櫻桃谷鴨胚上皮細胞系及其建立方法
2023-12-01 21:34:01
櫻桃谷鴨胚上皮細胞系及其建立方法
【專利摘要】本發明「櫻桃谷鴨胚上皮細胞系及其建立方法」屬於細胞生物學領域。建立方法是無菌取9-12日齡的鴨胚組織，剪成組織塊後，將其向下貼於培養孔的底部，然後加入培養液在二氧化碳培養箱中、37℃下進行貼板培養。本發明基於該方法得出了一株高活率、高純度的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系株並進行了生物保藏，該細胞系與原代細胞相比，細胞形態以生理特性有明顯差異，可以連續穩定傳代，營養要求低，生長周期短，適合大規模培養為基因工程、細胞工程、免疫學和分子生物學等生命科學研究提供大量高品質的細胞材料；也可作為家禽體細胞克隆育種的供體細胞；還可作為鴨病毒分離和疫苗生產的主要原材料。
【專利說明】櫻桃谷鴨胚上皮細胞系及其建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物細胞培養技術，特別是一種櫻桃谷鴨胚上皮細胞系及其建立方法。
【背景技術】
[0002]我國是世界上水禽養殖歷史最悠久、飼養量最大的國家，據聯合國糧農組織統計，2008年世界鴨存欄量9.48億，中國佔6.61億隻，佔世界69.7%，是一個名副其實的養鴨大國。現時世界上鴨子的年總生產量已經超過20億隻，整個亞洲佔85%，而中國的產量就約佔到70%，因此，中國養鴨業的發展對世界養鴨業以及世界各地的消費產生重大的影響。
[0003]櫻桃谷鴨是英國櫻桃谷農場引進我國的北京鴨和埃裡斯伯裡鴨為親本，雜交選育而成的配套系鴨種。其原種為北京鴨，1873年傳到美國，之後又由美國傳到英國。大約在1888年傳到日本，1925年傳到前蘇聯。在櫻桃谷農場網站上，被稱之為「Pekin-ducks」。就這樣，全世界的白色、生長速度快的大型鴨子都是北京鴨後代，「叫『Pekin-duck』，或者叫『white-Pekin-duck』，沒有『櫻桃谷鴨』這種說法。這是中國人為了幫助英國人推廣市場，起名叫做『櫻桃谷鴨』的。櫻桃谷鴨作為我國主要的肉用鴨品種，近幾年受到越來越多的消費者和養殖戶的青睞，由櫻桃谷鴨加工而成的鹽水鴨等鴨製品不僅佔在國內市場站穩了腳跟，而且還遠銷美國、日本、韓國、東南亞等國家和地區，為我國鴨子的出口打開了國際市場。隨著市場銷售渠道的不斷拓展，櫻桃谷鴨的市場需求量也在不斷的提高，椐有關資料顯示，目前我國櫻桃谷鴨的年需求量已經超過了一億隻，但還沒有達到飽和的狀態，市場潛力還很大。
[0004]近年來，鴨病頻頻發生，在各類鴨病中，傳染性疾病仍是危害養鴨業最為嚴重的疾病，其中尤以病毒性傳染病為甚。近年來，國內發生的病毒性傳染病主要有鴨瘟、鴨病毒性肝炎、番鴨細小病毒病、番鴨「花肝病」，從近期情況看，危害較為嚴重的是番鴨細小病毒病、鴨病毒性肝炎，相對較為少見的是鴨瘟、番鴨「花肝病」。目前，鴨存欄數量逐年增加，鴨場的飼養規模逐年擴大，由於部分養鴨場(戶)擴大飼養規模和盲目引種，鴨疫病的發病率也呈逐年上升趨勢，並出現了老疫病持續流行，新疫病不斷出現的複雜流行狀況:既有鴨病毒性肝炎、鴨瘟、鴨疫裡默氏桿菌病、鴨(禽)霍亂、鴨大腸桿菌病等老疫病發生和流行，又有鴨副粘病毒病、新型皰疹病毒病等新疫病不斷出現。一些原有的疾病出現了新的變化趨勢，如雛鴨病毒性肝炎的大齡化和鴨瘟的低齡化趨勢、大腸桿菌(E.coli)病與鴨疫裡氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)病的混合感染等,而且部分病毒發生了變異，如鴨病毒性肝炎病毒發生變異而出現I型的變異株。而且，國內外對鴨病相關技術研究相對偏少，正規化疫苗較為匱乏，疫病防控難度較大，從而導致鴨病呈現越來越複雜的趨勢，控制難度較大，有的甚至是暴發性的疫病時有發生，使疫病的危害變得更加嚴重而複雜，發病率居高不下，可高達20~80%，損失慘重。為了保證養鴨業產業的安全、穩定以及健康的發展，提高其生產經濟效益，不斷地擴大再生產，特需要加大對鴨病相關技術的研究力度。隨著體外培養技術和體細胞克隆技術的發展和不斷完善，為病毒分離鑑定、疫苗研製和疾病防控等提供了新的方法和途徑。
