上文所論述的上清液移除類似的方式來移除最終微粒懸浮液。
在一些實施方式中，需要一個清洗操作或一連串清洗操作，為此可如325處所示將一定數量的稀釋液體從稀釋液室210分配到宏觀流體離心室200。將閥255閉合且將閥250打開，從而使宏觀流體離心室200與稀釋液室210流體連通。通過使空氣置換機構連接器與埠260接合併將空氣從宏觀流體離心室200可控地排空來將稀釋液體分配到宏觀流體離心室200中，如330處所示。因此，由空氣置換誘導的稀釋液體的流動通過稀釋液遞送通道230發生。稀釋液提取埠251的位置(稀釋液遞送通道230在該位置處進入宏觀流體離心室200)優選地定位成高於在宏觀流體離心室內所實現的液面的最高程度。
在分配稀釋液體後，根據需要可選地接合盒接口組件130以進行混合操作(示於332處)，以使沉澱微粒物質再懸浮並在宏觀流體離心室200中將殘留上清液與稀釋液體混合。
在可選的混合步驟後，如335處所示，盒接口組件脫離接合，且再次執行離心沉澱以使微粒材料再沉澱，如310處所示，且使盒接口組件與盒再接合，如315處所示。如在320處，在已移除上清液後，清洗循環被認為已執行完。如果需要單次清洗循環，那麼可使沉澱的微粒物質再懸浮到殘留液體中，如342處所示，並將其收集為濃縮懸浮液，如345處所示。替代地，可通過重複一次或多次325至335和310至320來執行一個或多個附加清洗循環。可由可與所需稀釋因數有關的性能要求來確定所需的清洗循環次數。可由在圖3的步驟320之後離心室中剩餘的上清液的殘留體積(VR)以及在步驟330中被分配到宏觀流體離心室中的稀釋液的體積(VD)根據DF＝(VD+VR)/VR來計算清洗循環稀釋因數DF。
如上文所提及，集成式流體處理盒120的各室之間的流體路徑或導管利用閥可控地打開和閉合。儘管在本文中提供的許多示例中示出了閥的具體示例，但應理解，閥可採用與裝置上的流體路徑或埠相容的任何適當機構，包括但不限於夾管閥、球閥、隔膜閥、圓盤閥和旋塞閥。下文提供具體閥的示例實施例。
在替代性實施方式中，可在離心期間致動集成式流體處理盒120的室之間的流體轉移。例如，可採用離心誘發壓力來執行此類實施方式，以通過上清液提取埠256和上清液遞送通道240將上清液擠出到上清液室220。在足夠量的時間(在此期間，發生離心同時閥255打開)之後，最初高於上清液提取埠256的上清液表面將到達上清液提取埠256的底部的液面且上清液轉移將完成。然後，可將閥255閉合以進行後續處理步驟。
對於該實施方式，上清液遞送通道240、上清液遞送埠257和上清液室220中的液體的自由液面必須都具有等於或大於宏觀流體離心室200中的上清液的自由液面的最終離心半徑的離心半徑位置。圖2D中示出了該實施方式的示例實施例，其中上清液室定位在宏觀流體離心室200下面，使得上清液遞送埠257A在離心期間具有大於上清液提取埠256的離心半徑。這個實施方式可以是有益的，因為沉澱的顆粒在上清液的提取期間將由離心力穩固地保持，且由退出的上清液流產生的水動力幹擾沉澱物的風險較小。這可允許在機動化轉子114處於靜止時在宏觀流體離心室200內將上清液提取埠256放置得比在如先前所描述的移除上清液時的情況下更低。上清液提取埠256的更低的位置將產生更低的殘留上清液體積和高的清洗效率，並且也可實現高度濃縮懸浮液。
在該實施方式中，在離心期間可控地致動閥255。該可控致動可通過使用容納在機動化轉子114內的電磁鐵致動器以電磁方式來實現，所述電磁鐵致動器經由諸如滑環的旋轉接口機構外部連接到控制器(例如，控制和處理單元140，或與控制和處理單元140接口連接的電控制器)。在其他實施方式中，可在離心期間經由駐留在離心機110上的氣動致動機構來致動閥，其中所述氣動致動機構經由流體旋轉接頭與外部氣動壓力源接口連接。
在另一個示例實施例中，使用準許在離心期間在室之間施加壓力差的機構將集成式流體盒接納於容器內，而無需使機動化轉子靜止下來。在通過避免與使機動化轉子停止並使集成式流體盒與盒接口組件對準有關的時間來減少總處理時間方面以及對於避免需要使盒接口單元與集成式流體盒對齊來說，該實施方式可以是有益的。可將機動化轉子控制為在將壓力差施加於室之間期間(及在閥致動期間)減小其旋轉速度，以減小通道內的離心力。應理解，其他非流體部件，諸如，光學檢測系統，可附加或替代地與機動化轉子集成。
例如，泵機構可與機動化轉子或容器集成，並且其中泵與外部控制器電接口連接(例如，通過電滑環)，使得可以在機動化轉子旋轉期間致動和控制泵。泵應構建和定向成承受在高速旋轉期間的離心力。替代地，可採用經由流體旋轉接頭與盒接口連接的外部空氣置換泵機構(其中空氣可選地包括一個或多個閥)。
圖4A和圖4B示出了示例實施方式，其中提供附加流體路徑以用於將最終顆粒(細胞)懸浮液轉移到微流體裝置，以在離心分離和清洗後供進一步處理。在圖4A中，提供使沉澱物提取埠281與微流體裝置連接的沉澱物提取通道282並經由沉澱物提取控制閥280來控制沉澱物提取通道281，所述沉澱物提取埠駐留在宏觀流體離心室200的遠側區域中(例如，在宏觀流體離心室的底部，或在與遠側區域內的沉澱物的沉澱相關聯的另一個位置處)。沉澱物提取通道282可例如通向微流體裝置中的存儲室以進行後續收集或處理，或通向被設計成用於通過外部構件來收集樣品的退出埠。
替代地，在圖4B中示出，沉澱物提取埠281在宏觀流體離心室的底部之上而在上清液提取埠256之下偏移一定高度駐留在宏觀流體離心室200內。該示例實施方式允許移除最終顆粒懸浮液的頂部部分。
在一個示例實施例中，沉澱物可包括一種以上類型的顆粒，且第一顆粒子集可具有大於第二顆粒子集的大小。在一些應用中，可能期望將(至少一部分的)第二組顆粒從第一組顆粒中分離出來。可以預定的速度對在再懸浮步驟342之後獲得的懸浮液進行預定時間長度的離心，使得具有更高的沉澱率的第一組顆粒移動到沉澱物提取埠281下面的位置，從而使得可在沉澱物提取埠281處移除不含這些顆粒的顆粒懸浮液。
可在離心室的遠側區域與上清液提取埠256之間引入附加的開口、閥和流體導管，使得可以通過從最高到最低的這些開口來執行一連串提取，以從最終顆粒懸浮液的每個相應液面獲得一系列顆粒懸浮液，從而可選地允許對分餾的懸浮液進行提取和可選的收集。可選地，在最終顆粒再懸浮步驟342後，可執行受控的離心步驟，從最高到最低開口的所述一連串提取將產生一系列顆粒懸浮液，所述顆粒懸浮液包含顆粒沉澱率不斷增大的顆粒。
在另一個實施方式中，沉澱物提取埠281可定位成恰好高於緩衝液體的彎液面，所述緩衝液體被配置成保留分離的顆粒(諸如，微生物細胞)。下文參考圖5來更詳細地論述該實施方式。
儘管本文中所描述的許多示例實施方式採用包括上清液室和稀釋液室的集成式流體處理盒，但應理解，其他示例實施方式、集成式流體處理盒可不具有這些室中的一個或多個。例如，集成式流體盒可包括宏觀流體離心室而缺少上清液室和稀釋液室，其中所述宏觀流體離心室通過其橫向表面與微流體裝置接口連接。可採用這種裝置來執行對樣品的離心分離和將沉澱物提取到微流體裝置中，可選地，用於在其中進行進一步流體處理。在另一個示例實施方式中，集成式流體處理盒可包括宏觀流體離心室而缺少稀釋液室，其中所述宏觀流體離心室通過微流體裝置與上清液室流體式接口連接，以在離心之後將上清液從沉澱物中分離出來。這種實施方式在上清液是進行進一步流體處理的感興趣組分的應用中可以是有用的。在這種實施方式中，上清液室可通過設置於其中的埠與微流體裝置流體式接口連接，以將上清液提取到微流體裝置以及用於在其中進行可選的附加流體處理。
在一些實施方式中，集成式流體處理盒120可包括用於在操作期間檢測液面、壓力和/或液體流動的一個或多個集成式傳感器。此類實施方式在內部過程進行控制時在驗證系統性能方面是有用的。在一個示例實施例中，可將一個或多個電極放置在存在於集成式流體處理盒120內的各室中的任何一個或多個內。例如，可將多個電極放置在沿宏觀流體離心室200的長軸的不同位置處，且可相對於參考電極或參考電壓來詢問這些電極以確定給定電極是否接觸液體，由此使得能夠檢測室內的離散液面。一個或多個電極可位於多個位置處，諸如高於與通過上清液提取埠256提取上清液之後所保留的殘留液體相關聯的彎液面。電極還可鄰近於埠260定位或位於埠260的緊下方，以提供關於埠260是否被液體汙染的指示。電極可位於宏觀流體離心室200中的指示存在足夠量的樣品和/或稀釋液的期望液面處。可在宏觀流體離心室中將參考電極放置得充分低，使得參考電極總是浸沒在宏觀流體離心室中的殘留液體中且使得可通過各電極與參考電極之間的連續性或電阻測量值來檢測以上液面。
當盒接口組件130與盒120或容器112接合時，可在流體轉移期間監控所感測到的電信號。還可在離心期間根據多種轉換方法和機制中的任一種來監控電信號，例如：隨機動化轉子114旋轉並將光學信號發射到不旋轉的固定轉發器(和可選地從固定轉發器可選地接收光學信號)的光學轉發器、一對無線收發器(其中的一個隨機動化轉子114旋轉)、或通過電滑環產生的與控制和處理單元140的電連接。可執行阻抗測量以測量或表徵給定室內的液體的一個或多個方面，例如以驗證宏觀流體離心室200內的血細胞的溶血。另外或替代地，一個或多個壓力傳感器可設置於集成式流體處理盒120內，以在機動化離心機旋轉期間動態地詢問集成式流體處理盒120內的壓力。
在其他示例實施例中，可使用在旋轉期間獲得集成式流體處理盒的圖像(使用幀率充分快的相機)的外部成像相機來順序液面感測，其中所述成像相機可選地同步成在集成式流體處理盒120處於給定的角位置中時周期性地獲得幀(可選地每n次旋轉獲得一個圖像，其中n>1)，由此使得能夠動態追蹤液面和液體輸送。為了以充分的清晰度實現成像，暫時降低轉子的旋轉速度可以是有益的。在其他示例實施方式中，可通過將一個或多個光束(例如，聚焦或準直雷射束)引導至盒上並監控反射信號以確定光束何時遇到集成式流體處理盒內的液體來獲得液面。可以可選地掃描此類光束，以對集成式流體處理盒的各區域取樣從而用於進行液面檢測。
根據上述示例實施方式，上述液面感測示例實施方式對監控上清液或其他流體在離心期間的轉移也可能是有用的，且可採用所感測到的液面來控制閥的閉合和/或室之間的壓力差的施加。
