腸道病毒核酸螢光定量rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法

2023-12-10 04:01:16 2

專利名稱：腸道病毒核酸螢光定量rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種腸道病毒核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測 方法，可應用於腸道病毒？ 1起暴發疫情的實驗室應急檢測。
(二)
背景技術：
腸道病毒(EV)屬於小RNA病毒科，才艮據血清學可以分為脊灰病毒、 柯薩奇、埃可病毒和腸道病毒68 71型，共67個血清型。腸道病毒可引發 眾多疾病，並可暴發流行，導致死亡，嚴重危害人類健康。隨著脊髓灰質 炎病毒的消滅，由腸道病毒引發的一些新型傳染病也時有流行，因此對腸 道病毒的實驗室診斷日顯重要，但傳統的血清中和試驗不僅繁瑣、費時， 而且無法對所有的血清型進行鑑定，更不能對一些抗原變異抹或新型別進 行鑑定。近年發展起來的螢光定量PCR技術，實行完全閉管式操作，通過 檢測反應體系中的螢光強度動態變化對目的核酸進行實時定量分析，該方 法準確、快速、靈敏、簡便。
腸道病毒所有67個血清型基因組5，端非編碼區基因非常保守，其中部 分基因幾乎是所有血清型腸道病毒所共有。
(三)

發明內容
本發明目的是提供一種適合所有67種腸道病毒感染實驗室應急檢測 的螢光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。 本發明採用的技術方案是
腸道病毒螢光定量RT-PCR檢測試劑盒，所述萸光定量RT-PCR檢測試劑盒的上下遊引物和特異性探針序列如下上遊引物EV (YG) F:5，-GGCTGCGYTGGCGGCC-3，下遊引物EV ( YG) R: 5'隱CCAAAGTAGT CGGTTCCGC-3，特異性探針EV (YG) PB: 5，畫CTCCGGCCCCTGAATGCGG陽3，引物EV (YG) F序列中，鹼基Y為C或T的兼併鹼基，此處為引物的突變位點，就是說該處有些病毒是C，有些是T。而在引物的合成工藝過程中，其合成原理是到這個位點時，原料各加一半也就是加一半C， 加一半t。此外本試劑盒中還包括dNTP, MgCl2, RNase抑制劑，AMV逆轉錄 酶，Taq酶等，這些組分對於本領域技術人員來說屬於公知常識，可根據 需要選用。本發明還涉及一種腸道病毒的螢光定量RT-PCR檢測方法，所述方法 包括(1)根據所有腸道病毒基因組的5 '端非編碼區通用保守序列，設計引物和探針序列如下 EV (YG) F:5，-GGCTGCGYTGGCGGCC-3， EV (YG) R: 5，-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3， EV (YG) PB: 5'-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3， 引物EV(YG)F中，Y為C或T的兼併鹼基。 (2 )提取待測樣品RNA，以待測樣品RNA為模板、在包括步驟(1 )所述引物和探針序列的RT-PCR反應體系中進行RT-PCR反應； (3)對RT-PCR反應產物進行焚光檢測，根據焚光檢測的最低Ct值和最高螢光強度判斷結果，若RT-PCR反應產物的螢光檢測結果呈陽性，則待測樣品含有腸道病毒核酸。
本發明關鍵在於引物和探針序列的設計，RT-PCR反應體系組成、反
，件選擇和反應結果判斷均可按本領域常規方法進行o
所述RT-PCR反應體系每25 ia L組成如下
優選的，所述螢光定量RT-PCR反應體系終濃度組成如下
RT-PCR緩衝液 終濃度為lx
0.1 U/|uL 0.1 U/pL 各1.2pM O如M 10 105 ng/|iL
Ex Taq HS RT Enzyme Mix II 上遊與下遊引物 探針
模板RNA 餘量為DEPC水。
