用於天然彩色新品種蠶鑑定的絲蛋白肽段及其製備方法

2023-12-10 04:04:21 2

用於天然彩色新品種蠶鑑定的絲蛋白肽段及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於天然彩色新品種蠶鑑定的絲蛋白肽段，其基因序列包括家蠶絲H鏈非結晶區基因、H鏈結晶區與非結晶區的重組基因以及柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因；還公開了該種絲蛋白肽段的製備方法，具體包括家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表達，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與表達。該方法簡單易行，序列準確無誤，構建的表達載體沒有發生基因突變或缺失，保證了表達產物不會發生三聯碼的錯配或個別胺基酸錯誤，獲得的產物用於進一步製備高精確度的蠶絲抗體。目前還沒有來自於家蠶白色絲品種(絲素非結晶區及結晶區/非結晶區單元的)和柞蠶黃色絲或天蠶綠色絲品種的肽段製備的報導。
【專利說明】用於天然彩色新品種蠶鑑定的絲蛋白肽段及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種用於蠶品種鑑定抗體製備的絲蛋白肽段 (抗原）及其製備方法。

【背景技術】
[0002] 蠶絲絲素（以下簡稱絲素）蛋白屬於天然動物蛋白纖維，是一種結構蛋白，由結晶 態和無定形態兩大部分組成。絲素蛋白包括家蠶絲和野蠶絲（柞蠶絲、天蠶絲等）。家蠶 絲素是重鏈（H鏈）蛋白、絲素輕鏈（L鏈）蛋白和糖蛋白P25三個部分組成的複合體，柞蠶 絲、天蠶絲絲素由Η鏈組成。
[0003] 家蠶絲素由於來源豐富，數十年來也是研究的熱點，學者對其結構、性能及生物材 料應用方面進行了大量的研究，然而，有關野蠶絲素方面的研究國內外報導極少，如天蠶絲 素、柞蠶絲素等天然彩色絲素。天蠶絲、柞蠶絲是天然彩色蠶絲的代表，天然彩色絲是一種 綠色產品，對減少環境汙染，促進人類健康非常有利。具有天然淡黃色的柞蠶絲在日本市場 及歐洲市場上極受歡迎。目前，國際市場的天然有色昆蟲絲十分緊缺，以黃色野蠶絲為例， 價格是白色蠶絲的3-30倍。天然彩色黃繭或綠繭繭絲中含有的黃酮類化合物，來自於食用 的桑葉，因此不僅具有白色蠶絲良好的吸溼性、放溼性、保暖性和透氣性絲，還具有良好的 抑菌功效和抗氧化的阻擋紫外線的功能，能有效地防止因環境汙染引起人體內發生氧化作 用所造成的危害。除此，天蠶絲素、柞蠶絲素等天然彩色絲素蛋白肽鏈上含有一種特殊的序 列：精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD)三肽序列，這種R⑶三肽序列廣泛存在於膠原蛋白、 粘著蛋白等細胞外基質中，有助於細胞粘附，促使帖壁細胞粘附生長，可以作為醫療領域組 織修複選用的最佳材料之一。因此，選育彩色繭實用品種，並及時進行大規模生產開發，具 有非常誘人的商業前景，將大大推動新型蠶品種的開發力度和開拓蠶絲業發展的新局面。
[0004] 但由於天蠶、柞蠶等天然彩色繭蠶品種難以飼養，蠶絲來源比較稀少，所以應用極 其稀少，而且目前我們研究的天然黃色家蠶絲的色素主要存在於絲膠中。
[0005] 已經研究證實天蠶、柞蠶等天然彩色絲的色素來自於桑葉，而且攝入家蠶體內的 黃酮物質是否能夠從消化管進入血液、從血液進入絲腺，受到消化管和絲腺上皮細胞的透 過性影響，即受到色素生成及運輸的基因的控制。目前已有多種色繭基因已被鑑定，我們將 在分子育種時可以導入繭色相關基因，培育出具有穩定遺傳的色素生成及運輸控制基因的 蠶品種，使合成與分泌的蠶絲具有天然色素。另外色繭基因一經鑑定，可以通過分子生物學 技術克隆可能的相關基因進行遺傳雜交品種的篩選，選育出理想的天然彩色繭蠶品種，制 備不含任何化學成分的來自於天然植物並在蠶體內經修飾過的天然彩色蠶絲一新世紀的 綠色纖維及其產品。
[0006] 研究開發基於白色絲家蠶和柞蠶、天蠶等天然彩色絲等品種蠶的優良易飼養、穩 定遺傳的天然彩色家蠶品種，品種育成後，我們必須對其產品（繭絲）進行分子鑑定，以 確定合成與分泌的蠶絲具有雜交優勢的蛋白質，但目前還沒有方法能從分子水平上進行鑑 定。


【發明內容】

[0007] 針對目前的研究現狀，本發明主要解決的技術問題是提供一種用於天然彩色蠶品 種鑑定抗體製備的絲蛋白肽段及其製備方法，通過對白色繭絲的家蠶和天然彩色繭絲的柞 蠶、天蠶等絲素蛋白基因的分析，克隆了源於蠶新品種親本的典型的肽段基因序列，包括家 蠶絲Η鏈非結晶區基因、Η鏈結晶區與非結晶區的重組基因；柞蠶、天蠶蠶絲Η鏈基因；構建 了大腸桿菌表達載體，獲得了相應肽段的表達產物（蠶絲蛋白肽段-用於抗體製備相應的 抗原）。獲得的產物用於進一步製備高精確度的蠶絲抗體。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明採用的一個技術方案是：
[0009] -種用於天然彩色蠶品種鑑定抗體製備的絲蛋白肽段，其基因序列包括家蠶絲Η 鏈非結晶區基因、Η鏈結晶區與非結晶區的重組基因以及天然彩色繭柞蠶、天蠶蠶絲Η鏈基 因。
[0010] 所述的家蠶絲Η鏈非結晶區基因的非重複序列肽段的編碼基因序列為 SGFGPYVANGGYSGYEYAffSSESDFAG 〇
[0011] 所述的天蠶絲素蛋白重鏈胺基酸編碼基因序列為SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-)。
[0012] 所述的絲蛋白肽段的製備方法，具體包括家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表 達載體構建與表達，家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表 達，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與與表達。
[0013] 一、家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟：
