一種嗜鹽古菌及其應用的製作方法

2023-12-01 12:20:36 1

一種嗜鹽古菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種嗜鹽古菌(Haloarchaeon?B13-RDX)，其生物保藏信息為CGMCC?No.9210。本發明公開的嗜鹽古菌用於降解菊酯類農藥具有很好的生物活性。
【專利說明】一種嗜鹽古菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種嗜鹽古菌，屬於生物科學領域。

【背景技術】
[0002] 隨著農業生產的發展，為了有效防治病蟲害獲得更高的農作物產量，農藥的使用 量越來越大，由此造成了嚴重的環境汙染問題。
[0003] 在這之中，擬除蟲菊酯類（Pyrethroids)農藥由於具有性質穩定，不易光解，無特 殊臭味及安全係數高，使用濃度低，觸殺作用強，滅蟲速度快，殘效時間長等優點，在農業領 域被廣泛的大量使用，但是自然界並無法有效分解該類農藥殘留，其廣泛應用對生態環境 產生了不良影響，時有發生引起人的急慢性中毒事件。因此尋找能夠有效消除環境中的擬 除蟲菊酯類農藥殘留的方法已成為農藥領域迫切需要解決的問題之一。
[0004] 在這個問題上，由於生物菌種能夠通過自身的生命代謝活動降解環境中的有 毒、有害物質，在有害物質降解領域得到廣泛應用。迄今為止，研究人員已從土壤、汙 泥、汙水、天然水體、垃圾場和廄肥中分離到降解不同農藥的活性微生物，已有的這些 微生物主要集中在降解有機磷和除草劑方面，對上述的菊酯類農藥很少涉及。儘管在 傳統的菌株分離中也發現了假單胞菌屬（Pseudomonas)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、鞘 氨醇單胞菌屬（Sphingomonas)、沙雷氏菌屬（Serratia)、腸桿菌屬（Enterobacter)、 氣單胞菌屬（Aeromonas)、歐文氏菌屬（Erwinia)、耶爾森菌屬（Yersinia)、寡養單胞 菌屬（Stenotrophomonas)、克雷伯菌屬（Klebsiella)、無色桿菌屬（Achromobacter)、 產鹼桿菌（Alcaigebes)、酸單胞菌屬（Acidomonas)、弗拉特氏菌屬（Frateuria)、微 球菌屬（Micrococcus)、庫特氏菌屬（Kurthia)、中華根瘤菌屬（Sinorhizbium);真菌 5 屬：麴黴菌（Aspergillus)、木黴菌屬（Trichoderma)、白腐菌屬（Phanerochaete)、 鐮孢黴屬（Fusarium sp.)、毛鏈孢屬（Monilpchaetes);放線菌5屬：鏈輪絲菌屬 (StreptoverticiIlium baldacci)、鏈黴菌屬（Strepomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia Trevisan)、紅球菌屬（Rhodococcus)、戈登氏菌屬（Gordonia)等菌株對降解降解擬除蟲菊 酯類農藥具有一定的效果，但這些菌株均存在講解效率較低、耐藥性較差的缺陷，實用價值 不大，無法滿足大規模農業應用的需求。