[0005]目前隨著生物技術的發展，迫切需要大規模的細胞培養，以便獲得大量有用的細胞表達產物。但是，由於鴨胚原代細胞生長緩慢，對培養環境十分敏感，細胞類型多而雜，隨著培養時間的延長，培養物所含各種類型細胞間的生長期限出現差異，有的細胞類型經過適應生長階段而加速繁殖生長，而另一些細胞，或者死亡，或者經過逐步退化而至死亡。而原代細胞培養技術核心問題是難以產業化或者說是規模化生產:一是在工藝生產時不能大規模製備產品；二是非批量生產容易導致產品質量的不均一性；三是難以對同批生產進行生產和質量控制。而採用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養方法，也已不能滿足所需細胞數量及其分泌產物。目前使用較多的反應器培養雖可以獲得高密度細胞，但是擴大規模較難，只適合於少量、價值高的細胞培養。因此，現在急需對其方法改進，建立一株能夠穩定快速傳代的鴨胚細胞系。
【發明內容】
[0006]本發明目的是提供一種易於生長，生長速度快，操作方法簡便的鴨胚上皮細胞系及其建立方法。本發明的技術方案如下:
[0007]1.一種櫻桃谷鴨胚上皮細胞系的建立方法，其特徵在於步驟如下:
[0008](1)貼壁培養:將未消化的組織塊貼於培養孔的底部，然後加入培養液，二氧化碳培養箱中、37°C下進行貼壁培養，無菌採取9~12日齡的櫻桃谷鴨胚組織，用剪刀剪去頭和四肢後放入IOmL的玻璃燒杯中，加入濃度為PBSlOmL，清洗5~10分鐘，棄去PBS後，加入10~20mL含有抗生素的消毒液處理5~10分鐘，取出鴨胚組織並剪成0.5~1.5mm3的組織塊，將組織塊平貼入6孔培養板的孔底，每孔一塊，向培養孔加入2~3mL培養液，置於37°C、5%C02條件下培養至組織塊完全貼壁，然後加入培養液至2~3ml，在37°C、5%C02條件下培養，培養期間換培養液；
[0009](2)製備單細胞系:貼壁培養的細胞長成單層後，用胰酶消化處理並進行傳代培養8代，然後按照平均1.5個細胞/孔的密度接種到培養板，標記接種單個細胞的孔，待這些單個細胞的孔中的細胞長成細胞克隆團即得到單細胞系；
[0010](3)單細胞系第一階段繼代培養
[0011]胰酶消化處理成團的單細胞系，然後繼代培養5代；
[0012](4)單細胞系第二階段繼代培養
[0013]一階段繼代培養的單細胞系進行第二階段繼代培養，
[0014]所述貼壁培養、傳代培養和第一階段繼代培養所用的培養液為含有體積比10%胎牛血清，1%_2%的鴨血清及0.2%-1%鴨胚尿囊液的DMEM ；
[0015]所述第二階段繼代培養所用的培養液為含有體積比5%新生牛血清的DMEM。
[0016]2.根據權利要求1所述的方法,所述胰酶消化處理指用0.1%~0.5% (w/v)的胰蛋白酶溶液消化30s~60s。
[0017]3.根據權利要求1所述的方法，所述含抗生素的消毒液為用PBS配製的質量百分比濃度為20%~70%的慶大黴素溶液。
[0018]4.根據權利要求1所述的方法，所述貼壁培養是指在貼有鴨胚組織塊的培養孔中加入0.1-0.3mL的所述培養液，在二氧化碳培養箱中37°C下進行培養12~24小時後，每個培養孔再補加所述培養液至lmL。
[0019]5.根據權利要求1~4任一所述的方法，鴨胚組織來源於孵化9~12日齡的櫻桃谷鴨胚。
[0020]6.根據權利要求1~4任一所述的方法，所述櫻桃谷鴨胚胎組織指來源於櫻桃谷鴨胚胎除腦、眼、四肢、內臟之外的任何組織。
[0021]7.權利要求1~6任一所述方法所建立的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系。
[0022]8.根據權利要求7所述的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系，其中一個株細胞，其保藏號為:CCTCC C201369。
[0023]9.權利要求1~6任一所述的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系在在鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、禽減蛋綜合症病毒(EDSV)分離鑑定以及疫苗研究中的用途；或在外源基因轉染、細胞凋亡及細胞融合研究中的用途。