[0014] A、根據絲素蛋白主要組成部分的重鏈核心區域非結晶區胺基酸序列（圖1)及其 編碼基因信息，設計併合成（Invitrogen公司）了非重複序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的編碼基因序列。基因序列的5'端和3'端分別含有Hindlll和Bglll的 粘末端鹼基，緊接其5'粘末端下遊設計了限制性核酸內切酶NgoMIV的識別位點，緊接3' 粘末端上遊設計了限制核酸性內切酶Agel的識別位點，後2個酶切位點用於與結晶區基因 進行重組。選擇實驗室保存的含常用多克隆位點的基礎質粒來完成非結晶區基因序列的克 隆，用限制性核酸內切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如圖1)，插入設計合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非結晶區基因序列，T4DNA連接酶連接後得到含有完整非結晶區 編碼基因的質粒pSL-F(l)。
[0015] B、實驗室保存有pGEX-Agel載體，由pGEX-KG經過改造加入了限制性核酸內切酶 Agel 位點（王建南，等。MaterialsScienceandEngineeringC, 2014, 34:429 - 436)。Agel/ HindllI酶切pGEX-Agel載體回收載體片段，Agel/HindllI酶切質粒pSL-F (1)回收插入片 段，T4DNA連接酶連接構建含有非結晶區肽段基因的表達載體表示為pGEX-F(l)。
[0016] C、構建的表達載體表達外源蛋白時具有穀胱甘肽S-轉移酶（GST)的標籤，表達的 產物融合蛋白記為GST-F(l)。將構建的表達載體pGEX-F(l)轉入大腸桿菌BL21菌細胞， 加入0-1. 2mM的誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的 空氣搖床中誘導培養0-8小時。然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的 BL21菌細胞。
[0017] D、菌細胞用適量的磷酸鹽緩衝液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白質電泳上樣緩衝液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液樣品注入聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，最後當溴 酚藍指示劑到達距凝膠底部lcm左右的位置時，結束電泳。
[0018] E、將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-F(l)。純化後收集的各管融合蛋白進行聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定。
[0019] F、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合 蛋白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於家蠶蠶絲蛋白的多肽 F(l) (TGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKLDSS)(由於酶切位點的需要，目的肽段的首末段 增加了幾個胺基酸）。
[0020] 二、家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表達，包括 以下步驟：
[0021] A、課題組設計並構建保存了四種絲素結晶區的典型肽段[GAGAGX] 16的基因序列 載體（王建南，等.蠶業科學，2006, 32(1) :36-41)。在（GS) 16基因序列的5'有限制性核 酸內切酶Agel的結合位點，前面家蠶絲非結晶區F(l)的基因序列的5'和3'端分別設計 了限制性核酸內切酶NgoMIV和Agel的結合位點。用Agel酶切（GA) 16的質粒插入NgoMIV 和Agel酶切獲得的F(l)的基因序列，Agel和NgoMIV是同尾酶，連接後F(l)3'的酶切位 點消失，形成Ala和Gly，是絲素蛋白核心區域中最富有的2種胺基酸。同時完成了家蠶品 種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆，使用的克隆載體為課題組凍存的pCDNA-2(王 建南，等.蠶業科學，2006,32(1):36-41)，構建的質粒為為？〇)嫩1 816€1。
[0022] B、用核酸限制性內切酶Agel/Hindlll消化質粒pGEX-Agel回收條帶作為載體片 段，同時用相同的內切酶Agel/Hindlll消化上述構建好的結晶區肽段與非結晶區肽段的 重組質粒，並回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接後構建pGEX系 列表達載體，即 pGEX-gsl6fl，編碼的胺基酸序列為 GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAG, AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYA WSSESDFAG(GS16F1)。
[0023] C、構建的表達載體表達外源蛋白時具有GST的標籤，表達的產物融合蛋白記為 GST-GS16F1。將構建的表達載體pGEX-gsl6f 1轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入0-1. 2mM的 誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培 養0-8小時。然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞。