參考圖5中的示例示意性表示，示出了示例集成式流體處理盒500，其包括適合於自動化分離和清洗液體中的顆粒以獲得濃縮懸浮液(例如，根據第PCT/CA2013/000992號專利申請所公開的方法)的元件。所述示例集成式流體處理盒包括樣品轉移容器501、宏觀流體離心室502、稀釋液室504和上清液室506。稀釋液室504預填充有清洗緩衝流體505、經由裝備有切斷閥512的導管510流體連接至宏觀流體離心室502、包含通向大氣515的通氣孔且以其他方式閉合。上清液室506經由裝備有切斷閥513的導管511流體連接到宏觀流體離心室502、包含通向大氣516的通氣孔且以其他方式閉合。宏觀流體離心室502具有圓錐形或圓形底部形狀和平滑的內表面且在除了通向相應導管的開口522、523、524、525、526之外是閉合的，其中平滑的內表面最小化在離心期間對顆粒(例如，微生物細胞)的吸收或俘獲。
在一些示例實施方式中，宏觀流體離心室可用於處理含血樣品(例如，全血、血培養樣品或其他含血樣品)。在此類實施方式中，宏觀流體離心室可包括預處理流體503以及緩衝流體529，預處理流體503可包括用於溶解血細胞的試劑，緩衝流體529用於輔助微生物細胞恢復和最小化細胞的壓實損傷，而壓實損傷可能損害目標核酸的完整性和恢復。
緩衝流體具有比流體的剩餘部分更高的密度且與水不混溶，使得其在重力和離心力作用下沉降到宏觀流體離心室的底部。樣品轉移容器裝備有安裝在容器底部的針507。針連接到流體路徑508，所述流體路徑裝備有通向宏觀流體離心室502的切斷閥509。可將具有可刺穿帽521的樣品管或容器520(諸如，採血管或包含血液樣品和生長介質的血液培養管)插入到樣品轉移容器中使得針507刺穿帽521，因此允許經由針和流體路徑508將樣品流體轉移到盒中。可選地，針507覆蓋有保護針免受汙染的可刺穿罩508。
示例集成式流體處理盒500是封閉式盒(除了下文所描述的通氣孔之外)，在插入樣品後，其執行用於分離和清洗在盒的室和導管內的濃縮懸浮液所需的所有功能、使所有試劑和溶液存儲在盒上的室中且將所有過量液體(包括廢棄的上清液)保留在盒上的室中。可由具有一定孔隙大小的可透氣膜來保護通氣孔和埠中的一個或多個，所述孔隙大小足夠小以防止微生物病原體進入裝置的目標範圍中。根據本示例實施方式，所有過量和廢棄的液體被存儲在盒上且並未暴露給用戶。因此，封閉式盒提供這樣一種裝置，其保護用戶以免直接接觸樣品且在分離和清洗過程期間樣品不易受因外部因素引起的汙染的影響。
如上文所提及的，大體上在圖3中示出了自動化分離和清洗過程。如大體上在圖1中所示，盒被插入到裝備有必要裝置和功能(包括盒接口組件)的儀器中。盒接口組件裝備有執行必要動作所需的所有部件，所述動作包括盒閥509、512、513和517以及空氣置換裝置的致動，所述空氣置換裝置能夠經由盒埠518將正表壓力和負表壓力兩者施加到盒離心室。
將包含樣品的樣品管520插入到盒500的樣品轉移容器501中，因此刺穿管帽521以執行將樣品轉移到宏觀流體離心室，如圖3的300處所示。盒接口組件經由下文將詳細描述的盒容器與盒接合，且被致動以使得閥509打開而閥512、513和517閉合，因此除了來自樣品管的路徑508之外，密封源自宏觀流體離心室的所有流體路徑。
空氣置換裝置通過連接器與埠518接合，所述連接器提供與所述埠的密封連接。可選地，剛性或柔性管將空氣置換裝置連接到連接器。可通過以下步驟來執行將樣品轉移到宏觀流體離心室502：操作空氣置換裝置以從宏觀流體離心室提取空氣，從而導致樣品經由流體路徑508從樣品管520流入宏觀流體離心室502中。必須將埠518的入口523定位在液面之上且使液面與入口523之間具有足夠的空氣間隙使得沒有流體流入至埠518的入口523中。由空氣置換激活的流動以受控方式完成，使得預定體積的樣品被轉移到宏觀流體離心室中。
在一個實施方式中，至流動路徑508的入口522也在位於液面上面的空氣間隙中，使得在轉移期望體積的樣品後可以將經由埠518的空氣置換反向以提供至宏觀流體離心室中的少量空氣置換從而清理樣品流體的流動路徑508並將該殘留樣品移回樣品管520中。然後，將閥509閉合且可選地從容器501移除樣品管520。
如上文所提及的，樣品預處理流體在樣品轉移過程之前可存在於室中，或替代地可以與樣品類似的方式從預處理流體管來轉移樣品預處理流體。替代地，預處理流體存儲室和設置於盒上，且可提供具有閥和空氣通氣孔的流體路徑以允許以與清洗緩衝液移至宏觀流體離心室類似的方式將預處理流體移至宏觀流體離心室，如下文所描述。
在將樣品添加到宏觀流體離心室502之後，如在圖3的305處，可將樣品與預處理液體可選地混合。可提供混合機構，從而儀器執行盒的渦旋、抖動或循環倒轉。這個操作是在源自宏觀流體離心室502的所有流體路徑上的閥均閉合的情況下完成的。閥可設置於至埠518的流體路徑上，以在混合期間防止流體進入空氣路徑。另外或替代例，防止流體通過的可透氣膜可放置在宏觀流體離心室與埠518之間的空氣路徑中，以防止流體到達埠518。該膜還可被配置成用作空氣過濾器，以防止微生物從環境或從空氣置換裝置的進入。替代地，埠518與至宏觀流體離心室的進入開口523之間的路徑可以設計成擁有高流體阻力，使得在盛行條件下將防止流體進入開口523或將防止流體一路前進到埠518。同樣，稀釋液室505和上清液室506中的通氣孔515和516分別可裝備有可透氣膜和/或具有高流體阻力的路徑以起到類似的目的。
在混合步驟305後，執行離心沉澱步驟310，從而使盒接口組件與機動化轉子114脫離接合，且對盒120進行離心使得宏觀流體離心室中的顆粒(例如，微生物細胞)沉澱在緩衝液體上，例如，按照第PCT/CA2013/000992號PCT專利申請的方法。離心機可為角離心機或吊桶式離心機，且可根據第PCT/CA2013/000992號PCT專利申請中所提供的條件來選擇離心參數。
施加到宏觀流體離心器皿內的流體的相對離心力可在例如1000-15,000g或例如2,000-12,000g或例如3000-10,000g或例3000-7,000g或例如5000-10,000g或例如4000-8,000g的範圍內。在涉及將細菌和真菌細胞與生物樣品分離的應用中，已發現合適的相對離心力(RCF)是在1000g-15000g的範圍內，且更具體來說是在3000g-7000g的範圍內。
在圖3的離心沉澱步驟310後，停止離心機轉子，並使盒接口組件與機動化轉子如在315處那樣再接合，且如在320處那樣執行將上清液527從宏觀流體離心室提取到上清液室506，從而包含目標沉澱物(例如，微生物細胞)的殘留物528被保留在宏觀流體離心室502的底部。通過以下步驟來執行這個動作：將閥513打開而閥509、512和517保持閉合，且將空氣置換裝置連接器與埠518接合併將空氣可控地置換到宏觀流體離心室中。因此，通過流體路徑511發生由空氣置換誘發的上清液流動，所述流體路徑的入口524放置成低於上清液的最低限度。可選地，入口524放置在待從宏觀流體離心室擠出的上清液的最低限度處，因此防止從宏觀流體離心室提取殘留物528。
在上清液提取步驟320後，執行清洗緩衝液分配步驟325和330，從而將清洗緩衝液分配到宏觀流體離心室502中。通過以下步驟來執行這個動作：將閥512打開同時保持閥509、513和517閉合，且將空氣置換裝置連接器與埠518接合併將空氣從宏觀流體離心室502可控地排空。因此，通過流體路徑510發生由空氣置換誘發的清洗緩衝液流動。清洗緩衝液路徑510的入口525優選地定位在宏觀流體離心室中的液面的最高限度之上。
在清洗緩衝液分配步驟544後，執行混合步驟332以將清洗緩衝液與宏觀流體離心室中的殘留液體徹底混合。這可通過如先前所描述的盒的渦旋、抖動或循環倒轉來執行。
在混合步驟332後，執行離心沉澱步驟310，以使所收集的沉澱物(例如，微生物細胞)再沉澱並如在步驟320中那樣從離心室移除上清液。
一連串步驟325至335和310至320共同形成了清洗循環，從而在清洗緩衝液中稀釋細胞懸浮液、使顆粒再沉澱和提取上清液。可根據需要使清洗循環重複多次以實現多個附加清洗循環，從而獲得充分稀釋的最終懸浮液(例如，汙染物和幹擾物充分稀釋的微生物細胞懸浮液)。期望的稀釋因數取決於樣品組合物和下遊檢測程序。在旨在用於與從生物樣品分離細菌和真菌細胞、電溶解微生物細胞和通過核糖體RNA的RT-PCR擴增來進行檢測有關的應用的一個實施方式中，在100-100000範圍內選擇稀釋因數。更優選的範圍是1000-50000。在涉及從血液樣品分離細菌和真菌細胞、溶解微生物細胞和通過DNA的PCR擴增來進行檢測的另一個實施方式中，只要採用耐抑制劑聚合酶連同適當的擴增子檢測方案，稀釋因數可以小到1。現有技術(例如，L.A.Neely等人的《科學轉化醫學》5.182(2013):182ra54-182ra54)中報告了在全血中的DNA擴增和檢測方法的示例性實施例。
在最終上清液提取步驟320後，執行混合步驟342以使沉澱顆粒(例如，微生物細胞)再懸浮於最終殘留流體528中以產生最終懸浮液。
在再懸浮步驟342後，通過經由流體路徑510的空氣置換來提取最終懸浮液。最終懸浮液的體積取決於應用的性質。例如，當預期的應用是檢測全血或培養的血液中的病原體微生物細胞時，可將最終細胞懸浮液的體積選擇為在10μL-500μL的範圍中。更優選地範圍是20μL-120μL或50-100μL。在提取最終細胞懸浮液期間，閥517打開而閥509、512和513閉合且通過埠518將空氣置換到宏觀流體離心室中，以經由流體路徑516將流體置換出開口526。開口526被定位在緩衝流體529的頂表面處以從宏觀流體離心室擠出全部的最終懸浮液或大體上所有的懸浮液，而不擠出如圖5中所示的任何緩衝流體529。替代地，開口526被定位成使得可通過流體路徑516從宏觀流體離心室擠出最終懸浮液和一部分或所有的緩衝流體。流體路徑516通向下一個下遊盒元件，在一些實施方式中所述盒元件可為室或被配置成允許從盒取回最終懸浮液以在盒外部進行進一步處理的室，且在一些其他實施方式中，這可為至懸浮液收集室或例如如下文所描述的電溶解室的流體路徑。
基於離心的集成式流體處理盒與附加流體處理元件的集成
如下文所描述，在本公開的各示例實施方式中，集成式流體處理盒120的微流體裝置可以輔以各種附加流體部件、室和特徵，以支持對最終殘留懸浮液(或如果期望的話，上清液)的進一步處理。