[0024]本發明的建立方法利用櫻桃谷鴨胚組織和自製的細胞培養液成功建立了未經轉染的鴨胚上皮細胞系，建立的細胞系可以連續傳代，經過這種方法獲得的傳代細胞已傳代超過60代次，可為禽病毒的分離和增殖提供大量的穩定傳代的鴨胚上皮細胞系，可用於多種禽病毒的分離和增殖，為禽病毒的細胞疫苗研製奠定堅實的基礎。
[0025]本發明的鴨胚上皮細胞系(WffX-DEECOl)與現有技術相比，具有以下優點:
[0026]本發明的WffX-DEECOl營養要求低，原先需要10%胎牛血清，且加入鴨血清和鴨胚尿囊液等營養物質，而現在的細胞只要求5%普通新生牛血清，大大降低了培養成本。
[0027]本發明的WffX-DEECOl通過無限稀釋法獲得單克隆細胞團，其純度高(圖3~6)，生長狀態好(圖8)，生長快，便於規模化生產應用。
[0028]本發明對於貼壁培養方法及培養基培養液成分的改進調整，可以使培養出的鴨胚上皮細胞系無雜質細胞，細胞純度於現有技術相比有大幅提高；細胞類型為上皮細胞，細胞形態發生較大變化，不同於原代細胞中的長梭狀成纖維細胞。生長速度也遠遠超過原代細胞(圖8)，凍存細胞質量穩定，且細胞凍存後的細胞活率可達到93.6%~98.2%之間，在體外傳代超過60代仍能保持良好的增殖分裂，且該細胞系具有正常細胞的二倍體核型(圖18)，在軟瓊脂內培養兩周不能形成細胞克隆(圖19)，而SP20 (骨髓瘤細胞)對照細胞在軟瓊脂上形成細胞克隆(圖20)，表明建立的鴨胚細胞系不具備癌細胞的懸浮生長能力，不具有致瘤性。是一種永生化細胞系，且細胞傳代生長穩定，與現有細胞培養技術培養的細胞相比有顯著提高，成本大幅降低，適合大規模培養。
[0029]本發明彌補了我國尚無鴨胚上皮細胞系及現有鴨胚上皮細胞系建立方法缺乏的現狀，櫻桃谷鴨胚上皮細胞系存活率及純度的提升也為鴨病相關疾病研究和疫苗等生物製劑研製提供手段，而且也為鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、禽減蛋綜合症病毒(EDSV)等禽病毒的分離鑑定以及疫苗的研製提供科學素材和工具；同時還可用於外源基因轉染、細胞凋亡及細胞融合研究之用。
[0030]生物保藏信息:
[0031]分類命名為:櫻桃谷鴨胚上皮細胞系WffX-DEECOl
[0032]保藏號為:CCTCC C201369o
[0033]保藏日:2013年5月16日
[0034]保藏機構為:中國典型培養物保藏中心[0035]地址:中國，武漢，武漢大學郵編:430072 ；
[0036]電話:027-68754712
[0037]該櫻桃谷鴨胚上皮細胞系具有以下特徵在於:細胞生長速度快，生長健康，形態良好，營養要求低。細胞純度在99.9%以上，細胞活率大於93%。生物學特性檢測各項指標均達到美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)細胞系鑑定標準，且外源基因可在櫻桃谷鴨胚上皮細胞系中表達(圖9，圖10)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1為原代櫻桃谷鴨胚細胞顯微鏡下圖；
[0039]圖2鴨胚上皮細胞克隆；
[0040]圖3為櫻桃谷鴨胚上皮細胞系第5代細胞顯微鏡下圖；
[0041]圖4為櫻桃谷鴨胚上皮細胞系第10代細胞顯微鏡下圖；
[0042]圖5為櫻桃谷鴨胚上皮細胞系第20代細胞顯微鏡下圖；
[0043]圖6為櫻桃谷鴨胚上皮細胞系第30代細胞顯微鏡下圖；
[0044]圖7為櫻桃谷鴨胚上皮細胞系HE染色圖；
[0045]圖8為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞生長曲線圖；
[0046]圖9為外源基因在櫻桃谷鴨胚成纖維細胞中表達24h圖示(pEGFP-Nl螢光蛋白質粒轉染)；
[0047]圖10為外源基因在櫻桃谷鴨`胚成纖維細胞中表達48h圖示(pEGFP-Nl螢光蛋白質粒轉染)；
[0048]圖11為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種雞新城疫病毒病變圖。