【發明內容】

[0005] 在長期的研究中， 申請人:從羅布泊不同地區不同地點的區域考查採樣，從各類幹 鹽湖中分離篩選出一批嗜鹽古菌，並欣喜的發現其中的1株以溴氰菊酯，聯苯菊酯，甲氰菊 酯等菊酯類農藥作為碳源可以生長的嗜鹽古菌對菊酯類農藥具有非常理想的降解能力和 耐藥性。基於上述發現， 申請人:完成了本發明。
[0006] 首先，本發明公開了一種嗜鹽古菌，分類命名為Haloarchaeon sp. B13-RDX，其保 藏單位名稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝 陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期為2014年2月24日，保藏編 號為 CGMCC No. 9210。
[0007] 申請人:進行的實驗研究顯示，該菌株對常見的菊酯類農藥，包括但不限於溴氰菊 酯，聯苯菊酯，甲氰菊酯等，具有不低於95%的降解率，並且在農藥濃度高達100-200mg/L 的情況下降解率依舊保持在80%以上，適於大規模使用用於降解菊酯類農藥殘留。
[0008] 其次，由於本發明的嗜鹽古菌具有上述優越的生物活性，因此本發明相應公開了 該嗜鹽古菌在降解菊酯類農藥中的應用。
[0009] 其中，上述的降解菊酯類農藥包括但不限於聯苯菊酯、甲氰菊酯或溴氰菊酯，除了 這幾種常見品種以外，其它的菊酯類農藥也可採用本發明的菌株進行降解。
[0010]為了最優化上述菌種的生物活性，上述嗜鹽古菌優選在CM液體培養基中振蕩培 養然後再接種到含有菊酯類農藥的CM液體培養基中。
[0011] 其中，為了平衡菌株生長所需碳源和菌株生長量對降解率的影響， 申請人:廣泛研 究了多種接種量（質量計）與最終降解率之間的關係，發現在接種量為4%時，降解率能夠 達到95% ;繼續提高接種量則會因為微生物數量增加，導致生長所需的碳源不足，影響了菌 株的活性，使得降解率出現下降，因此優選的，接種量為4%。
[0012] 同時， 申請人:還研究了不同濃度的菊酯類農藥對菌株降解菊酯類農藥的降解 率的影響， 申請人:發現隨著濃度升高降解率呈現逐漸下降的趨勢，當菊酯類農藥濃度在 100-200mg/L時，降解率均在80%以上；當濃度在100mg/L及以下時，降解率可達到95%以 及更高的水平。因此，優選的，所述菊酯類農藥濃度不高於200mg/L，更優選其為100mg/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1、2分別為本發明嗜鹽菌B13-RDX菌株的革蘭氏染色圖片、電子顯微鏡照片 (X 10000)；
[0014] 圖3為採用鄰接法基於本發明菌株的16S rRNA序列構建的發育系統樹；
[0015] 圖4為3種菊酯類農藥混合標準色譜圖，其中1.聯苯菊酯；2.甲氰菊酯；3.溴氰 菊酯異構體；4.溴氰菊酯；
[0016] 圖5為菌株B13-RDX生長和農藥降解率的關係曲線；
[0017] 圖6為不同的接種量對B13-RDX降解3種農藥性能的影響；