在細胞存在於最終殘留懸浮液中的一個示例實施方式中，在已提取上清液之後，使細胞再懸浮。然後，如上所述，可通過沉澱物提取埠將所得細胞懸浮液的細胞內容物轉移到微流體裝置。然後，可根據範圍廣泛的細胞測定中的任一項來詢問(interrogated)細胞懸浮液。在一個示例實施方式中，可將所得細胞懸浮液遞送到至少部分地由透明光學窗形成的平面通道或室。可以光學地詢問保留在所述平面通道或室中的細胞。
例如，可用裝備有顯微鏡物鏡的光學成像系統來枚舉和/或檢驗所保留的細胞。物鏡可安裝在移動機構上以掃描所述室的體積。
在一個示例實施方式中，細胞位於在顯微鏡物鏡的視場中的區域中。例如，可將細胞保留於塗覆有適合於粘附細胞的材料(諸如，細胞專用或細胞通用塗層)的平面襯底上。還可經由電場(諸如，經由介電泳)將細胞驅使到聚焦區。
為了使得能夠詢問到低細胞計數，可將細胞保留在容納於微流體裝置內的過濾器的表面上。這消除或減輕了對沿物鏡的軸進行掃描的需求。圖6中呈現出示例實施方式，其中細胞被保留在過濾器上以進行顯微檢驗。具有比室的厚度小的厚度的過濾器61(例如，膜式過濾器)被固定在微流體裝置的通道內(其中所述通道與沉澱物提取通道流體連通，以將濃縮懸浮液遞送到沉澱物提取通道)，使得通道被分成兩個部分62和63，從而當濃縮懸浮液在入口埠64與出口埠65之間流動時使得樣品內的細胞能夠由過濾器保留。在一個示例實施例中，過濾器可由諸如高密度聚乙烯或聚碳酸酯膜的材料製成。通道的上部分(圖6中的66)由薄的透明膜製成以允許光通過到達物鏡。
如上文所解釋，微生物細胞的顯微檢查可用來執行藥敏試驗(AST)，特別是在對於樣品中的微生物細胞計數較低的非富集(non-enriched)樣品的情況下。根據一個示例實施例，首先，使用本公開中所描述的方法或任何其他適當的方法，針對病原體微生物細胞的存在和同一性來測試生物樣品。這種確定將適當抗菌劑的選擇範圍縮小到一個或幾個候選者(通常通過參考相關醫療保健環境的抗菌譜)。
通過培養樣品的兩個等分試樣來開始AST，兩個等分試樣都輔以充分支持微生物細胞在由培養儀器提供的合適溫度條件下生長的適當介質。將抗菌劑添加到其中一個等分試樣，且將另一個等分試樣視作控制樣品。在經過預定的培養階段之後，在微流體裝置部分內處理兩個等分試樣。因此，為每個等分試樣製備了相對乾淨的細胞懸浮液。然後，如上所述通過將細胞保留在過濾室中來顯微檢驗細胞，以驗證暴露於抗菌劑的細胞是否已被殺死(殺滅抗微生物劑的情況)或就生長來說是否已被禁止(抑制抗微生物劑的情況)。由此，確定AST結果。因此，本示例實施方式可使得能夠將第2013/0217063號美國專利申請公開案中敘述的AST方法擴展到具有稀缺的微生物計數(例如，在1到100,000CFU/ml的範圍中)的樣品的情況。將理解，等分試樣可以是在單獨的集成式盒上處理的樣品等分試樣，或等分試樣可以是在自動化離心之後獲得的濃縮懸浮液的等分試樣，因此準許在單個集成式流體盒的微流體裝置部分內使等分試樣溢出且隨後處理等分試樣。
在一些實施方式中，在將濃縮懸浮液遞送到微流體裝置之前，可將在流體處理期間實現的稀釋的量選擇為充分高以使得懸浮的細胞可以保留於過濾器上而不造成過濾器堵塞。可基於生物樣品的成分、在稀釋之前對樣品的預處理的性質和過濾器面積來確定合適的稀釋水平(或清洗水平)。
例如，這可通過參考目標微生物細胞是在全血中的具體示例來說明。例如，第2013/0171615號美國專利申請教導了使用等體積的1M碳酸鈉(pH10.0)+1％TritonX-100來溶解血細胞。根據所呈現的數據，2.5mL處理過的血可以穿過直徑為2.5cm且孔隙大小為0.45μm的膜過濾器而無顯著堵塞。因此，僅2.5x(0.4/25)2mL＝0.6μL未清洗的溶解的血液樣品可以穿過具有0.4mm的直徑的過濾器，這近似對應於40x顯微鏡物鏡的視場。然而，提供對血液細胞碎片進行100x稀釋的清洗過程將使得能夠過濾來自預處理步驟的60μL細胞懸浮液。在顯微檢驗之前，懸浮液的細胞內容物可經歷附加的流體處理。這些附加的處理步驟可包括例如暴露於藥物或其他化學製劑預定的時間段、用螢光染料進行染色或用適當的FISH(螢光原位雜交)試劑進行培養和向其中添加細胞生長介質和可選的培養物。可以在過濾之前和在將細胞保留於過濾器上之後執行操作。
在替代性示例實施例中，可將濃縮的細胞懸浮液(如上所述被提取到微流體裝置並且可選地在其中加以過濾)與基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)基質材料混合，並且隨後流體遞送到室，可從所述室提取MALDI樣品以執行MALDI分析。在一個示例實施方式中，微流體裝置可被配置成將混合物遞送到形成在適合於MALDI的襯底(例如，金屬襯底)上的一個或多個井，使得微流體裝置提供一個或多個準備好進行MALDI的樣品。然後，可從微流體裝置移除MALDI襯底，並根據已知的MALDI方法來處理所述MALDI襯底。替代地，形成在MALDI襯底上的井可打開井，或可通過移除微流體裝置的一個或多個可剝離或以其他方式可移除的層而被暴露。
下文所描述的非限制性示例實施方式與示例集成式流體處理盒有關，其中微流體裝置包括用於溶解根據上述實施方式提取的微生物細胞的部件和用於對存在於溶解物中的核酸執行分子檢測的測定室。
應理解，雖然本文中所提供的許多示例實施方式涉及對懸浮液中的細胞的純化和濃縮，但本文中所描述的方法、系統和裝置可適合於廣泛的多種相關的實施方式。例如，在一些示例實施例中，可以提取上清液並將其轉移到微流體裝置以進行進一步流體處理，諸如執行一次或多次綜合測定。此類實施方式將不涉及清洗步驟。在其他實施方式中，可獲得上清液與殘留樣品兩者，且可將一者或兩者轉移到微流體裝置以進行進一步處理。在其他實施方式中，最初被轉移到微流體裝置以進行處理的諸如懸浮液的流體隨後可被轉移回到宏觀流體離心室以進行進一步離心。
在所描述的實施方式中，將樣品(諸如，全血樣品)插入到盒中，並通過專用儀器在盒上執行一系列操作以執行圖7A至圖7D中概述的功能。
因此，如圖7A中所示，包含感興趣的目標細胞的樣品經歷自動化分離和清洗過程530、隨後進行電溶解和處理531、然後是rRNA的反轉錄532、隨後進行cDNA(和/或可選地gDNA)的PCR擴增533和目標擴增核酸的多路復用檢測534。然後，儀器分析檢測的信號並向用戶537報告結果。如大體上在圖3中所呈現的，通過對非微生物細胞(諸如，血細胞)的初始選擇性溶解和後續離心分離及可選的清洗循環來執行對樣品的預處理，以使細胞濃縮和移除血碎屑。隨後使微生物細胞再懸浮，且本文中將所得微生物細胞懸浮液535稱為「最終細胞懸浮液」。將最終細胞懸浮液轉到電溶解室，在所述電溶解室中，溶解微生物細胞以使得釋放和電處理目標核酸。然後，將所得微生物細胞溶解物536轉到一個熱處理室或多個熱處理室，在所述熱處理室中，根據需要執行反轉錄、PCR和PCR產物的檢測以檢測目標微生物。本文中所描述的一些實施方式中提供的盒集成了此過程的總和，其中將樣品(諸如，全血樣品)引入到盒，且盒中存在樣品預處理、離心分離和清洗、微生物細胞溶解、反轉錄、PCR和目標PCR產物的檢測所需的所有元件，所述盒與專用儀器相結合來執行以檢測和可選地識別目標微生物告終的整個過程。
替代性示例實施方式可集成該過程的一部分。例如，包含預處理及離心分離和清洗過程530所需的所有元件的盒產生最終細胞懸浮液535，所述最終細胞懸浮液可以從盒取回並如圖7B中所示在盒外部加以處理。
在另一個示例實施方式中，盒集成了樣品預處理、分離和清洗過程530以及微生物細胞電溶解和處理531、產生溶解物溶液536，所述溶解物溶液可以從盒取回並如圖7C中所示在外部加以處理。
如上文所提及的，集成式流體處理盒120可插入到由適合於離心的機動化轉子支承的容器中，且集成式流體處理盒可包括一個或多個流體特徵(例如，流體閥)，諸如用於打開和閉合埠和流體路徑的閥、通氣孔和允許連接到空氣置換裝置以用於由空氣置換誘發的流體式移動的埠。閥可採用與裝置上的流體路徑或埠相容的任何合適機構，包括但不限於夾管閥、球閥、隔膜閥、圓盤閥和旋塞閥。可採用閥來控制和/或引導流體式移動、在電溶解和處理和/或PCR循環期間控制流體的蒸發以及允許在電溶解和處理室中發生過度加熱，如第2014/0004501號美國專利申請公開案中所描述。
儘管前面的示例實施方式涉及對作為樣品基質的全血的處理，但應理解，本文中所公開的方法和裝置可適合於多種標本。合適的標本包括但不限於：尿液、痰液、腦脊液、擦拭的組織樣品、陰道樣品和生物學來源的其他樣品類型以及可能包含微生物細胞的非生物樣品。可通過處理固態或部分固態的樣品以產生液體樣品(例如，使用諸如均質化的過程)來提供樣品。其他樣品類型的示例包括可能包含微生物細胞的其他液體樣品，諸如環境水樣品、液體食物樣品和均質化食物樣品。在引入到集成式流體處理盒中之前，可將初始樣品與試劑、緩衝液或其他介質組合。
此外，儘管前面的示例實施方式涉及對核酸的擴增和檢測，但應理解，本文中所公開的方法和裝置可適合於其他應用和測定。例如，可使用溶解物來檢測細胞蛋白，或可針對此類目的從盒取回溶解物。
另外，可執行對溶解物的處理以製備用於其他應用(諸如，用於微生物表型鑑定的MALDI TOF質譜法)的溶解物。此類應用可需要集成蛋白增溶步驟與其所需的盒元件，如圖7D中所示。在此類蛋白增溶步驟的示例中，將溶解物轉入包含有機溶劑(諸如乙腈)的室中以溶解儘可能多的蛋白。然後，可選地對盒進行離心以沉澱細胞壁碎片，並將上清液轉到允許用戶從盒取回蛋白溶液的室。
參考圖8和圖5中的示意性表示，盒的一些實施方式包含為電溶解和處理操作提供的元件，包括經由流體路徑516和開口519連接到宏觀流體離心室502的細胞懸浮液室560、電溶解室561和溶解物室562。室560與561之間和561與562之間的流體路徑分別包含切斷閥565和566。為了通過經由埠518的空氣置換實現穿過該路徑的流體流動，閥509、512和513閉合而閥517、565和566打開。此外，必須將空氣路徑和通氣孔設置在溶解物室562的最遠下遊範圍以允許溶解物流入所述室中。可將所有懸浮液室、電溶解室和溶解物室的寬度和高度分別選擇為在1mm-30mm和0.025mm-1mm的範圍中。