所述RT-PCR緩衝液為one step RT-PCR緩沖液，其終濃度為1 x , 是指緩衝液各組分在反應體系中的終濃度與lx0ne step RT-PCR緩衝液 中各組分的濃度相同。通常採用反應體系1/2體積的2xone stepRT-PCR 緩衝液。1 x one step RT-PCR緩沖液的組成參見Takara公司的one step Prime Script RT-PCR ( Perfect Real time) , Code: DRR064A。
優選的，所述萸光定量RT-PCR反應條件為42°C 30min, 95°C 2min 進行逆轉錄，然後95。C5s， 5rC35s,在51 。C進行單點螢光糹企測，共進 4亍40個循環。
所述樣品RNA提取可按常規方法進行，如採用德國QIAGEN公司的 RNeasy Mini Kit或其它試劑盒，按照試劑盒說明書進行4是取。
腸道病毒是最常見的感染人類的病毒，所致疾病種類多，臨床表現多樣，疾病譜從無症狀、呼吸道感染到心肌炎、慢性心血管疾病、脊髓灰質 炎、麻痺症、腦膜炎或腦膜腦炎、新生兒疾病、糖尿病、病毒感染後疲勞 症候群、胸肌痛、皰滲性咽峽炎、手足口病、眼病、胃腸道疾病等，腸道 病毒又是通過糞-口和呼吸道等較易播散的途徑而傳染。對腸道病毒引起的爆發疫情儘早作出實驗室確診是及時採取防控措 施與對診治療的關鍵。腸道病毒檢測傳統的方法是採用細胞培養進行病毒 分離，然後用腸道病毒組合血清進行型別鑑定，該方法雖然正確可靠，j旦 繁雜耗時，不適應早期應急診斷。近年來，隨著分子生物學技術的發展，採用RT-PCR技術對腸道病毒進行診斷國內外已有報導，它具有靈敏度高， 特異性強，所需時間短等優點，目前已在腸道病毒的核酸;險測中得到應用， 但其檢測時間仍需6 ~ 7 h,且容易由於PCR擴增產物汙染而產生假陽性。 近年發展起來的螢光定量PCR技術，實行完全閉管式操作，通過檢測反 應體系中的螢光強度動態變化對目的核酸進行實時定量分析，該方法比常 規病毒學方法更加準確、快速、靈敏、簡便，並且減少了汙染的環節，但 該方法對引物和探針的設計也提出了更高的要求。本申請發明人從美國的NCBI基因庫上下載了世界各地的腸道病毒 毒抹，包含腸道病毒所有67個血清型別。對其進行了同源性比較，在所 有腸道病毒基因組5 '端非編碼通用保守基因區設計若干對引物與Taqman 探針，對該區域進行特異性擴增，從中篩選出最佳的引物和探針，並對熒 光RT-PCR方法進行優化，驗證其敏感性、特異性和重複性。經若干腸道 病毒標準毒抹與近期爆發疫情疑似患者臨床樣本的檢測比較，該方法具有 高特異性，與其他非腸道病毒如曱肝，麻滲，風滲，腮腺炎，乙腦，登革 熱，腺病毒等均無交叉反應，而且比常規RT-PCR法更敏感、快速和簡便。腸道病毒的RT-PCR檢測敏感度在1.0 TCIDso左右，從病毒核酸提取、 RT-PCR反應與電泳，整個過程大約需6 ~ 7 h左右，而採用本方法乂人核酸 提取至完成檢測，僅需3h左右，能同時完成多個疑似患者臨床樣本的高 通量檢測，敏感度達O.l TCID5q，比普通PCR的靈敏度高IO倍左右，可 直接從患者的腦脊液、糞便、皰滲液等臨床樣本中一全測腸道病毒核酸。用 建立的新方法，對近期浙江省疑似腸道病毒爆發疫情疑似患者100 ^f分臨床 樣本進行實驗室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結果，為該病及時採取
控制措施發揮了很好的作用。
本發明的有益效果主要體現在本發明方法對腸道病毒的檢測有高度 的特異性，與其他非腸道病毒如曱肝，麻滲，風滲，腮腺炎，乙腦，登革 熱，腺病毒等均無交叉反應；本發明方法檢測的靈敏度達0.1TCID5。，可 直接從疑似患者的腦脊液、皰滲液和糞便等標本中檢測腸道病毒核酸，從 病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右；本發明方法是一種快速一企測腸道 病毒特異、敏感的方法，非常適用於如手足口病等由腸道病毒感染引起突 發疫情的實驗室早期診斷。
(四)


圖1為螢光RT-PCR法檢測腸道病毒的靈敏度；A E分別代表不同的病毒 濃度；從A至E依次為IOOO、 100、. 10、 1、 0.1TCID50; 圖2為螢光RT-PCR法檢測手足口病疑似患者臨床樣本中腸道病毒核酸； A:腸道病毒陽性對照，B至H:手足口病疑似患者臨床樣本的檢測。