【具體實施方式】
[0018] 在下述實施例中，涉及的原料包括：
[0019] 1. 1菌株樣品：樣品的採集和處理從新疆羅布泊地區不同距離和不同生態點，根 據不同的植被和土壤，挑選樣區，分別採集土樣裝入無菌離心管內帶回實驗室，於4°C保存。
[0020] 1. 2培養基：CM培養基（complex medium, CM)，常規生物菌種培養基，各廠商出 產的此類培養基組成大體相同，略有差異，但不影響培養基的活性。典型的組成如下： Casamino acid(Difco)酪蛋白胺基酸 7.5g/L，Yeast extract(Difco)酵母抽提物 10.0g/ L，檸檬酸三鈉 3. 0g/L，MgS04 ·7Η20 20. 0g/L，KCl 2. 0g/L，FeCl2 ·6Η20 10ppm，NaCl 200. 0g/ L, pH 7. 0-7. 2 ；
[0021] 牛奶-鹽-瓊脂培養基（1)脫脂牛奶150ml，8磅20min滅菌；（2)無機鹽溶液30ml， 8磅30min滅菌，包括MgS0 4 · 7H20 3g，NaCl 60g，KN03 0. 6g，微量檸檬酸鐵；（3)瓊脂溶液 120ml，8 鎊 30min 滅菌，包括 Casamino acid(Difco) 1. 5g，甘油 3g，瓊脂 4. 5g。無菌操作將 ⑵和（3)混勻，用NaOH調pH至7· 0,然後混入⑴搖勻。
[0022] 1. 3主要菊酯類農藥試劑：10%聯苯菊酯，2. 5 %溴氰菊酯，20 %甲氰菊酯購自新 疆烏魯木齊北站農產品市場。溴氰菊酯，聯苯菊酯，甲氰菊酯標準品購自天津一方科 技有限公司，濃度為l〇〇ug/ml。
[0023] 實施例1 :嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX的分離
[0024] 首先進行菌株的分離：採用倍比稀釋法塗布，37°C光照培養7d，挑去平板上的菌 落，在平板上反覆劃線直到菌落的顏色、大小、形態完全一致，記錄菌落形態；將純化的菌 落在平板上於4°C保存。牛奶-鹽-瓊脂平板上觀察單菌落的形態特徵及顏色。
[0025] 然後進行菌株的篩選：在l〇〇ml的CM液體培養基中分別加入聯苯菊酯、溴氰菊酯、 甲氰菊酯，使其最終濃度為l〇〇mg/L，以4%的量接種，37°C，180r mirT1振蕩培養4d，樣品平 行2組。
[0026] 其中3種農藥的含量測定方法為添加農藥的培養液振蕩培養4天後，取1ml加入 5ml帶刻度的試管中，加入3ml正己烷，振蕩5分鐘後，靜置分層後，吸取2ml上清液加入少 量的分析純無水Na 2S04脫水，氣相色譜測定結果換算為培養液中的農藥濃度（ml/L)。
[0027] 降解率=(1-降解菌處理後的擬除蟲菊酯農藥濃度/對照組擬除蟲菊酯農藥濃 度）X100%。
[0028] 氣相色譜條件：6890-N氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。進樣口 ：200°C，檢 測器：320°C，柱溫 150°C (2min)6°C/min - 270°C (保持 23min)，分流比 10 : 1，速率 lml/ min，色譜柱：HP-5,柱長：30mX0· 32mmX0· 25um。
[0029] 最後進行標準曲線的繪製：用移液槍準確的吸取1. 0ml聯苯菊酯，甲氰菊酯，溴氰 菊酯標準溶液（l〇〇ug/ml)置於10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，配成lO.Oug/ ml的混合標準溶液。然後再用正己烷逐級稀釋配置為弄濃度為0. 020ug/ml，0. 050ug/ml， 0· 10ug/ml，0. 20ug/ml，0. 50ug/ml，1. 0ug/ml，2. 0ug/ml 的混合標準溶液，各取 lu 1 進樣， 以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪製標準曲線[1°]。
[0030] 混合標準色譜圖（圖4)繪製採用上述方法混合及其稀釋3種供試農藥其檢測分 離情況、保留時間，標準色譜圖。
[0031] 實施例2 :嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX的種屬鑑定
[0032] 菌株的鑑定分別採用如下方法：
[0033] a採用傳統的鑑定方法，檢測各種生理生化指標及其酶學特徵檢測。
[0034] b採用擴增、測定16SrRNA序列，通過檢索GenBank資料庫鑑定到屬。
[0035] c菌株16SrRNA基因序列測定提取菌株的總DNA，然後使用下述引物【正向： 5' -ATTCCGGTTGATCCTGC-3，，反向：5，-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3，】擴增菌株 16SrRNA 基因。PCR反應條件為50yL反應體系30個循環；變性：94°C，45s ;退火：50°C，45s ;延伸： 72。。，90s。