[0049]圖12為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種雞傳染性法氏囊病毒病變圖。
[0050]圖13為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種鴨瘟病毒病變圖。
[0051]圖14為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種鴨肝炎I型病毒病變圖。
[0052]圖15為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種雞減蛋症候群病毒病毒病變圖。
[0053]圖16為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種鴨肝炎新型病變圖。
[0054]圖17為櫻桃谷鴨胚成纖維細胞接種H9病毒病變圖。
[0055]圖18 DEF核型圖。
[0056]圖19 DEF軟瓊脂實驗結果圖。
[0057]圖20軟瓊脂實驗Hela細胞陽性對照圖。
【具體實施方式】
[0058]下面結合發明人給出的鴨胚上皮細胞系的原代培養所用的組織來源、原代培養的培養基和培養條件、傳代過程和傳代培養的條件、細胞單克隆篩選的實例來進一步說明本發明。
[0059]實施例中所用的主要儀器及試劑來源:
[0060]櫻桃谷鴨胚來源:購自山東中泰牧業有限公司。
[0061]新城疫病毒(購自中國藥品監察所)
[0062]法氏囊病毒(購自中國藥品監察所)[0063]蛋雞減蛋症候群病毒、(購自中國藥品監察所)
[0064]鴨瘟病毒、(購自中國藥品監察所)
[0065]I型鴨肝炎病毒、由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存，參考文獻:謝金文，苗立中，王豔，肖越強，王金良，沈志強.鴨肝炎病毒的分離鑑定及其理化和生物學特性初步研究[J].安徽農業大學學報，2011，38 (I) =51-54.[0066]新型鴨肝炎病毒、由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存，本專利用的是文獻中提到的山東株(SD株)。參考文獻:趙金花，沈志強，朱輝，李峰，甄洪花，苗立中，單虎.新型鴨肝炎病毒的分離鑑定及VPl基因序列分析[J].中國預防獸醫學報，2011，33 (10):772-780.[0067]禽流感H9病毒、(購自中國藥品監察所)
[0068]小鵝瘟病毒(由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存。參考文獻:李書光，王豔，劉吉山，苗立中，沈志強.山東省小鵝瘟病毒BZ株的分離鑑定及VP3基因的序列分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2010，11:114~115.)
[0069](一 )主要儀器設備
[0070]1、倒置相差螢光顯微鏡:
[0071]2、_70°C超低溫冰箱:
[0072]3、CO2 培養箱:日本三洋 SANY0-MC0-15AC
[0073]4、液氮貯存器:四 川東亞YES-S0B-125F ；
[0074]5、電泳儀:北京六一廠DYY6C;
[0075]6、電泳槽:北京六一廠DYC-24A:
[0076]7、高性能無菌實驗臺:
[0077]( 二)主要試劑
[0078]I>DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)
[0079]2、載體pEGEP-Nl:由本實驗室保存。
[0080]3、膜蛋白酶(Trypsinl: 25O),吉姆薩(Giemsa):Amresco ;
[0081]4、特級胎牛血清(Defined FBS):Gibco ；
[0082]5、臺盼藍(Trypan Blue), Triton(曲拉通)X_100>99% ;
[0083]6、二甲基亞諷:invitrogen ；
[0084]7、脂質體 2000:1nvitrogen。
[0085]鴨胚上皮細胞培養所用液體配製:
[0086]8、DMEM培養液:DMEM9.6g，溶於超純水中，用NaHCO3約3.2g調節pH至7.2~
7.4，加水定容至1L，用磁力攪拌器攪拌混勻，0.22 μ m濾膜過濾除菌，500ml/瓶分裝，貯存
於 4。。。
[0087]9、培養液1:DMEM培養液中加入終濃度為10% (V/V)胎牛血清，1%_2% (V/V)的鴨血清及0.2%-1% (V/V)鴨胚尿囊液，0.22 um濾膜過濾500mL/瓶分裝，4°C貯存。
[0088]培養液I1:DMEM培養液中加入終濃度為5% (V/V)新生牛血清，0.22 μ m濾膜過濾500mL/瓶分裝，4 °C貯存。
[0089]10、雙抗貯存液:100萬IU的鏈黴素4支，80萬IU的青黴素5支溶於400mL滅菌去離子水中。[0090]11、I XPBS 緩衝液:NaC114.00g, KC10.1Og, Na2HPO4X 12H201.45g, KH2PO40.10g，加超純水定容至500mL，pH為7.2，高壓滅菌密封后4°C貯存。
[0091]12,0.1%~0.5%(質量體積比)胰蛋白酶溶液:1.25g胰蛋白酶乾粉溶於PBS中，定容至500ml, pH為7.2~7.4，0.22 μ m濾膜過濾分裝，_20°C貯存。
[0092]13、細胞凍存液:將5mL DMSO加入45mL全培養液(含體積比15%FBS的全培養液)中，用0.22 μ m濾膜過濾IOOmL/瓶分裝，貯存於_20°C冰箱。
[0093]實施例1鴨胚上皮細胞系的建立方法
[0094](I)無菌採取9~12日齡的櫻桃谷鴨胚組織，用剪刀剪去頭和四肢後放入IOmL的玻璃燒杯中，加入濃度為PBSlOmL，清洗5~10分鐘，棄去PBS後，加入10~20mL濃度為20%~70%的慶大黴素浸泡5~10分鐘，用眼科鑷子從慶大黴素液中取出鴨胚組織，用眼科剪剪成0.5~1.5mm3的組織塊，用眼科鑷將組織塊平貼入6孔培養板的孔底，向貼入組織塊的培養孔加入培養液I 2~3mL，培養液I剛好保證組織塊能很好的貼附在培養孔底，同時保證組織塊不會幹燥，用組織塊貼壁法分離培養的鴨胚上皮細胞，置於37°C、5%C02條件下培養至組織塊完全貼壁，然後加入培養液I ;在37°C、5%C02條件下培養，培養期間換培養液I，細胞長成單層後用胰酶消化進行繼代培養。
[0095](2)鴨胚上皮細胞的繼代培養:分離獲得的原代鴨胚細胞中含有大量的鴨胚成纖維細胞，待細胞長成單層後， 吸出培養孔中的培養液，向每培養孔中加入2.5g/L胰蛋白酶溶液，消化30s~60s，吸去胰蛋白酶溶液，每孔加入上述培養液1:2mL，用吸管吹打成細胞懸液；從每孔分別取出ImL細胞懸液加入新的培養孔，補加上述培養液1:2mL，使之終體積為3mL ;待細胞長成單層後，仍以上述方法進行繼代培養，待細胞傳代至第8代，大部分成纖維細胞開始衰老死亡，此時將細胞按照平均每孔1.5個細胞接種到96孔培養板中，繼續培養約15天，出現細胞克隆團(圖2)。將這些該細胞克隆團用I~5g/L胰酶消化後轉移至24孔培養板，經過連續的繼代培養5代後，改用培養液II傳代至60代，完成了鴨胚上皮細胞系的建立，細胞形態為上皮樣，生長狀態十分旺盛。
[0096]其中一株細胞保藏信息如下:
[0097]分類命名為:櫻桃谷鴨胚上皮細胞系WffX-DEECOl
[0098]保藏號為:CCTCCC201369o
[0099]保藏日:2013年5月16日
[0100]保減機構為:中國典型培養物保減中心
[0101]地址:中國，武漢,武漢大學郵編:430072 ；
[0102]電話:027-68754712
[0103]該櫻桃谷鴨胚上皮細胞系具有以下特徵在於:細胞生長速度快，生長健康，形態良好，營養要求低。細胞純度在99.9%以上，細胞活率大於93%。生物學特性檢測各項指標均達到美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)細胞系鑑定標準，且外源基因可在櫻桃谷鴨胚上皮細胞系中表達。
[0104]實施例2鴨胚上皮細胞系(WffX-DEECOl)的生長特性
[0105]建立的鴨胚上皮細胞系(圖3~圖6)與原代細胞(圖1)相比形態有明顯差異，原代細胞含有多種雜細胞，大多數細胞形態為長梭狀，少數為多角形和卵圓形，而建立的上皮細胞系是由細胞單克隆獲得，其純度高於99.9%，均為上皮樣細胞，細胞生長與分裂能力十分旺盛，群體倍增時間僅為17.5h (圖8)。