[0024] D、菌細胞用適量的磷酸鹽緩衝液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心10min，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白質電泳上樣緩衝液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心 l〇min，用微量移液器取出10ul的上清液樣品注入聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，最後當溴 酚藍指示劑到達距凝膠底部lcm左右的位置時，結束電泳。
[0025] E、將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-GS16F1。純化後收集的各管融合蛋白進行聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定。
[0026] F、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋 白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於蠶絲蛋白的多肽GS16F1 (TGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKL)。
[0027] 三、天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟：
[0028] A、根據天蠶絲素蛋白重鏈胺基酸序列特徵及其編碼基因信息，設計併合成 (Invitrogen公司）了 SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "的編碼基因序列，設計的基因序列具有 以下特點：5'端設計了限制性核酸內切酶Agel，用來把合成的"-RGD-"基序克隆入含多克 隆位點的質粒。5'端下遊限制性核酸內切酶Bglll與3'端的BamHI是一對同尾酶，用於 單倍"-RGD-"基序的加倍。選擇實驗室保存的含常用多克隆位點的基礎質粒pSLFA1180FA 來完成"-1?0-"基序的克隆。質粒？51^4118(^4含有4861、88111、8&111!113(3〇1?1等酶切位 點。"-RGD-"基因克隆的具體步驟為：用設計的5'端限制性核酸內切酶Agel和BamHI消 化PSLFA1180FA質粒，然後採用瓊脂糖凝膠電泳回收消化產物中的大片段，與設計合成的 "-RGD-"基因混合，用T4連接酶連接得到pSL-AYRl。
[0029] B、用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化質粒pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收 的小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一質粒pSL-AYRl獲得的載體中，T4連接酶連接構建 PSL-AYR2,獲得設計的"-RGD-"基因序列加倍。連接後同尾酶的位點Bglll和BamHI均消 失，形成了甘氨酸Gly和絲氨酸Ser的密碼子。採用同樣的方法加倍獲得4倍設計序列的 基因克隆質粒PSL-AYR4。
[0030] C、用核酸限制性內切酶Agel/BamHI消化質粒PSL-AYR4回收AYR4的基因片段， 插入Agel/BamHI消化的課題組保存的pCDNA-2質粒中pCDNA-AYR4,構建，然後採用Agel/ Hindlll消化pGEX-Agel回收條帶作為載體片段，同時用相同的內切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,並回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接後構建pGEX 系列表達載體，即 PGEX-AYR4,編碼的相應肽段為 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)。
[0031] D、構建的表達載體表達外源蛋白時具有GST的標籤，表達的產物融合蛋白記為 GST-RGD4。將構建的表達載體pGEX-AYR4轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入0-1. 2mM的誘導 劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養 0-8小時。然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞。
[0032] E、菌細胞用適量的磷酸鹽緩衝液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白質電泳上樣緩衝液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液樣品注入聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，最後當溴 酚藍指示劑到達距凝膠底部lcm左右的位置時，結束電泳。
[0033] F、將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-RGD4。純化後收集的各管融合蛋白進行聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定。
[0034] G、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋 白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於蠶絲蛋白的多肽RGD4(G STGRSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS)(由 於加倍策略的需要設計了相應的限制性核酸內切酶位點，所以RGD4的第一個胺基酸出現 在全部序列的最後，其餘部分與設計的基序完全相同）。