通過先前所描述的提取步驟345將最終細胞懸浮液轉到細胞懸浮液室560，在開始電溶解和處理過程之前，所述最終細胞懸浮液被保持於所述細胞懸浮液室中。替代地，盒不包含細胞懸浮液室，且可以下文所描述的方式將細胞懸浮液直接轉到電溶解室561。在這個提取步驟期間，下遊閥565、566、567和572打開以允許流體流經通道516並流入保持室560中。一完成提取步驟345後，盒接口組件120便執行對電溶解操作必要的操作。附接到埠518的空氣置換裝置用於將最終細胞懸浮液的一部分移置到電溶解室561中以填充所述室。然後，閥565和566閉合且以提交於2013年1月25日的標題為「用於電樣品製備的方法和裝置(METHODS AND DEVICES FOR ELECTRICAL SAMPLE PREPARATION)」的第US20140004501號美國專利申請公開案中所描述的方式跨越電溶解室的電極施加電脈衝串，以在電溶解室中實現對細胞懸浮液的微生物細胞溶解和處理，從而產生微生物細胞溶解物536，該美國專利申請公開案通過引用整體地併入本文中。
在旨在用於檢測血液樣品中的病原體微生物的一個示例實施方式中，清洗流體選擇為具有在0.1-1mM的範圍中的離子強度，所述離子強度適於在所需溶解效率內進行令人滿意的電溶解操作。電壓脈衝串包括10kHz頻率下的等幅的近似300個雙極矩形脈衝，使得室中的電場為約10kV/cm。將細胞懸浮液簡單地過度加熱到近似120℃以上的溫度以有效地溶解真菌細胞。為避免對電氣室過度加壓，在脈衝串期間監控電氣室溫度以避免對室過度加壓。這通過根據第US20140004501號美國專利申請公開案的方法來監控取決於穿過室的電流的溫度來完成。在一個實施方式中，這通過測量對脈衝串的約5個第一循環進行平均的峰值電流並將最大可允許峰值電流設定為約3倍的該初始電流來實現。當峰值電流達到最大可允許值時，控制系統將脈衝幅度降低到其初始值的約1/3。
一完成電脈衝串後，便將閥565和566打開並以相同方式將另外體積的經預處理的細胞懸浮液移置到電溶解室中，因此經由流體路徑568將等體積的微生物細胞溶解物移置到溶解物室562中。如此移置的體積可等於整個電氣室體積或可選地等於電氣室體積的一部分，前一種情況移置全部體積的微生物細胞溶解物而後一種情況將一部分微生物細胞溶解物移置到流體路徑568和室562中。再次閉合閥565和566並將電脈衝串施加到電氣室。另外體積的經預處理的細胞懸浮液被類似地移置到電溶解室中並經受電溶解，且隨後被移置到室562中。在對全部體積的細胞懸浮液或替代地對一部分體積的細胞懸浮液電溶解後，即刻通過如先前所描述的空氣置換將剩餘的微生物細胞溶解物轉入溶解物室562中。出自溶解物室562的流體路徑569可終止在用於取回溶解物樣品(如圖7C中)的埠處，或可通向進行進一步處理所需的另外的導管、閥和室。
將理解，本文中所描述的電溶解方法僅是溶解方法的示例，且在替代實施例中可使用其他溶解方法，諸如珠磨、超聲溶解(可選地與珠磨和化學溶解一起)。
反轉錄、PCR和多路復用檢測
參考圖8中的示意性表示，盒的一些實施方式包含設置為用於將rRNA反轉錄為cDNA和對擴增的cDNA和/或gDNA產物進行PCR擴增和檢測的元件。僅旨在用於gDNA檢測的一些實施方式不包含反轉錄所需的元件。這些元件包括從溶解物室562到熱處理室或熱處理室陣列563的流體路徑569、從熱處理室或熱處理室陣列到空氣通氣孔571的路徑570、可選地在流體路徑569中的閥567和可選地在路徑570中的閥572。優選地，熱處理室或熱處理室陣列包含呈乾燥形式的所需的反轉錄試劑、PCR試劑和引物，其分別包含反轉錄和PCR過程所必要的所有成分。在一個實施方式中，將包含反轉錄和DNA聚合酶及適當防腐劑的主要混合(master mix)溶液以乾燥形式分配在熱處理室的壁上。將包含反轉錄和DNA聚合酶及適當防腐劑的主要混合溶液以乾燥形式分配在熱處理室的壁上。
反向引物和正向引物也以乾燥形式設置在熱處理室的壁上，所述引物一般專用於被指定用於每個熱處理室的目標微生物細胞。在另一實施方式中，溶解物室可包含呈乾燥形式的這些試劑中的一些。在一個示例實施方式中，可將主要混合溶液以乾燥形式設置在溶解物室562的壁上。在一個實施方式中，可以通過在室表面上進行冷凍乾燥來實現主要混合溶液的乾燥。替代地，主要混合物可被乾燥成凍幹的珠子的形式並存儲在室中。在另一實施方式中，在對表面進行空氣或真空乾燥之前，主要混合物輔以適當的穩定劑。美國專利8900856中已提供了這種乾燥方法的例示性實現。
一經暴露於溶解物溶液，便調配所述試劑以易於溶解，在一些實施方式中這通過以下方法協助完成：使流體流過幹試劑、攪拌接觸幹試劑的溶解物流體、加熱包含幹試劑的流體室或這些機制的一些組合。在另一實施方式中，液體試劑可在盒中儲存於相鄰的室中，並提供流體路徑和流動控制元件以將此類液體試劑轉移到溶解物室、熱處理室中或轉移到流體路徑中以與溶解物組合。
示例熱處理室
在一些實施方式中，如圖9A至圖9E中所示來建構熱處理室。可將這些室的高度和直徑分別選擇為在0.025mm-3mm和0.1-5mm的範圍中。圖9A示出熱處理室580的實施方式的橫截面圖，其中583是頂部覆蓋層或膜，584是形成室的側部的層，以及585是底層。如圖9C中所示，平面圖中的室可呈圓形，或可替代地呈方形、矩形或多邊形。室580的頂層583由適合於一些波長的光學透射的透明材料構造而成，所述波長對來自擴增的PCR產物的螢光信號進行螢光激勵和測量是必要的。替代地，出於這個目的，底層可由此類材料構造而成。以這種方式，可以在熱循環過程中實時監控或以適當的時間間隔來檢測PCR擴增產物。，路徑581和582根據需要設置為用於使流體流入或流出室。這些可為側壁層584的全高度，或如圖9A中所示，這些中的一個或兩個可為層584的高度的一部分。
在另一實施方式中，如圖9B中所示，外流路徑587形成於與底層586鄰近的層中，且底層586是在盒的工作壓力下抵制流體通過的可透氣膜。這種構造可用於在流體填充期間從室中排除空氣或最小化氣泡的出現。當設置一個以上熱處理室時(諸如，對於室563的陣列的情況)，各個室入口可經由路徑、分叉點和互連點的網絡以流體方式連接到流體路徑569。
替代地，流體路徑569可通向熱處理室陣列596之上的室595，如圖9D中的橫截面圖和圖9E中的平面圖中所示。還可將底部腔598設置為多個網絡化路徑的替代物，以連接到路徑570。在這種情況下，熱處理室的底部可為防止流體移入腔598和路徑570中的可透氣層或膜。
圖9C中示出的加熱元件590設置於室的頂表面、底表面或側表面或其一些組合處。加熱元件590可為電阻加熱元件，諸如在供應電流時通過焦耳加熱產生熱量的線、帶或條。非限制性示例材料是鎳鉻合金、鉻鋁鈷耐熱鋼、碳、銅或鉑。替代地，加熱器可由蝕刻的金屬箔、薄膜或印刷膜形成。這種加熱元件可形成室的底層、頂層或側層，或可放置在這些層中的一個或多個上或鄰近於這些層中的一個或多個。
在一些實施方式中，具有高的或適度高的熱阻抗係數的材料或配置用於形成加熱元件590，使得可以監控加熱器溫度，從而允許一些實施方式採用加熱器溫度的主動反饋控制。
在其他實施方式中，加熱元件可位於集成式流體處理盒120的外部。外部加熱器的示例包括電阻加熱器、輻射加熱器、對流加熱器、感應加熱器或珀爾帖(Peltier)加熱器。
為了使能熱循環，可引入主動式或被動式冷卻機構。冷卻方法包括但不限於通過散熱的外部被動式冷卻或使用熱電(珀爾帖)冷卻器的主動式冷卻、空氣或其他流體對流。一些實施方式擁有集成式被動冷卻，在集成式被動冷卻中，壁、頂層和/或底層或鄰近於室表面中的一個或多個的層的材料擁有當去除加熱且室溫度大於散熱材料的溫度時允許熱量迅速傳導離開室並由相鄰的材料吸收的熱性質。這可通過提供具有高熱容的外部散熱件或主動冷卻的外部散熱件來協助完成。
為將溶解物移入熱處理室或熱處理室陣列563中，連接至圖5的埠518的空氣置換裝置可用於在閥509、512和513閉合且閥517、565、566、567和572打開的情況下將空氣移置到宏觀流體離心室中，因此將溶解物從溶解物室移置到熱處理室中。在替代實施方式中，空氣通氣孔571還可被配置為允許連接空氣置換裝置(諸如，注射泵、蠕動泵、波紋管泵或任何其他空氣置換裝置或可以可控地遞送或移除空氣的壓力源)的埠。空氣置換裝置通過盒接口組件130上的連接器與埠571接合，所述連接器提供與所述埠的密封連接。可選地，剛性或柔性管將空氣置換裝置連接至所述連接器，以允許空氣置換裝置遠離盒接口組件。該實施方式允許通過經由埠571將空氣排空來使圖8的室和導管中的液體在埠571的方向上移動。來自宏觀流體離心室502的路徑中的閥517、565、566、567和572必須打開且宏觀流體離心室必須經由可用路徑中的一個通氣到大氣。替代地，由切斷閥控制的一個空氣通氣孔或多個空氣通氣孔可被供應於沿流體路徑的各位置處，以允許從埠571排空空氣從而轉移流體。可將這種流體移動方法可選地應用於以下流體轉移動作中的一個或多個：從宏觀流體離心室提取經預處理的細胞懸浮液、將細胞懸浮液轉移到電溶解室中、將溶解物轉移到溶解物室中以及將溶解物轉移到熱處理室中。
在熱處理室中執行RT-PCR
在上述實施方式中，將包括反轉錄試劑和所需引物的主要混合物以乾燥形式提供於溶解物室中，且可在所述室中執行反轉錄步驟。由此，在將幹試劑溶解於溶解物溶液中後，根據反轉錄協議以某種方式且使用與上文針對熱處理室所描述的實施方式類似的實施方式來加熱溶解物室。在反轉錄後，將包含反轉錄產物(cDNA)的溶液連同主要混合物的PCR組分一起轉移到熱處理室。將以乾燥形式儲存在每個熱處理室中的正向引物釋放到液體介質中，並根據溫度和停留時間的預定序列來執行熱循環。
替代地，將幹試劑溶解於溶解物室內的溶解物溶液中，並將其直接引入到熱處理室中。由此將局部乾燥的反向引物和正向引物釋放到溶解物溶液中，並執行反轉錄和PCR擴增。
可選地，埠571用於將真空施加到熱處理室以從熱處理室排空空氣並在液體被吸入到室中時最小化室中的氣泡的俘獲。在PCR開始之前，可將閥567和572閉合以在熱循環期間防止流體移動和/或存在於熱處理室中的殘留空氣膨脹。可選地，在熱循環之前，可通過將閥567閉合併向埠571施加正壓力來使熱處理室處於壓力下。在熱循環過程期間可繼續向埠571施加正壓力，或替代地在包含閥572的實施方式中，可在已將正壓力施加於埠571處之後且在熱循環之前將所述閥閉合。施加正壓力將增加熱處理室中的蒸汽壓力並在熱循環的升高溫度部分期間禁止氣泡的生成和成長。在替代實施方式中，可通過經由宏觀流體離心室的埠518的空氣置換來施加壓力。