[0106]實施例3鴨胚上皮細胞系(WffX-DEECOl)的功能學檢測
[0107]取鴨胚上皮細胞系第60代細胞，待長成80%單層時吸棄培養液並以D-Hanks培養基(稱取 NaC18.0g, KC10.4g, Na2HPO4.12H200.133g, KH2PO40.06g, NaHCO20.35g,酚紅 0.02g,將上述成分加入燒杯中，加IOOmL超純水攪拌使固體粉末充分溶解,再補加超純水最後定容至1000mL。)洗2次後接種新城疫病毒37°C吸附I小時，棄去病毒液並補充DMEM維持液(含有2%新生牛血清)培養，同時設空白對照(不接毒)。同樣方法接種法氏囊病毒、蛋雞減蛋症候群病毒、鴨瘟病毒、I型鴨肝炎病毒、新型鴨肝炎病毒、禽流感H9病毒、小鵝瘟病毒。經觀察細胞對 這些病毒均敏感，96h內感染細胞均發生病變，而對照細胞形態正常(圖11~17)。
【權利要求】
1.一種櫻桃谷鴨胚上皮細胞系的建立方法，其特徵在於步驟如下: (1)貼壁培養:將未消化的組織塊貼於培養孔的底部，然後加入培養液，二氧化碳培養箱中、37°C下進行貼壁培養，無菌採取9~12日齡的櫻桃谷鴨胚組織，用剪刀剪去頭和四肢後放入IOmL的玻璃燒杯中，加入濃度為PBSIOmL，清洗5~10分鐘，棄去PBS後，加入10~20mL含有抗生素的消毒液處理5~10分鐘，取出鴨胚組織並剪成0.5~1.5mm3的組織塊，將組織塊平貼入6孔培養板的孔底,每孔一塊，向培養孔加入2~3mL培養液,置於37°C、5%C02條件下培養至組織塊完全貼壁，然後加入培養液至2~3ml，在37°C、5%C02條件下培養，培養期間換培養液； (2)製備單細胞系:貼壁培養的細胞長成單層後，用胰酶消化處理並進行傳代培養8代，然後按照平均1.5個細胞/孔的密度接種到培養板，標記接種單個細胞的孔，待這些單個細胞的孔中的細胞長成細胞克隆團即得到單細胞系； (3)單細胞系第一階段繼代培養 胰酶消化處理成團的單細胞系，然後繼代培養5代； (4)單細胞系第二階段繼代培養 一階段繼代培養的單細胞系進行第二階段繼代培養， 所述貼壁培養、傳代培養和第一階段繼代培養所用的培養液為含有體積比10%胎牛血清，1%_2%的鴨血清及0.2%-1%鴨胚 尿囊液的DMEM ； 所述第二階段繼代培養所用的培養液為含有體積比5%新生牛血清的DMEM。
2.根據權利要求1所述的方法，所述胰酶消化處理指用I~5g/L的胰蛋白酶溶液消化30s ~60s。
3.根據權利要求1所述的方法，所述含抗生素的消毒液為用PBS配製的質量百分比濃度為20%~70%的慶大黴素溶液。
4.根據權利要求1所述的方法，所述貼壁培養是指在貼有鴨胚組織塊的培養孔中加入0.1-ο.3mL的所述培養液，在二氧化碳培養箱中37°C下進行培養12~24小時後，每個培養孔再補加所述培養液至lmL。
5.根據權利要求1~4任一所述的方法，鴨胚組織來源於孵化9~12日齡的櫻桃谷鴨胚。
6.根據權利要求1~4任一所述的方法，所述櫻桃谷鴨胚胎組織指來源於櫻桃谷鴨胚胎除腦、眼、四肢、內臟之外的任何組織。
7.權利要求1~6任一所述方法所建立的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系。
8.根據權利要求7所述的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系，其中一個株細胞，其保藏號為:CCTCC C201369。
9.權利要求1~6任一所述的櫻桃谷鴨胚上皮細胞系在在鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、禽減蛋綜合症病毒(EDSV)分離鑑定以及疫苗研究中的用途；或在外源基因轉染、細胞凋亡及細胞融合研究中的用途。
【文檔編號】C12N5/073GK103725644SQ201310334797
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年2月6日
【發明者】王文秀, 沈志強 申請人:山東省濱州畜牧獸醫研究院