[0035] 本發明的有益效果是：設計了源於家蠶親本之一蠶絲的典型肽段基因，源於另一 親本天蠶或柞蠶等天然彩色蠶絲的典型肽段基因，基因片段兩端設計與選擇的表達載體相 適的限制性內切酶位點，克隆並採用原核表達系統製備了相應的各親本蠶絲的抗原。方法 簡單易行，序列準確無誤，構建的表達載體沒有發生基因突變或缺失，保證了表達產物不會 發生三聯碼的錯配或個別胺基酸錯誤，獲得的產物用於製備精確度高的蠶絲抗體進行天然 彩色新品種蠶的鑑定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1是本發明用的基礎質粒PSLFA1180FA示意圖。
[0037] 圖2是家蠶品種蠶絲非結晶區基因表達載體融合蛋白GST-F⑴表達情況。
[0038] 其中，laneM:蛋白質分子量標準；lanel :不含有表達載體的BL21菌細胞總蛋白； lane2 :含有表達載體但不攜帶外源蛋白基因的BL21菌細胞總蛋白；lane3 :含有GST-F1的 BL21菌細胞總蛋白。圖中的泳道3出現的一條寬且色深的條帶即為表達獲得的融合蛋白 GST-F ⑴。
[0039] 圖3是家蠶品種蠶絲非結晶區基因表達載體純化後的融合蛋白GST-F(l)的
[0040] 表達情況。
[0041] 圖4是家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因表達載體融合蛋白
[0042] GST-GS16F1 表達情況。
[0043] 其中laneM:蛋白質分子量標準；lanel :不含有表達載體的BL21菌細胞總蛋 白；lane2 :含有表達載體但不攜帶外源蛋白基因的BL21菌細胞總蛋白；lane3 :含有 GST-GS16F1的BL21菌細胞總蛋白.圖中的泳道3出現的一條寬且色深的條帶即為表達獲 得的融合蛋白GST-GS16F1。
[0044] 圖5是家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的表達載體純化後融合蛋白 GST-GS16F1表達情況。
[0045] 圖6是天然彩色繭品種蠶絲基因的表達載體融合蛋白GST-RGD4表達情況。
[0046] 其中，laneM:蛋白質分子量標準；lanel :含有GST-RGD4的BL21菌細胞總蛋白。 圖中的泳道1出現的一條寬且色深的條帶即為表達獲得的融合蛋白GST-RGD4。
[0047] 圖7是天然彩色繭品種蠶絲基因的表達載體純化後融合蛋白GST-RGD4表達情況。

【具體實施方式】
[0048] 實施例
[0049] 家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟：
[0050] A、根據絲素蛋白主要組成部分的重鏈核心區域非結晶區胺基酸序列（圖1)及其 編碼基因信息，設計併合成（Invitrogen公司）了非重複序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的編碼基因序列。基因序列的5'端和3'端分別含有Hindlll和Bglll的 粘末端鹼基，緊接其5'粘末端下遊設計了限制性核酸內切酶NgoMIV的識別位點，緊接3' 粘末端上遊設計了限制核酸性內切酶Agel的識別位點，後2個酶切位點用於與結晶區基因 進行重組。選擇實驗室保存的含常用多克隆位點的基礎質粒來完成非結晶區基因序列的克 隆，用限制性核酸內切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如圖1)，插入設計合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非結晶區基因序列，T4DNA連接酶連接後得到含有完整非結晶區 編碼基因的質粒pSL-F(l)。
[0051] B、實驗室保存有pGEX-Agel載體，由pGEX-KG經過改造加入了限制性核酸內切 酶Agel位點。Agel/Hindlll酶切pGEX-Agel載體回收載體片段，Agel/Hindlll酶切質粒 pSL-F(l)回收插入片段，T4DNA連接酶連接構建含有非結晶區肽段基因的表達載體表示為 pGEX-F ⑴。
[0052] C、構建的表達載體表達外源蛋白時具有穀胱甘肽S-轉移酶（GST)的標籤，表達的 產物融合蛋白記為GST-F(l)。將構建的表達載體pGEX-F(l)轉入大腸桿菌BL21菌細胞，力口 入0. 5mM的誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖 床中誘導培養5小時。然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌 細胞。
[0053] D、菌細胞用磷酸鹽緩衝液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心lOmin，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白質電泳上樣緩衝液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心lOmin，用微量 移液器取出l〇ul的上清液樣品注入聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，最後當溴酚藍指示劑到 達距凝膠底部lcm左右的位置時，結束電泳。如圖2。
[0054] E、將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-F(l)。純化後收集的各管融合蛋白進行了聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定如圖3。
[0055] F、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合 蛋白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於家蠶蠶絲蛋白的多肽 F(l)(TGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKLDSS)〇
[0056] 家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以 下步驟：