可由光學系統來監控熱處理室中的目標DNA分子的擴增。在一個示例實施例中，可採用諸如LED的光源，所述光源在對應於PCR主要混合物中所使用的染料的激勵帶的波長範圍中發射而在延伸到染料的螢光發射譜中的波長中不具有或具有極少發射。在穿過波長選擇鏡之後，來自LED的光照明熱處理室中的擴增產物。包括在熱處理室中的螢光染料以取決於室溫度的強度在特性譜中發射。在從波長選擇鏡反射之後，發射光在檢測器陣列上成像。波長選擇鏡顯著地衰減發射光束中的經散射的激勵光的作用。在PCR反應的溫度循環步驟中的預選周期期間，執行熱處理室陣列的成像。可選地，在熱循環結束時，以適當速度掃描熱處理室陣列的溫度，且以選定的時間間隔記錄來自室的螢光信號。該過程旨在用於對擴增產物執行熔解分析(melting analysis)。
圖19中呈現了光學系統的示例實施例。該系統包括LED 410，LED的光由透鏡組合411來收集並大體上準直且通過穿過低通濾光片412而被過濾以衰減與螢光染料的發射譜重疊的那部分譜。在從二向色鏡413反射並穿過顯微鏡物鏡414之後，準直光束照明熱處理室陣列745。可根據熱處理室陣列745的大小來選擇物鏡放大率。例如，如果熱處理室覆蓋15mm×15mm的空間尺寸，那麼可選擇放大率在1x-1.5x的範圍中的標準顯微鏡物鏡。出自熱處理室的螢光發射由所述物鏡收集並在經歷二向色鏡413的過濾之後由發射濾光片415進一步過濾。這種過濾動作進一步衰減源自激勵源的信號並使來自熱處理室的大部分螢光信號通過。透射穿過激勵濾光片的光由透鏡組合416將成像到光檢測器417的陣列上，所述光檢測器可為CCD或CMOS傳感器的形式。
儘管本文中所提供的許多示例涉及對經由在微流體裝置中執行溶解所獲得的溶解物執行RT-PCR，但將理解，可執行其他測定，諸如存在於溶解物中的DNA的PCR，諸如，巢式PCR。此外，將理解，可採用除光學檢測之外的其他檢測模式，諸如電化學感測和經由本領域中已知的核磁共振測定進行的感測。
具有集成式分子測定微流體裝置的示例集成式流體處理盒
圖10A示出用於在全血樣品中進行微生物識別的示例集成式盒700，所述微生物識別包含有從Vacutainer型血液樣品管撤回樣品、樣品預處理、離心分離和清洗、電溶解和處理、反轉錄、PCR和目標PCR擴增產物的檢測。
示例集成式盒700示為具有三個部件，第一部件698包括樣品轉移容器702、宏觀流體離心室703、稀釋液室704和上清液室705。第一部件698可以是由與裝置的形式與功能相容的材料製造而成的單一塑料模製零件。替代地，第一部件698可以是子部件的組件，所述子部件是塑料零件且通過與裝置的材料、形式與功能一致的構件來模製或形成。在這方面，應將材料選擇為具有足夠高的強度以承受盒將經受的高離心力，且材料應與所使用的流體相容且在分子應用的情況下不應將汙染物引入到經預處理的細胞懸浮液中，否則將幹擾下遊過程。可以製造第一部件698的材料的非限制性示例是聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、PET、聚苯乙烯、環烯烴共聚物或這些材料的一些變體。
第二部件699是安裝在部件698的橫向面上的微流體裝置，其包括用於連接部件698中的室的流體路徑和閥以及用於電溶解、反轉錄和PCR的部件。第二部件699是包括許多個層的層壓件，所述層中形成有孔、通道和室以及用於電溶解和加熱操作的電部件。
所述層可經機械加工、衝壓、壓印或模製以形成必要的特徵。每個層可包括單個或者多個子層，每一者基於通過粘附劑結合、熱結合、超聲結合或本領域技術人員已知的其他方法層壓的所述子層的功能而具有先前所列出的不同材料或者相同材料。對所呈現的層和子層進行分組僅是出於容易理解所論述的實施方式的目的。在涉及分子處理的該示例實施例中，材料應與流體相容，且在將執行分子擴增的情況下材料不應將抑制性的物質或幹擾對目標微生物的檢測的物質引入到此類擴增(例如，RT-PCR)，且不應被非目標分析物(例如，非目標微生物細胞)或核酸汙染。材料還不應吸收目標分子、反應物和試劑組分達到將幹擾處理的程度。示例塑料材料和塑料膜材料包括但不限於聚碳酸酯、聚丙烯、PET和環烯烴。
在將清洗緩衝液和預處理流體分別分配到稀釋液室和宏觀流體離心室中後，可用膜密封件、箔密封件或帽697來密封室開口710。可使用與熱密封、粘附劑結合、超聲結合相容的方法和材料來結合所述密封件或帽。替代地，可在分配將這些液體之前密封所述室，並且可出於分配這些液體的目的提供替代性埠且可在分配操作後密封這些埠。帽697可經模製、壓印、機械加工或快速成型，且可由聚碳酸酯、聚苯乙烯、PET、聚酯或適合於其形式與功能的其他材料建構而成。
圖10B提供集成式盒700的分解圖，其示出了在圖10C至圖10K中被分解的層的疊加，圖10C至圖10K示出了每個部件的主要元件。第一部件698中的每個室擁有從相應的室通向第一部件698的頂平面731的孔，以連接到全部在上部層壓層699內的流體路徑、通氣孔、閥和注射埠。上部層壓層699還包含用於如先前所描述的電溶解、反轉錄、PCR和PCR產物的檢測的所有元件。
稀釋液室704經由層731中的一對孔707和層732中的流體導管709流體連接到宏觀流體離心室703，且穿過該路徑的流動由閥720來控制，所述閥的膜位於732的頂面上。上清液室705經由層731中的一對孔708和層732中的流體導管710流體連接到宏觀流體離心室703，且由閥721來控制穿過這個導管的流體流動，所述閥的膜位於732的頂面上。
稀釋液室704和上清液室705還各自擁有層731中的孔706，所述孔分別經由中間層中的互補孔而通向上層737上的通氣孔740。宏觀流體離心室703擁有層731中的孔711，所述孔通向上層737上的空氣注入埠741。731中的一對孔712和732中的流體導管714提供樣品轉移容器702中的針與部件698中的宏觀流體離心室703之間的流體連接，且由閥719來控制流體導管714內的流動，所述閥的膜位於732的頂面上。
上述樣品離心和清洗過程可通過經由埠741的空氣置換以及各種閥的選擇性開閉而在集成式盒700上實現。可經由層732中的路徑714從插入於樣品轉移容器702中的樣品管520來導引樣品流體。隨後，在離心之後，可經由層732中的導管710將上清液從宏觀流體離心室703導引到上清液室705，且可經由層732中的路徑709將稀釋液體從稀釋液室704導引到宏觀流體離心室703。在完成上述離心分離和清洗過程之後，將閥722(其膜位於層732的頂表面上)打開，且經由層731中的孔713將宏觀流體離心室703中的最終細胞懸浮液置換到層732中的收集室/導管715中。
在所示的示例實施方式中，通過藉助於連接到埠741的空氣置換泵將空氣置換到埠741中和將空氣置換出埠741，發生將剩餘細胞懸浮液置換到宏觀流體離心室和從宏觀流體離心室來置換剩餘細胞懸浮液。在將剩餘細胞懸浮液置換到收集室715後，通過藉助於連接到埠743的空氣置換泵經由層737中的埠743的空氣置換，發生流體的後續置換。在替代實施方式中，繼續通過經由埠741的空氣置換來激活流體置換，而埠743形成通氣孔。
懸浮液室715經由穿過介入層733和734的孔連接到層736中的流體路徑723，且隨後穿過位於736的頂表面上的閥724穿過735上的介入孔連接至電溶解室716。溶解室的面由如以下兩者中所描述的表面增強氧化電極建構而成：2012年4月16日提交的標題為「細胞濃縮、捕獲和溶解裝置及其使用方法(CELL CONCENTRATION,CAPTURE AND LYSIS DEVICES AND METHOD S OF USE THEREOF)」的第US20120190040號美國申請，其通過引用整體地併入本文中；以及第US20140004501號美國專利申請公開案，且這些電極通過介入層電連接到層737中的暴露於盒的上面上的端子747。電極與相應端子(觸點)之間的電連接可通過導線結合、將導電元件結合於層之間或將導電元件夾於層之間來產生。
層734中的溶解室716通過層736中的閥725流體連接到流體路徑和溶解物室717。將乾燥形式的試劑可選地放置在室717的頂面或者底面上。溶解物室717連接到層735中的流體導管726，所述流體導管通向層736中的閥727和層736中的流體路徑與熱處理室728的網絡。
室728的底表面可以可選地為可透氣膜層718，其允許空氣或其他氣體但不允許液體通過膜流至層733中通向埠743的路徑742。示例材料是多孔PTFE膜或其他材料。736的頂表面是膜，其對例如PCR試劑中的螢光染料的激勵和發射譜光學透明，且充分薄以充當閥724和725的膜材料。用於此目的的示例材料包括但不限於聚碳酸酯、環烯烴、PET或其他膜式膜。在涉及螢光檢測的應用中，應選擇用於室的側層和底層的材料以最小化自體螢光發射，否則自體螢光發射將可能干擾PCR信號檢測。在通常為白色的PTFE膜的情況下，層735可為不透明的，且構成室728的底部的特徵729防止下面的白色膜在室的中心中成像，然而允許每個室728的外部周界周圍的空氣通過。
將幹試劑可選地放置在熱處理室728的頂表面或者底表面上。
層736中的熱處理室728的頂表面接觸層737的底表面737b，所述底表面擁有呈與層736中的熱處理室陣列匹配的圖案的電阻加熱器744陣列。替代地，可將電阻加熱器直接應用或印刷在熱處理室的頂表面上。電阻加熱器配置成加熱每個室同時允許光信號通過。例如，各個室加熱器可呈位於室的外部周界附近的圓形跡線的形式，從而產生用於光學透射的清晰的內部區域，如由745所示。
同樣，737b上的電阻加熱器748可與溶解物室717的頂表面接觸或可應用到溶解物室717的頂表面，以可選地允許加熱所述室。由儀器(例如，控制和處理單元140)至暴露的端子746的連接來對電阻加熱器供電並監控電阻加熱器。
層734、735、736、737和/或738可具有在PCR熱循環的冷卻階段期間允許從熱處理室耗散熱量的熱性質。替代地，可將具有諸多性質的層(諸如，鋁箔層)放置成極為接近熱處理室(例如，層738)以使熱量耗散從而達到冷卻目的。這個層必須具有孔和切口以防止與所描述的流體路徑和空氣路徑幹涉。