(五)
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍 並不僅限於此實施例1:
1 材料與方法
1.1病毒株與臨床標本
腸道病毒EV71、柯薩奇A組(CA) CA4、 CA16、 CA21、柯薩奇 B5、 E6、 E30、 POLIO 1型、POLIO 3型等病毒抹來源於中國醫學科學院、 北京生物製品研究所和浙江省疾病預防控制中心分離株。臨床樣本來源於 近期浙江省腸道病毒爆發疫情疑似患者的腦脊液、皰滲液、糞便等，樣本 採集後帶冰運送到實驗室。 1.2引物與探針
從美國的NCBI基因庫上下載了世界各地的腸道病毒毒抹，包含腸道 病毒所有67個血清型別。對其進行了同源性比較，在所有腸道病毒基因 組5'端非編碼通用保守基因區設計引物與Taqman探針，序列如下 EV(YG)F: 5，-GGCTGCGYTGGCGGCC-3'
EV(YG)R: 5，-CCAAAGTAGT CGGTTCCGC國3，
EV (YG) PB: 5，-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3，
引物和探針委託上海基康生物工程有限公司合成。
1.3 病毒定量標準與病毒RNA的揭:耳又
以腸道病毒POLI0 3型為標準毒株，用人橫紋肌瘤細胞(RD)進行 病毒效價滴定(115.2TCID5Q/ml)後作為參考抹，將其稀釋至1000、 100、 10、 1、 0.1、 0.01TCIDso每個反應管。病毒RNA的提取採用德國QIAGEN 公司的Reansy Mini Kit,按試劑盒說明書提取，得到病毒RNA ( 102ng/ |iL),備用。
1.4 螢光RT-PCR反應體系和條件的優化
試劑盒選用Takara^厶司的one step Prime Script RT-PCR ( Perfect Realtime) ， Code: DRR064A, 4安"i兌明書4喿作，反應體系為25p1,其中2xonestepRT-PCR緩衝液12.5 ul， Ex Taq HS(5U/|Ld ) 0.5 ul, RT Enzyme Mix II(5U/pl )0.5ul，上遊與下遊引物(20^imol/L)各0.6 探針(20pmol/L) 0.3 |dl，模板RNA8^11， DEPC水補足25 |ul。反應條件為42°C 30min， 95°C 2min進行逆轉錄，然後95。C5s, 51°C 35s,在5rC進行單點螢光檢測，共進行40個循環，結果判斷選擇螢光檢測模式FAM,螢光基線調整取3-15個循環的螢光信號平均值，閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優化試驗，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應體系中，引物濃度從0.10 ~ 1.00 juM，探針濃度從0.10-0.50 nM，採用矩陣法優選引物和探針的最佳濃度，根據最低Ct值和最高螢光強度增加值(ARn) 選擇最佳引物和探針濃度。1.5 RT畫PCR^應 腸道病毒RT-PCR引物序列EV1: 5,畫AAGCACTTCTGTTTCCC國3，EV2: 5 ， -ATTCAGGGGCCGGAGGA誦3'。 擴增片斷297bp。採用TAKARA公司one step RT-kit ( code: DRR024A )， 按試劑盒說明書操作，反應體系為25pl，其中10xRT-PCR緩衝液2.5 ul， MgCl2 25 ul (25mM)， dNTP混合物(各10mM) 2.5|il， RNase抑制劑(40U/|iil) 0.5^1, AMV酶(5U4d) 0.5 ul， Taq酶(5U/pl) 0.5 ul，上 遊與下遊引物(20|iM)各0.5ili1,模板RNA8111, DEPC水4.5 pl。反應條 件為50。C 30min, 95°C 3min進行逆轉錄，然後95。C 20s， 50°C 25s, 72°C 30s 進行擴增，40個循環後轉入72。C 10min,取8 ixl產物電泳後判斷有無特異 性條帶(297bp)。1.6 螢光RT-PCR特異性、每t感性和重複性試-驗