[0057] A、課題組設計並構建保存了四種絲素結晶區的典型肽段[GAGAGX] 16的基因序列 載體。在（GS) 16基因序列的5'有限制性核酸內切酶Agel的結合位點，前面家蠶絲非結晶 區F(l)的基因序列的5'和3'端分別設計了限制性核酸內切酶NgoMIV和Agel的結合位 點。用Agel酶切（GA) 16的質粒插入NgoMIV和Agel酶切獲得的F(l)的基因序列，Agel和 NgoMIV是同尾酶，連接後F(l)3'的酶切位點消失，形成Ala和Gly，是絲素蛋白核心區域中 最富有的2種胺基酸。同時完成了家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆，使用 的克隆載體為課題組凍存的P⑶NA-2,構建的質粒為為p⑶NA-g S16fl。
[0058] B、用核酸限制性內切酶Agel/Hindlll消化質粒pGEX-Agel回收條帶作為載體片 段，同時用相同的內切酶Agel/Hindlll消化上述構建好的結晶區肽段與非結晶區肽段的 重組質粒，並回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接後構建pGEX系 列表達載體，即 pGEX-gsl6fl，編碼的胺基酸序列為 GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAG, AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYA WSSESDFAG(GS16F1)。
[0059] C、構建的表達載體表達外源蛋白時具有GST的標籤，表達的產物融合蛋白記為 GST-GS16F1。將構建的表達載體pGEX-gsl6f 1轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入ImM的誘導 劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養6 小時。然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞。
[0060] D、菌細胞用磷酸鹽緩衝液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心lOmin，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白質電泳上樣緩衝液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心lOmin，用微量 移液器取出l〇ul的上清液樣品注入聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，最後當溴酚藍指示劑到 達距凝膠底部lcm左右的位置時，結束電泳。如圖4。
[0061] E、將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-GS16F1。純化後收集的各管融合蛋白進行了聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定如圖5。
[0062] F、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋 白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於家蠶蠶絲蛋白的多肽GS 16F1(TGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSG AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKL)〇
[0063] 天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟：
[0064] A、根據天蠶絲素蛋白重鏈胺基酸序列特徵及其編碼基因信息，設計併合成 (Invitrogen公司）了 SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "的編碼基因序列，設計的基因序列具有 以下特點：5'端設計了限制性核酸內切酶Agel，用來把合成的"-RGD-"基序克隆入含多克 隆位點的質粒。5'端下遊限制性核酸內切酶Bglll與3'端的BamHI是一對同尾酶，用於 單倍"-RGD-"基序的加倍。選擇實驗室保存的含常用多克隆位點的基礎質粒pSLFA1180FA 來完成"-RGD-"基序的克隆。質粒pSLFAl 180FA含有Agel、Bglll、BamHI、EcoRI等酶切位 點。"-RGD-"基因克隆的具體步驟為：用設計的5'端限制性核酸內切酶Agel和BamHI消 化PSLFA1180FA質粒，然後採用瓊脂糖凝膠電泳回收消化產物中的大片段，與設計合成的 "-RGD-"基因混合，用T4連接酶連接得到pSL-AYRl。
[0065] B、用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化質粒pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收 的小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一質粒pSL-AYRl獲得的載體中，T4連接酶連接構建 PSL-AYR2,獲得設計的"-RGD-"基因序列加倍。連接後同尾酶的位點Bglll和BamHI均消 失，形成了甘氨酸Gly和絲氨酸Ser的密碼子。採用同樣的方法加倍獲得4倍設計序列的 基因克隆質粒PSL-AYR4。
[0066] C、用核酸限制性內切酶Agel/BamHI消化質粒pSL-AYR4回收AYR4的基因片段， 插入Agel/BamHI消化的課題組保存的pCDNA-2質粒中pCDNA-AYR4,構建，然後採用Agel/ Hindlll消化pGEX-Agel回收條帶作為載體片段，同時用相同的內切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,並回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接後構建pGEX 系列表達載體，即 PGEX-AYR4,編碼的相應肽段為 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)。