因此，通過打開至埠743的路徑中的所有閥並藉助於空氣置換泵通過該埠將空氣從流體路徑排空，懸浮液室715中的細胞懸浮液被吸入到溶解室716中。為實現該動作，至宏觀流體離心室的閥722也被打開，且經由例如埠741提供從宏觀流體離心室至大氣的路徑。替代地，從宏觀流體離心室至大氣的路徑可經由至清洗通氣孔或廢液通氣孔740的流體路徑(其中閥打開)中的一個。
在涉及電溶解的本示例實施例中，如先前所描述的，細胞懸浮液通過以下步驟來電溶解和處理：使一部分細胞懸浮液間歇地流入室716中；將閥724和725閉合；以及施加雙極電脈衝串。根據本示例實施例，連續地執行電溶解以避免需要一次處理全部懸浮液，這減小了所需的電流。然後，閥724和725打開並且另外體積的細胞懸浮液轉入室716中，因此將先前溶解的細胞懸浮液移置到室717。可在每個後續電溶解步驟處將與室716或可選地整個室體積的一部分的體積相等的體積轉入室中，以確保在一連串溶解步驟期間溶解所有細胞懸浮液。
在已將全部體積的細胞懸浮液轉入室716中且已將所得溶解物轉入室717中之後，溶解完成。室717中的溶解物將溶解可選地放置在室的底表面或上表面上的試劑。可選地，可通過將流體的溫度升高至由加熱器748所施加的近似40℃來輔助溶解過程。可選地，通過經由埠743交替地注入和排空空氣，可使溶解物流體來回地穿過包括溶解物室717、電溶解室716和細胞懸浮液室715的流體路徑以及這些室之間的流體路徑、流體路徑中的孔和閥。該動作可促進幹試劑的溶解，並且還促進經由泰勒分散對流體的橫向和縱向混合，以提高溶液相對於試劑組分和目標核酸的均質性。
然後，通過經由埠743來吸取空氣而使溶解物試劑溶液轉到熱處理室中。在從路徑742中的可透氣膜718退出時產生的負壓力將促進從室排空空氣和氣泡。然後，將閥727關閉並可選地將正壓力施加到埠743。存在於室的一個或多個表面上的幹試劑將溶解以提供引物和可選地提供RT-PCR所必要的其他組分。然後，使用加熱器744和先前所描述的冷卻方法來啟動RT-PCR熱協議。
可選地，將閥放置在至通氣孔743的路徑中，且在啟動RT-PCR加熱和熱循環之前將該閥與閥727一起閉合。
在替代性實施方式中，來自溶解室716的路徑通向形成於盒部件698中的溶解物室。放置在這個室中的凍幹珠包括用於RT和/或PCR的一些或所有所需試劑。這個室的體積具有足夠的尺寸以包含凍幹珠，且具有足夠的體積以包含所需體積的溶解物。然後，溶解凍幹的試劑，且可選地混入溶液以促進混合物的溶解和均質性。可選地，可在該溶解物室中設置附加體積，使得可以經由盒的渦旋來將溶液有效地混合。
當集成式流體處理盒120容納在離心機110內時，可在所有處理步驟中執行閥的致動和空氣置換壓力的施加。然而，在其他實施方式中，系統可包括用於接納一個或多個集成式流體處理盒120的單獨殼體，其中所述單獨殼體未配置為用於離心的轉子，而是包括用於致動閥和控制集成式流體處理盒內的流體流動的適當的盒接口機構。該單獨殼體可用於在測定步驟或在離心後和清洗後執行的其他步驟期間控制對集成式流體處理盒120的微流體裝置內的流體的致動，由此釋放離心機110，以使其能夠在第一集成式流體處理盒的後續處理期間處理附加的集成式流體處理盒。
在閥722、721、720和724在容器和盒接口組件130內形成接合之前將被閉合的實施方式中，包括捕獲式柱塞(captive plunger)739並通過層738將捕獲式柱塞保持於盒內。下文描述閥操作的進一步細節。這個實施方式的示例可為：在盒700的裝運期間，防止保持於室703、704或705內的流體移動以防止經由流體路徑710、709、714或715流入部件699中及流入彼此之間。
閥的示例
作為示例，圖10中所示的集成式流體處理盒採用如圖11A至圖11C中所詳述的隔膜閥。
圖11A示出了通過將外部柱塞605應用於隔膜601上而閉合的隔膜閥，所述外部柱塞因此周向於埠(孔)603將壓力施加到膜601並密封埠603以防止流體路徑600中的流動。圖11B示出了處於打開狀態的閥，其中未在柱塞605上向下施加外力。圖11C示出了隔膜閥的平面圖，其示出密封壓力區606。在所示的實施方式中，可將柱塞605設置為作用於盒上的致動器的部件。替代地，柱塞可為集成式流體處理盒的部件，其中由覆蓋閥套的膜將柱塞保持捕獲在閥套中。在這種情況下，通過外部致動器使捕獲式柱塞作用，所述外部致動器遞送使閥閉合所必要的力且由盒容器(其為圖1的機動化轉子的一部分)或者由圖1的盒接口組件130來提供。
微流體層602(具有形成於其中的橫向微流體通道)結合到閥基底層615以一同形成流體路徑600，其中微流體層包括與橫向微流體通道流體連通的閥座孔口618，其中所述閥座孔口定位在埠603之上並延伸穿過微流體層602。可選地，微流體層602可以包括多個層(閥座孔口(閥腔體)618除外)，這些層可包括流體路徑的頂壁和底壁，其中頂表面是隔膜。隔膜601結合到層602，並提供至閥座孔口內的流體路徑600的頂表面。可選地，閥隔膜601還可夾於層602與外層604之間。可選地，隔膜還可製造成使得層602、601和604中的一些或全部是單個零件而不需要結合，例如，通過模製、微機械加工、壓印或本領域技術人員已知的其他方法。柱塞605的縮回或利用柱塞605施加到閥的力的充分放鬆允許流體沿流體路徑600流動，如圖11B中所示。本領域技術人員可選擇閥幾何結構與膜材料，使得在閉合力下膜不破裂。另外，在所示的實施方式中，閥柱塞應足夠大以提供用於在埠603周圍形成密封的足夠面積。這最小可為埠603直徑的近似2倍。
在圖11A的實施方式中，在未將力施加到柱塞605的情況下，膜將不密封埠603且流體可沿流體路徑600流動，如圖11B中所示。當在致動之前或在與盒接口組件接合之前流體路徑無需閉合時，這個實施方式是可接受的。在許多情況下，在缺少致動器機構時，有必要將集成式流體處理盒中的一些或所有閥閉合。例如，可能期望的是在盒的處理、輸送和儲存期間使圖10D中的閥720、721、722和719閉合以在啟動盒樣品製備操作之前防止預加載到宏觀流體離心室703和稀釋液室704中的流體轉到其他室或流體路徑。
圖11D示出隔膜閥的另一實施方式，所述隔膜閥具有在不應用外部致動器的情況下閉合的附加特徵。在這種情況下，提供放置在外膜611與隔膜601之間的捕獲式內部柱塞613。捕獲式內部柱塞可結合到外膜611和/或膜601。膜611可結合到膜層601，或601與611之間可存在附加層。可選地，膜611可夾有覆蓋層604。捕獲式柱塞613的尺寸設置為當閥膜601處於閉合位置中時使得其在層602的頂層面之上延伸，且應用所述膜使得在閥座孔口618內，其處於足夠用於將反作用壓縮壓力供應給捕獲式柱塞613的張應力下，這使得足以用隔膜601來密封埠603。該實施方式允許對盒進行輸送、存儲和處理，而在盒的室之間或室與盒的微流體背板之間沒有流體轉移。例如，當預處理流體存在於離心室中時或當清洗稀釋溶液存在於稀釋液室中時，這是特別有用的。
在一種例示性方法中，膜處於張力下(單軸或者雙軸)並被放置在捕獲式柱塞之上，且當維持張力時被結合或夾於適當位置。
為打開閥以允許在流動路徑600中流動，在盒的外部設置閥柱塞致動器，其可切開膜並因此釋放膜中的張力，使得足以減輕捕獲式柱塞613與閥基底層615之間的壓力。可將該裝置設置為盒接口組件130或盒容器(被設置為離心機110的一部分)的部件，由此當將集成式流體處理盒120加載於離心機110內時實現機器人致動。
在一個示例實施方式中，閥柱塞致動器612擁有位於柱塞致動器612的周界上的切割器616，在與柱塞613和閥座孔口618之間的間隙中的膜接合併施加適當的力後，所述切割器便立即切割膜，如圖11F中所示。切割器616可以圍繞捕獲式柱塞613的整個圓周延伸，以充分切割膜，或切割器616可部分地圍繞圓周延伸以切割膜611的一部分，如在圖11E中由切割線614所示。在後一種實施方式中，可部分地釋放膜張力，使得柱塞613保持捕獲但柱塞613與閥基底615之間的壓力被減輕到足以允許流體沿流體路徑600流動的程度。
在替代性實施方式中，膜611上的張力是單軸的，且僅在處於張力下的那部分膜上和在橫向於單軸膜應力的方向上切割膜611。因此，減輕了閥柱塞壓力，但柱塞保持捕獲。在以上文的各種實施方式中所描述的方式減輕閥柱塞壓力後，可通過將閥柱塞致動器表面617應用到捕獲禁式閥柱塞613來再次激活閥閉合。向閥柱塞施加足夠的力將使捕獲式柱塞613與隔膜和閥基底再次接合併再次密封埠603，如圖11F中所示。柱塞的回縮減輕了閥壓力並允許在路徑600中發生流動，如圖11G中所示。
圖11H和圖11I示出了隔膜閥的兩個替代性實施例。在圖11H中，橫向微流體通道不在微流體層的整個高度範圍上延伸。在圖11I中，第二膜結合到頂層607而非聯結到第一膜。
在圖10中所示的實施方式中，示例閥膜601的厚度是在0.025-0.25mm之間、優選地為0.075到0.125mm，且示例流體路徑600的高度是0.025-0.5mm、優選地為0.1-0.25mm，且示例寬度是0.1-4mm。示例閥座孔口618的直徑是2-8mm、優選地為3-6mm，且示例埠603的直徑是0.1-3mm、優選地為1-2mm。示例膜611是厚度在0.025-0.2mm之間的鋁箔。
埠的示例
圖10B中所示的示例集成式流體處理盒擁有空氣置換埠741和743，空氣置換埠允許連接至空氣置換裝置以使集成式流體處理盒700內的流體移動，如先前所論述。根據圖10B中所示的示例實施方式，埠與可移除式空氣噴嘴頭630接合和脫離接合，空氣噴嘴頭通過管或其他空氣路徑連接到空氣置換裝置。空氣噴嘴可集成到盒接口組件130中，使得當盒接口組件與盒接合時，可接合盒埠741和743以及使盒埠741和743脫離接合。
圖12和圖12B示出了該埠631和空氣噴嘴頭630的實施方式，空氣噴嘴頭可與埠間歇地接合和脫離接合。噴嘴頭具有：空氣路徑633，其直接或經由剛性或柔性管連接至空氣置換裝置；以及噴嘴632。可選地，噴嘴632具有斜面邊緣，且空氣噴嘴頭具有面密封件634。面密封件634可為橡膠或可獲得與埠631的面642的密封的其他軟材料。