[0036] 將菌株的16S rRNA序列與從GenBank資料庫中獲得的嗜鹽菌16S rRNA序列作比 較，採用Clustalw2.0軟體包進行多序列匹配排列，其中形成的缺口用中性元素填補。用 PHYLIP程序包中的DNAdist程序計算進化距離，根據"Kimura雙參數"方式，通過序列數據 計算矩陣距離，然後使用Neighbor-joining方法，進行系統進化樹估算。
[0037] 實施例3 :嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX的降解特性研究
[0038] 首先考慮菌株生長曲線與擬除蟲菊酯類農藥降解率的關係：
[0039] 將降解菌B13-RDX接種在CM液體培養基裡，37°C，180r min-1振蕩培養4d，按 4%的接菌量轉接入含有100mg/L聯苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的CM液體培養基中，37 °C， 180r mirT1振蕩培養，分別在24h、48h、72h、96h測定0D600nm時菌株生長量，以及氣相色譜 檢測24h、48h、72h、96h降解菌B13-RDX對3種擬除蟲菊酯類農藥的降解率。
[0040] 然後研究菌株的接種量與擬除蟲菊酯類農藥降解率的關係：
[0041] 將降解菌B13-RDX接種在CM液體培養基裡37°C，180r min-1振蕩培養4d，分別按 4%、8 %、12%、16%的量轉接入含有100mg/L聯苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的CM液體培養 基中，37°C，180r mirT1振蕩培養，4d後氣相色譜檢測農藥含量。
[0042] 最後進行了菌株對農藥耐受能力的檢測：
[0043] 將降解菌 B13-RDX 分別點接於含有 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L 聯苯菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯的CM瓊脂培養基，37°C，培養4-7d觀察是否生長。
[0044] 實驗結果如下所述：
[0045] 1.將嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX在牛奶固體培養基平板上厭氧光照培養 5d，形成黃色的圓形菌落，邊緣整齊光滑。經鑑定，B13-RDX的生理生化特徵為：革蘭氏染色 陰性，杆狀，V-P反應陰性，不能利用澱粉，H 2S反應，明膠檢測，酯酶檢測，過氧化氫酶，硝酸 鹽還原均為陽性。
[0046] 2.從該菌16S rRNA構建的系統發育樹（圖3)上看，菌株B13-RDX與鹽紅菌屬 Haloarchaeon分在同一類群中，序列同源性為95%。根據生物學領域的通常認知，16S rRNA基因序列同源性低於98%，可以認為屬於不同種，同源性小於93% -95%，可認為屬於 不同屬。因此基於系統發育樹和16S rRNA同源性角度，菌株B13-RDX是鹽紅菌屬中的一個 新成員， 申請人:將其命名為新疆羅布泊嗜鹽古菌HaloarchaeonB13-RDX。
[0047] 3、本實施例所採用方法的線性範圍與檢出限
[0048] 取混合標準溶液1 μ 1進樣測定，以待測物峰面積對其濃度作標準曲線，結果見表 1〇
[0049] 由該結果可看出，3種擬除蟲菊酯類農藥在0. 02 μ g/ml?2. 0 μ g/ml範圍內呈良 好的線性關係（r為0. 99808?0. 99859)。
[0050] 表1標準曲線及檢出限
[0051]

【權利要求】
1. 一種嗜鹽古菌（Haloarchaeon B13-RDX)，其生物保藏信息為CGMCC No.9210。
2. 權利要求1所述嗜鹽古菌在降解菊酯類農藥中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述降解菊酯類農藥為聯苯菊酯、甲氰菊 酯或溴氰菊酯。
4. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述嗜鹽古菌在CM液體培養基中振蕩培養 然後接種到含有菊酯類農藥的CM液體培養基中。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於接種量為4%。
6. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於菊酯類農藥濃度不高於200mg/L。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於菊酯類農藥濃度為100mg/L。
【文檔編號】C12N1/20GK104195062SQ201410250126
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】迪麗拜爾·託乎提, 買熱帕提阿依, 迪麗烏孜·安尼瓦爾, 旭格拉, 趙和平, 周宇光, 米麗班·霍加艾合買提 申請人:迪麗拜爾·託乎提, 新疆師範大學