[0067] D、構建的表達載體表達外源蛋白時具有GST的標籤，表達的產物融合蛋白記為 GST-RGD4。將構建的表達載體pGEX-AYR4轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入1. 2mM的誘導劑 異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養4小 時。然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞。
[0068] E、菌細胞用磷酸鹽緩衝液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心10min，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白質電泳上樣緩衝液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心10min，用微量 移液器取出lOul的上清液樣品注入聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，最後當溴酚藍指示劑到 達距凝膠底部lcm左右的位置時，結束電泳。如圖6。
[0069] F、將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-RGD4。純化後收集的各管融合蛋白進行了聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定如圖7。
[0070] G、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋 白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於天然彩色繭蠶絲蛋白的 多肽 RGD4 (GSTGRSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYG SGSSGS)。
[0071] 將製備好的絲蛋白肽段用於天然彩色新品種蠶鑑定。
[0072] 利用製備好的絲蛋白肽段，對經過基因突變產生的新品種蠶進行鑑定，對其突變 的基因進彳丁標記。
[0073] 對鑑定完畢的新品種，如果發現具有良好的遺傳特性，還可以用於新品種蠶的選 育。
【權利要求】
1. 用於天然彩色新品種蠶鑑定的絲蛋白肽段，其特徵在於，其基因序列包括家蠶絲H 鏈非結晶區基因、H鏈結晶區與非結晶區的重組基因以及天然彩色繭蠶柞蠶、天蠶蠶絲H鏈 基因片段。
2. 根據權利要求1所述的絲蛋白肽段，其特徵在於，所述的家蠶絲H鏈非結晶區基因構 建的表達載體為PGEX-F(I)，所述的H鏈結晶區與非結晶區的重組基因構建的表達載體為 pGEX-gsl6fl，所述的天然彩色繭蠶柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因片段的表達載體為pGEX-AYR4。
3. -種製備如權利要求1或2所述的絲蛋白肽段的方法，其特徵在於，包括家蠶品種蠶 絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因 的克隆、表達載體構建與表達，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與表達。
4. 如權利要求3所述的絲蛋白肽段的製備方法，其特徵在於，所述的家蠶品種蠶絲非 結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟： A、 對Invitrogen公司合成的家蠶品種蠶絲非結晶區基因的非重複序列肽段F(I)的編 碼基因序列，基因序列的一端設計有限制性核酸內切酶HindIII-Ng 0MIV位點，另一端設計 有AgeI-BglII位點，用已經保存的含多克隆位點的基礎質粒來完成非結晶區基因序列的 克隆，用限制性核酸內切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA，插入設計合成的含有BglII 和HindIII的粘末端非結晶區基因序列，T4DNA連接酶連接後得到含有完整非結晶區編碼 基因的質粒PSL-F(I); B、 由pGEX-KG經過改造加入限制性核酸內切酶AgeI位點得pGEX-Agel，Agel/Hindlll 酶切的PGEX-AgeI載體回收載體片段，Agel/Hindlll酶切質粒[pSl^F (1)回收插入片段， T4DNA連接酶連接構建含有非結晶區肽段基因的表達載體表示為pGEX-F(l); C、 將構建的表達載體pGEX-F (1)轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入0-1. 2mM的誘導劑異 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養0-8小 時，然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞； D、 菌細胞用適量的磷酸鹽緩衝液重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心 IOmin,收集上清液； E、 將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白 GST-F(I)； F、 採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋白經 凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於家蠶蠶絲蛋白的多肽F (1)。