選擇腸道病毒EV71型毒抹，柯薩奇A組CA4、 CA16、 CA21、柯薩 奇B5、艾柯病毒E6、 E30、 POLIO 1型、POLIO 3型和近期手足口爆發 疫情疑似患者的腦脊液、皰滲液和糞便等臨床樣本，對上述病毒抹和樣本 分別提取核酸，用腸道病毒螢光RT-PCR方法進行檢測，驗證方法的特異 性；對已標定TCID5。的腸道病毒POLK) 3型(115.2TCID5。/ml)稀釋後 分別提取RNA，平行進行螢光RT-PCR與RT-PCR反應，比較其靈壽丈度。 此外，對每一個濃度的病毒稀釋液作5次重複檢測，得到的Ct值計算標 準差， -瞼證方法的重複性。 2 結果
2.1螢光RT-PCR反應體系及條件
採用TAKARA公司的一步法螢光RT-PCR試劑盒，總反應體系為25 ILil。矩陣法優選後引物最佳濃度均為0.48 jiM,探針最佳濃度為0.24 jaM, 模板RNA 8 pi,最後用DEPC水補至25 pl。用MJ Research Option 2熒 光檢測系統進行檢測，反應參數為42°C 30min逆轉錄，95。C變性2min, 以95。C 5s， 51°C 35s擴增40個循環，在51。C進行單點螢光檢測，可獲 得最低Ct值和最高螢光強度。 2.2特異性試驗
本發明建立的螢光RT-PCR方法對腸道病毒具有較好的特異性，對 所檢的腸道病毒如EV71、 CA16、 CA4、 CA21、 E6、 E30、 COXB5、 POLIO l型、POLI0 3型等均顯示陽性反應，近期流行的手足口病患者的皰滲液 也顯示陽性反應。而與其他非腸道病毒如A肝，麻滲，風滲，腮腺炎，乙 腦，登革熱，腺病毒等均無交叉反應。 2.3壽t感性試驗對腸道病毒POLI0 3型毒抹，採用RD細胞進行病毒效價測定(115.2 TCID50/ml)，然後稀釋成1000、 100、 10、 1、 0.1、 0.01TCID50,提取病 毒RNA,分別用螢光RT-PCR與常規RT-PCR方法進行檢測，結果螢光 RT-PCR方法檢測敏感性達到0.1TCID5。， RT-PCR方法檢測敏感性達 1.0TCID5Q,焚光RT-PCR方法比常規RT-PCR方法的靈敏度高IO倍左右 (見圖1)。2.4重複性試—瞼腸道病毒EV71毒株按10倍梯度稀釋成3個不同的濃度，對每一個 濃度的樣本作5個重複檢測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差 在0.10 ~ 0.31之間，具有較好的重複性(表1 )。表1 螢光RT-PCR法檢測腸道病毒的重複性試驗病毒稀釋度 結果(Ct值) 平數均 標準差(TCID50)1 2 3 4 5 (Ct值) (SD)10 27.92 28.11 27.91 27.87 27.81 27.92 0.101.0 30.87 31.21 30.67 30.95 31.07 30.95 0.200.1 34.01 33.51 34.11 33.87 34.36 33.97 0.312.5臨床樣本的糹企測從近期浙江省各地報告的手足口爆發疫情疑似患者的腦脊液、糞便和 皰滲液共100份臨床樣本中直接提取病毒RNA，用本發明腸道病毒焚光 RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同時檢測腸道病毒核酸，結果腸道病毒 焚光RT-PCR方法檢測出腸道病毒核酸陽性34份，普通RT-PCR法檢測 出EV71核酸陽性30份，本發明腸道病毒螢光RT-PCR方法比普通RT-PCR法檢測腸道病毒的陽性率高。本發明腸道病毒焚光RT-PCR方法用於臨床
樣本檢測的驗證在4個平行實驗室進行，均獲得了滿意的結果，圖2顯示
的是部分臨床樣本的檢測圖譜。序列表—ST25
SEQUENCE LISTING 〈110〉浙江省疾病預防控制中心
〈120〉腸道病毒核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法