埠631包括形成於層壓層639中的孔636，其中孔636連接到層641中的空氣路徑638。可選地，位於層之間的層640擁有可透氣膜637。此外，可選地，可由膜635來密封埠孔636，膜635結合到層639或夾於層與可選的頂層643之間。
通過以下步驟使空氣噴嘴頭630與埠接合：利用空氣噴嘴632(或利用另一合適的衝壓裝置)對密封件635進行衝壓，以及使空氣噴嘴頭的面密封件634接觸埠的面642並施加必要的壓力來密封密封件634的面與埠的面642之間的接口。在這個動作期間，空氣噴嘴632與孔636對準並進入孔636。可選地，可省略膜635，使得不需要上述衝壓動作。在這種情況下，可選地可省略來自空氣噴嘴頭主體的空氣噴嘴延伸部632，且在空氣噴嘴頭與埠接合期間使空氣路徑633與孔635對齊。
在另一實施方式中，可省略面密封件634，並且如果施加足夠的力且所使用的材料允許在這些條件下產生密封，那麼可在空氣噴嘴頭主體的面與埠的面642之間建立密封。膜635可為金屬箔(例如，鋁箔)或塑料膜(例如，聚碳酸酯、聚醯亞胺、PET、聚丙烯、環烯烴或其他材料)。可選的膜635用於在與連接器噴嘴第一次接合之前向埠提供密封，從而防止液體或汙染物進入到埠中。可選的可透氣膜637用於防止流體從路徑638轉入空氣噴嘴頭中，且可選地對通過空氣置換操作所注射或排空的空氣進行過濾。因此，保護集成式流體處理盒120免受氣載汙染物或幹擾物(其可能經由埠以其他方式進入盒)的影響，且防止微生物細胞通過埠進入或退出盒。出於這個目的，可將具有近似0.4微米或更小的孔隙大小的膜或其他過濾器用於元件637。
空氣通氣孔的示例
在盒中的各位置處提供空氣通氣孔以輔助流體流入和流出以其他方式密封的通道和室。例如，在圖5的實施方式中，通過提供通向大氣的通氣孔518，可以在上清液室506中獲得大氣壓力，使得可以通過利用空氣置換裝置經由埠518在離心機室502中施加正壓力來沿導管511獲得促進流體流動的正壓力差。空氣通氣孔的一個示例實施方式的結構類似於圖12的埠。當包括可選的可刺穿膜635時，通過利用裝備有扎刺針的針頭將膜刺穿來激活通氣孔以允許空氣通過。
儀器/系統
如上所述，系統100(其可被設置為臺式儀器)包含具有機動化轉子的離心機。機動化轉子能夠達到多種速度，這些速度對於提供給定應用或用途(諸如，沉澱流體介質中的大範圍的目標微生物)所必要的離心沉澱力來說是必要的。
沉澱發生在集成式流體處理盒120的宏觀流體離心室200中，且本領域技術人員可以用已知的沉澱係數來確定轉子速度、轉子半徑、盒幾何結構和沉澱顆粒(例如，微生物細胞或其他細胞)所必要的離心時間之間的關係。通過使用通常可用的臺式離心機和用於測量恢復度的已知方法對感興趣的流體中的目標微生物進行離心，可以憑經驗確定沉澱係數。
離心機可為固定角類型或搖擺桶式類型，且相應地調整離心機參數。
在圖13B中以平面圖以及在圖13C中以側視圖示出了離心機的示例實施方式。圖13B和圖13C中的實施方式示出了搖擺桶式離心機，其具有轉子801、在鉸鏈銷803上搖擺的兩個盒容器802以及驅動電機和軸組件804。將先前所描述的盒放置在容器中，並在圖3中所描述的離心分離和清洗過程中的適當步驟處使盒經受離心。在全速離心旋轉下，由於作用在容器802上的離心力，盒容器將搖擺以佔據水平位置805且在旋轉停止時返回到垂直定向807。
圖13A中示出了盒容器的示例實施方式，所述盒容器接受集成式流體處理盒(諸如，圖10中所示出的盒實施方式700)，並為盒700提供必要的接口元件。在這個示例實施方式中，如所示出的從頂部插入盒，並將盒固定在容器中使得其與容器上的接口元件接合，所述接口元件可包括電觸點、流體埠、閥致動器和光學模塊部件。當盒接口組件與盒容器接合時，這些接口元件轉而與盒接口組件120上的配對元件接合，使得盒接口組件可以根據需要可控地致動或激活各元件。替代地，對於一些或所有接口元件來說，可提供進入孔(access hole)和區域以允許存在於盒接口組件上的那些接口元件與盒直接接口連接。在一些實施方式中，僅在盒接口組件與盒容器接合之後，才將盒容器上的接口元件與盒接合。因此，盒接口組件130對盒起作用以執行關於本文中所描述和預期的各種實施方式來描述的各種功能性操作，所述盒接口組件由中央控制和處理單元140直接地控制或者通過盒容器上的中間接口元件來間接地控制。
如圖14A和圖14B中示意性地示出，可以將盒接口組件(此處示意性地示出為810)帶入位置814中並與盒容器810的面接合。圖14A提供了機動化轉子801和盒接口組件810的平面圖且示出了位置811，盒接口組件810在離心期間離開轉子和搖擺筒的路徑縮回到所述位置811。當離心停止時，離心機轉子被帶到旋轉位置812，使得可以將盒接口組件810帶入適當位置中以與盒及盒容器接合。可由離心機驅動電機直接地結合位置傳感器或者通過提供制動機構來執行這個轉子定位動作，所述制動機構使旋轉的轉子在預定位置處停止。替代地，在離心已停止並驅動轉子到達所需位置之後，機動化定位輪可與轉子或轉子軸接合。可提供位置傳感器以輔助轉子定位。
盒接口組件810必須移入適當位置中，並接合盒容器且可選地直接接合盒以進行各種動作。盒接口組件130可固定到平移臺和/或旋轉臺，所述臺給予盒接口組件130必要的平移和/或旋轉運動以移入橫向於盒的面的適當位置中並接合盒容器。盒接口組件130可通過鎖住容器並剛性地或半剛性地保持容器來接合容器，或其可接觸容器並使用固定擋塊或支架與容器接合，所述固定擋塊或支架將防止搖擺動作並將盒容器鎖定在適當位置。盒接口組件包含各種接口元件，所述接口元件對於執行本文中關於集成式流體處理盒的各種實施方式所描述的過程所必要的各種動作來說是必要的。這可包括電連接器或觸點、致動器、流體連接器、泵、空氣置換裝置、光學裝置和使得能夠執行所需的電、機械、流體和光學操作的其他裝置。下文描述供應於盒容器上的這些裝置和部件以及接口元件的一些示例。這些旨在表示執行本文中關於下文提供的各種實施方式所描述的功能所需的典型裝置和元件，但其非為詳盡的也非為完整的。可由本領域技術人員來確定附加的和替代的裝置、部件和元件。
可採用多觸點電連接器或多個電連接器將電力提供到各個盒端子並從一些端子發射和/或接收電信號，以向用於反轉錄和PCR的加熱元件供電、通過先前所描述的構件來檢測溫度以及將電力提供到電溶解元件。當將盒接口組件130與盒接合時，可經由容器中的開口直接在盒接口組件130上的多觸點連接器與盒端子之間產生電連接。替代地，可以在盒端子與容器中的多觸點連接器之間產生電連接，且在將盒接口組件130與容器接合後，盒接口組件130上的連接器便與盒容器上的相應觸點或連接器電接觸。此類電連接可為例如彈簧頂針、彈簧夾連接器、接觸式探針、卡連接器、PAD連接器、葉片彈簧觸點/連接器、壓縮連接器、圓柱彈簧觸點、彈簧指觸點(spring finger contact)或本領域技術人員已知的其他此類電觸點。
盒接口組件130可包括一個或多個空氣噴嘴頭630，如關於圖12中的實施方式所描述，所述空氣噴嘴頭直接與盒上的盒埠631接合，或可根據需要與盒埠631接合以用於其他等效的實施方式。盒接口組件130包含空氣置換裝置，或者通過柔性管連接到安裝在儀器中的另一固定位置中的空氣置換裝置。空氣置換裝置可為注射泵、蠕動泵。替代地，容器可包含空氣噴嘴頭，且盒接口組件130與這個噴嘴頭接合以使其與盒接合併實現所需的空氣置換。在一些實施方式中，可存在多個空氣噴嘴頭以使得能夠在附加的盒埠中進行空氣置換。孔針(vent needle)可以類似地存在於盒接口組件130上並直接與盒接合，或替代地可安裝在盒容器中並且一旦由盒接口組件130致動後便與盒接合。
閥致動器
如圖11A中所示出，先前所描述的示例閥致動機構需要致動器柱塞以將壓力直接施加到隔膜601或將壓力施加到盒組件中的中間捕獲式柱塞(例如，613)。在一些實施方式中，該致動器柱塞以下述方式安裝在盒容器中，所述方式允許由盒接口組件130接合和致動所述致動器柱塞以實現所需的盒閥動作以及可能需要此類動作來允許將盒插入到盒容器中。圖15A以盒和盒容器壁的示意性剖切視圖來提供盒致動機構的示例實施方式。
在圖15A至圖15E中，根據安裝在盒容器822中的致動器銷的示例實施方式示出了盒820中的閥的示意性橫截面圖。所述閥處於打開狀態。圖15A至圖15B示出了閥處於打開狀態，而圖15C至圖15E示出了閥處於閉合狀態。
在圖15A中，在盒容器的壁822中提供與閥對準的孔，所述孔提供用於使安裝於盒接口組件130(未示出)上的致動器上的銷819將力施加到盒上所捕獲柱塞825的途徑，由此將閥閉合，如先前關於圖11所描述。替代地，在一些實施方式中，省略捕獲柱塞且銷819可直接接觸閥隔膜821，由此將閥閉合。致動器柱塞的縮回減輕了來自隔膜的壓力，且可在通過連接到如上所述的盒埠的空氣置換裝置沿流動路徑施加適當的壓力差的情況下使流體流動。
圖15B示出銷818的示例，所述銷捕獲在容器的壁822中且可選地裝備有用於使銷縮回的彈簧。因此，可容易將盒無幹擾地插入到容器中，且當致動器銷819不作用於閥上時，閥將處於打開位置中。當致動器銷819或一些其他類似元件將壓縮力軸向施加到銷818使得其接觸並施加壓力到捕獲式柱塞825或可選地直接接觸並施加壓力到閥隔膜821時，閥被閉合。
圖15C示出了銷835，所述銷捕獲在盒容器的壁中且可選地裝備有預壓縮彈簧836，所述預壓縮彈簧作用在銷835上以通過將壓縮力施加到捕獲式柱塞825或替代地直接施加到閥隔膜821來閉合閥。彈簧預壓縮應足以在需要保持閥閉合的所有條件(可選地，包括在集成式流體處理盒和容器的離心期間)下保持閥閉合。因此，在無外部致動的情況下，閥將被鎖閉。由盒接口組件130上的致動器來提供外部致動，以使銷835縮回並釋放隔膜閥上的壓縮力從而打開閥並允許流體流動。可選地該致動還可使銷835縮回以允許用於將盒插入到容器中的間隙。該致動必須克服由彈簧836提供的彈簧力才能使銷835縮回，且可以多種方式實現。盒接口組件130可包括夾持機構以抓緊銷835的頭部並軸向地和在遠離盒的方向上拔出銷。替代地，槓桿機構837可倚靠在盒容器的表面和銷頭部的底側上，所述槓桿機構在被致動時可將銷的頭部抬高並由此使銷縮回以用於以上目的。該實施方式允許將閥鎖閉使得當將盒接口組件與盒容器脫離接合時維持閉合。因此，在離心期間，將防止流體流經該被致動的閥。應注意，彈簧力必須足以防止在大量流體壓力(在高速離心期間大量流體壓力可能出現在閥中)下通過閥產生洩漏。