5. 如權利要求3所述的絲蛋白肽段的製備方法，其特徵在於，所述的家蠶品種蠶絲結 晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟： A、 用AgeI酶切（GA) 16的質粒插入NgoMIV和AgeI酶切獲得的F(I)的基因序列，篩選 F(I) 3'端AgeI與NgoMIV粘末端的連接進行克隆，連接後酶切位點消失，形成Ala和Gly， 同時完成了家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆，所使用的克隆載體為凍存的 pCDNA-2,構建的質粒為 pCDNA-gsl6fl ; B、 用核酸限制性內切酶Agel/Hindlll消化質粒pGEX-Agel回收條帶作為載體片段， 同時用所述的核酸限制性內切酶Agel/Hindlll消化上述構建好的結晶區肽段與非結晶區 肽段的重組質粒，並回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接後構建 pGEX系列表達載體，S卩pGEX-gsl6fl，編碼的胺基酸序列為GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYS GYEYAffSSESDFAG(GS16F1)； C、 將構建的表達載體pGEX-gsl6f 1轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入0-1. 2mM的誘導劑 異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養0-8 小時，然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞； D、 菌細胞用適量的磷酸鹽緩衝液重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心 IOmin,收集上清液； E、 將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白 GST-GS16F1 ； F、 採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋 白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於家蠶蠶絲蛋白的多肽 GS16F1。
6.如權利要求3所述的絲蛋白肽段的製備方法，其特徵在於，所述的天然彩色繭品種 蠶絲基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟： A、 對Invitrogen公司設計併合成的SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "天蠶絲素蛋白重 鏈胺基酸序列的編碼基因序列，5'端設計有限制性核酸內切酶AgeI和BglII的位點， 3'端設計有限制性核酸內切酶BamHI的位點，用實驗室保存的含多克隆位點的基礎質粒 PSLFA1180FA來完成"-RGD-"基序的克隆，具體步驟為：用限制性核酸內切酶AgeI和BamHI 消化PSLFA1180FA質粒，然後採用瓊脂糖凝膠電泳回收消化產物中的大片段，與設計合成 的"-RGD-"基因混合，用T4連接酶連接得到pSL-AYRl ; B、 用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化質粒pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收的 小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一質粒pSL-AYRl獲得的載體中，T4連接酶連接構建 PSL-AYR2,獲得設計的"-RGD-"基因序列加倍，連接後同尾酶的位點BglII和BamHI均消失， 形成了甘氨酸Gly和絲氨酸Ser的密碼子，採用同樣的方法加倍獲得4倍設計序列的基因 克隆質粒PSL-AYR4 ; C、 用核酸限制性內切酶Agel/BamHI消化質粒pSL-AYR4回收AYR4的基因片段，插 入Agel/BamHI消化的課題組保存的pCDNA-2質粒中pCDNA-AYR4,構建，然後採用AgeI/ HindIII消化pGEX-Agel回收條帶作為載體片段，同時用相同的內切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,並回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接後構建pGEX 系列表達載體，即 PGEX-AYR4,編碼的相應肽段為 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)； D、 將構建的表達載體PGEX-AYR4轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入0-1. 2mM的誘導劑異 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養0-8小 時，然後用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞； E、 菌細胞用適量的磷酸鹽緩衝液重懸，置於冰上超聲破碎後13300r/min的速度離心 IOmin,收集上清液； F、 將超聲破碎後收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白 GST-RGD4 ； G、採用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型穀胱甘肽後，融合蛋白經 凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源於天然彩色繭蠶蠶絲蛋白的多 肽R⑶4。
【文檔編號】C07K19/00GK104232665SQ201410353375
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】王建南, 裔洪根, 褚永興 申請人:湖州南潯恆嶽農業科技有限公司