<130〉
<160〉 3
Patentln version 3. 4
<210〉 1
〈211〉 16
腿
<213〉 Unknown

〈223>人工序列 <柳〉1
ggctgcgytg gcggcc 16
<210〉 2
19
〈212〉 DNA
<213〉 Unknown

人工序列 2
ccaaagtagt cggttccgc 19
<210〉 3
<211〉 19
腿
Unknown

人工序列
<400〉 3
ctccggcccc tgaatgcgg 19
權利要求
1.腸道病毒核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特徵在於所述螢光定量RT-PCR檢測試劑盒的上下遊引物和特異性探針序列如下EV(YG)F5』-GGCTGCGYTGGCGGCC-3』EV(YG)R5』-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3』EV(YG)PB5』-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3』引物EV(YG)F序列中，Y為C或T。
2. —種腸道病毒核酸螢光定量RT-PCRJ企測方法，其特徵在於所述方法包 括(1) 根據腸道病毒基因組5，端非編碼區通用保守序列，設計引物和神果 針序列如下EV ( YG) F: 5，- GGCTGCGYTGGCGGCC-3， EV ( YG ) R: 5'-CCAAAGTAGT CGGTTCCGC陽3， EV (YG) PB: 5'-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3， 引物EV ( YG) F序列中，Y為C或T;(2) 提取待測樣品RNA,以待測樣品RNA為模板、在包括步驟(1) 所述弓1物和探針序列的RT-PCR反應體系中進行RT-PCR反應；(3 )對RT-PCR反應產物進行萸光檢測，根據焚光檢測的最低Ct值和 最高螢光強度判斷結果，若RT-PCR反應產物的螢光檢測結果呈 P曰性，則待測樣品含有腸道病毒核酸。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述RT-PCR反應體系終濃度 組成如下RT-PCR緩衝液終濃度為lx 0.1 U/pL 0.1 U/|tiL 各1.20Ex Taq HS RT Enzyme Mix II 上遊與下遊引物 探針模板RNA 餘量為DEPC水。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述RT-PCR反應條件為42°C 30min, 95°C 2min進行逆轉錄，然後95°C 5s, 51°C 35s,在51。C進行 單點螢光檢測，共進行40個循環。
全文摘要
本發明提供了一種腸道病毒螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，所述螢光定量RT-PCR檢測試劑盒的上下遊引物和特異性探針序列如下上遊引物EV(YG)F5』-GGCTGCGYTGGCGGCC-3』下遊引物EV(YG)R5』-CCAAAGTAGT CGGTTCCGC-3』特異性探針EV(YG)PB5』-CTCCGGCCCCTGAATGCGG-3』本發明方法對腸道病毒的檢測有高度的特異性，與其他非腸道病毒如A肝，麻疹，風疹，腮腺炎，乙腦，登革熱，腺病毒等均無交叉反應；本發明方法檢測的靈敏度達0.1TCID50，可直接從疑似患者的腦脊液、皰疹液和糞便等標本中檢測腸道病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右，非常適用於如手足口病等由腸道病毒感染引起突發疫情的實驗室早期診斷。
文檔編號C12Q1/70GK101407846SQ20081012145
公開日2009年4月15日 申請日期2008年10月13日 優先權日2008年10月13日
發明者嚴菊英, 燕 馮, 盧亦愚, 徐昌平, 寅 陳 申請人:浙江省疾病預防控制中心