在圖15D中，容器壁包含螺紋孔或包含螺釘823的螺紋插入件，所述螺釘的端面可直接接觸閥隔膜821或如所示處的接觸盒上的捕獲式柱塞825。一旦施加足夠量的壓力後，隔膜閥便閉合。可使螺釘823縮回以打開閥並提供用於插入盒的間隙。可選地，觸銷可設置為單獨的部件並在容器壁中安裝於閥和螺釘的中間，且可選地以一種方式用鍵固定以便在由螺釘823接合併致動銷時防止銷旋轉。該實施方式還允許將閥鎖閉，使得當將盒接口組件130與盒容器脫離接合時維持閉合。因此，在離心期間，將防止流體流經該被致動的閥。應注意，閥致動力必須足以防止在大量流體壓力(在高速離心期間大量流體壓力可能出現在閥中)下通過閥產生洩漏。
圖15E提供另一示例實施方式，其中具有鉸鏈銷828的槓桿826安裝在容器壁中或容器壁上。可選地，槓桿826裝備有預壓縮彈簧827，預壓縮彈簧將足夠的力施加到槓桿使得其保持接觸捕獲式柱塞821並將閥閉合。應注意，在一些替代性實施方式中，柱塞可以可選地裝備有縮回彈簧，所述縮回彈簧起作用以釋放來自閥力的壓力。
盒接口組件上的致動器832可作用於閥上，以導致槓桿826逆時針旋轉。這樣做時，致動器克服了彈簧力並釋放施加到柱塞825的力。因此釋放了來自閥的壓力以允許流體流動。當由致動器釋放槓桿時，槓桿假設由彈簧827輔助的閥閉合位置。這個力在靜止時和可選地在離心機的操作期間必須足以維持閥的無洩漏閉合。在另一實施方式中，優先定位槓桿826的質心830，使得在離心旋轉(對於所述離心旋轉來說，離心力是在方向831上)下由槓桿經歷的離心力在柱塞825上產生壓縮式反作用力，所述壓縮式反作用力起作用以進一步增大施加到閥的力。以此方式產生的附加閥閉合力即使在高流體壓力(在高離心速度下可經歷所述高流體壓力)下仍可提供能密封住閥所需的輔助。對於該實施方式來說，彈簧827閉合力僅需足以用於閥的無洩漏閉合一直到離心力超過彈簧力的離心速度。
在圖15中所示出的所有實施方式中，壓在盒上的捕獲式柱塞上的表面可以可選地裝備有如圖11中所示出的切割器616。執行所述致動的致動器可採取許多不同形式中的一種或多種，這些不同形式包括螺線管、液壓致動活塞、伺服系統、DC電機和步進電機。線性致動器可直接包含致動器銷819和832，或其可經由包括致動器銷819和832或槓桿837的中間機構來起作用，或其可通過關於致動器螺釘823將線性運動轉換為旋轉運動的中間機構來起作用。旋轉致動器(諸如，伺服系統、DC電機和步進電機)可直接作用於致動器螺釘823上，從而包含允許致動器螺釘823接合、根據需要旋轉和脫離接合的接合機構。此類旋轉致動器還可用於經由中間機構(諸如，凸輪、槓桿或將旋轉運動轉換到線性運動的其他機構)對致動器銷819及槓桿826和837進行線性致動。
混合
提供了用於混合集成式流體處理盒中的室中的流體的示例實施方式。循環式盒倒轉是一種有效的混合方法，以此方式在一個倒轉混合循環中盒從直立位置旋轉到完全倒轉位置或部分倒轉位置、且然後返回到初始直立位置。搖擺桶式容器允許通過將搖擺路徑延伸到倒轉位置(諸如，由圖15A和圖15B中的位置815所示)來實現這個動作。例如，盒接口組件130可用於通過以下步驟來致動該運動：採用盒容器側部的位置813，並接合容器同時保持搖擺路逕自由。在一個實施方式中，可以使用臂來致動循環式搖擺動作，所述臂與盒容器接合併通過DC電機、步進電機、螺線管或伺服系統使容器運動穿過其運動範圍。替代地，可在盒接口組件130上的旋轉驅動裝置與容器之間提供齒輪接口。
現描述允許通過盒的渦旋實現盒中的流體混合(例如，流體攪拌)的實施方式。例如，渦旋動作可以是盒(圖14B中的816)的基底在基底平面中的軌道式位移。例如，軌道可為5mm，且軌道速度可為1000rpm。可以通過將盒容器的底部與盒接口組件上的電機驅動旋轉元件接合來執行這個動作。所述旋轉元件可為接觸盒容器的底部上的特徵的凸輪，或具有與盒底部接合的偏置銷的圓盤。例如，圖16示出具有旋轉元件850的盒容器802的仰視圖。旋轉元件850與容器816之間的偏心接合點852偏離旋轉元件850的旋轉中心851，使得當旋轉元件850旋轉時，盒容器底部816遵循圓形軌道853。因此，對於5mm的直徑半徑來說，接合點偏離旋轉元件的旋轉中心2.5mm。可經由軸套、軸承或以其他方式自由旋轉的接頭產生旋轉元件與盒容器之間的接合。替代地，偏心驅動旋轉元件可以接觸盒容器的底部，且通過摩擦或另一種接合構件使得盒底部可旋轉穿過期望的軌道。當盒底部以這種方式作軌道運動時，盒容器的頂部必須擁有足夠的自由度以允許發生此運動。容器802繞鉸鏈803的搖擺運動(如圖14B中的806所示)在轉子半徑的方向上提供用於軌道式運動的部件的自由度。軌道式運動的互補部件在轉子圓周方向上，且可通過提供允許此類運動的鉸鏈(圖13A中的803)來調節。例如，搖擺式容器鉸鏈803可接合在容器的相應側壁上的垂直槽中，從而允許盒進行所需的搖晃運動，所述搖晃運動符合盒基底處的軌道式位移的圓周部件。替代地，賦予盒容器底部的渦旋運動在徑向方向上可為線性的，從而造成交替的搖擺動作806，所述搖擺動作符合由盒容器鉸鏈提供的搖擺運動。可由旋轉元件850產生該動作，其中通過在與盒容器接合的機構中的或在旋轉元件自身內的滑動機構來釋放運動的橫向分量。替代地，這可通過一些其他旋轉-線性運動機構(諸如，凸輪或槓桿)或通過使用線性致動器進行致動而產生。
盒容器及盒接口組件的示例
圖18A中提供盒容器900的示例實施方式。圖18B提供盒接口組件950的示例實施方式，如圖18C中所示出，所述盒接口組件能夠通過機器人控制的平移臺(未示出)平移到適當位置中並在機動化轉子951停在旋轉位置中時與盒容器接合，所述旋轉位置符合盒接口組件的接合的對準要求，且盒容器假設垂直位置。當平移到接合盒容器的位置中時，盒接口組件可壓靠盒容器以使盒容器與相對側(未示出)上的擋塊接合，使得當盒接口組件與盒容器接合時，抑制盒容器遠離盒接口組件搖擺並牢固地保持盒容器。替代地，盒接口組件可包括能夠固定盒容器並將其保持在適當位置以進行接合的機構。
示例盒容器900是具有鉸鏈容器901的搖擺式容器，所述鉸鏈容器與轉子銷接合。樣品盒904被示為插入到盒容器中。容器還包括致動器銷902，所述致動器銷保持捕獲在容器壁(在圖17A中的橫截面中被示為935)，且裝備有預壓縮彈簧930及從盒容器的表面突出的頭部931。該致動器銷實施方式是圖15C的鎖閉式實施方式，當盒接口組件未接合時且當致動器槓桿未致動時，其藉助於彈簧力來保持所有閥閉合。突出的頭部931允許與槓桿932接合，所述槓桿被鉸接於933處且安裝在盒接口組件950的正面937中。
圖17A示出處於與盒容器900的接合位置中的盒接口組件950，並且其中槓桿已與從盒容器突出的致動器銷頭931接合。在圖17A的槓桿位置中，致動器銷保持處於未致動位置中，並且僅預壓縮彈簧930作用在致動器銷902上且致動器銷902抵靠閥936，並且閥隔膜處於閉合位置中。槓桿具有凹口特徵，當盒接口組件非常接近盒容器時，所述凹口特徵允許槓桿與突出的頭部931接合。例如，當盒接口組件接近盒容器時，槓桿可順時針旋轉至圖17A的位置中，使得凹口特徵942與突出的頭部931的變窄區域940接合，如圖17C中所示。圖17B示出處於致動位置中的槓桿，所述致動位置通過使槓桿932繞鉸鏈933順時針旋轉來打開閥936，使得槓桿凹口942接觸致動器銷頭931的變寬的頂部部分941，從而使得致動器銷902上升因此釋放閥936上的壓力。
盒容器還包括用於將空氣噴嘴頭959直接接合到盒埠741和743(圖10)的進入孔904。空氣噴嘴銷可選地彈簧式安裝在盒接口組件上，以允許空氣噴嘴959的密封面接觸盒埠並在所述面與所述埠之間施加壓縮力。可規定彈簧剛度和可選的彈簧預先加力，這將確保施加足夠的力，使得可以反覆形成將承受在流體轉移期間施加到埠的壓力的密封。提供進入孔905以使電溶解接觸銷952與盒電溶解端子747電接觸。此類電接觸銷可為彈簧加載型彈簧頂針，以確保可靠接觸。電觸點906的陣列設置在盒容器表面上以連接到盒接口組件上的端子或銷953的配對陣列。觸點906電連接到盒容器內的端子，所述端子經彈簧加載或以其他方式配置，使得一旦將盒插入到盒容器後，其便與樣品盒上的觸點746電接觸。這種電連接提供向盒加熱器供電並監控盒加熱器的方法。盒還具有進入孔910，一旦盒接口組件接合後，所述進入孔便允許盒接口組件950上的可選的通氣孔刺穿銷到達並刺穿盒通氣孔上的可選的通氣孔膜密封件。盒容器900還具有進入孔908以允許由成像器954或安裝在盒接口組件950上的其他光學模塊來光學進入PCR室陣列909的光學窗。
盒接口組件950被示為具有凸輪軸955，所述凸輪軸裝備有多個個體凸輪956，每個凸輪與閥槓桿932中的一個對準。由皮帶和滑輪957及步進電機958驅動所示的凸輪軸，所述步進電機可以將凸輪軸可控地定位在多個旋轉位置處，對於所述旋轉位置來說，凸輪凸角接觸相應的槓桿臂932並致動槓桿以便如上所述來打開閥。每個凸輪可具有一個或多個凸角以使得能夠分別在一個或多個旋轉位置中激活其相應的槓桿。以這種方式，可以單獨地或者分組地致動閥。例如，參考圖5的實施方式，在從離心機室提取上清液期間，當將正的表壓力施加到離心機室埠518時，閥509、512和517必須保持閉合而上清液閥513打開。在這個操作期間，微流體背板中的剩餘閥可以可選地保持閉合。因此，當將空氣壓力遞送到離心機室埠時，與盒上的上清液閥相關聯的凸輪軸955上的單個凸輪可致動盒接口組件上的相應槓桿以打開所述閥，同時所有其他閥保持未致動和閉合。在另一個操作中，例如參考圖8，閥517、565、566、567和572必須打開以通過從埠571排空空氣而將流體從溶解物室562吸取到PCR陣列563。因此，對應於所有這些閥(如果存在於盒實施方式上)的凸輪凸角必須接觸相應的閥槓桿以在相同旋轉位置處打開所有這些閥，從而實現同時打開所述閥。因此，各個凸輪可具有一個或多個凸角以允許根據盒過程的需要單獨致動相應的閥或致動相應的閥連同其他閥。在一些情況下，可能有必要具有一個以上的凸輪軸以適應複雜的閥過程。
已通過舉例說明示出了上述具體實施方式，且應理解，這些實施方式可易受各種修改和替代形式的影響。還應理解，權利要求書並非旨在受限於所公開的特定形式，而是涵蓋落入本公開的精神和範圍內的所有修改、等效物和替代。