一種結核分支桿菌活菌rna提取方法及其檢測試劑盒的製作方法

2023-12-10 06:10:27 2

專利名稱：一種結核分支桿菌活菌rna提取方法及其檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體涉及一種用於定量檢測結核分支桿菌活菌的螢光定 量RT-PCR試劑盒，通過對從臨床痰液中提取的結核分支桿菌活菌RNA逆轉錄成cDNA，再結 合實時螢光定量PCR檢測技術，可以精確定量待測標本中的結核分支桿菌活菌。
背景技術：
自1882年Koch發現結核分枝桿菌是結核病的病原菌以來的IOO餘年，人類對結 核分枝桿菌的生物學特性、致病機制、耐藥機制、診斷方法、抗結核藥物的研製等方面都取 得了巨大的成就。而如今，結核病仍然是影響人類健康流行性最廣，病死率最高的感染性疾 病之一。尋求快速、準確的診斷方法一直是結核病學首要研究的領域。
近10年來，隨著分子生物學的發展，對結核分支桿菌的DNA研究頗多，它們的高敏 感、高特異和快速性給結核病的診斷帶來新的期望。但DNA是穩定的核酸分子，但DNA是穩 定的核酸分子，半衰期長，在接受標準有效化療的肺結核患者的痰標本，培養轉陰後180天 仍有25%的標本DNA檢測陽性。可能的解釋有死菌及DNA裂解的延滯和L型培養以及持留 菌、休眠菌的存在等。可見，以DNA為基礎的檢測，存在平臺效應，不能用於結核分支桿菌的 活菌診斷。 rRNA是核糖體內的遺傳物質，在原核生物中有多個拷貝存在，結核分支桿菌的 rRNA有近5000個拷貝。有學者在觀察分支桿菌體內外死亡降解的過程時發現，核糖體是第 一個伴隨細菌活力消失而降解的超微結構，因而認為rRNA可作為結核分支桿菌的活菌標 志。Van der Vliet等通過體外擴增16SrRNA進行分支桿菌活菌檢測和藥敏試驗時發現，該 方法能在3 7天內獲得藥敏試驗結果，可計算出各藥的藥效學參數。但Hellyer等的研 究結果顯示結核分支桿菌的rRNA水平在含藥培養基中72h內無明顯變化。Moore等通過臨 床觀察發現，rRNA也顯示平臺效應。所以，rRNA在用於結核分支桿菌藥敏試驗和化療監測 時仍存在很大的局限性，也不能用於結核分支桿菌的活菌診斷。 原核生物的mRNA分子，半衰期很短(僅有3 5min)，僅存在於活的、有代謝活性 的菌體中，一般認為mRNA是一活性增殖細胞的很好的分子標記物。所以，以mRNA為靶點的 檢測只能是活菌，是監測藥物敏感性和化療反應的很好的分子指標。結核分支桿菌的85-B mRNA編碼結核分支桿菌85-B蛋白，85-B蛋白是結核分支桿菌的主要分泌性蛋白抗原85-B 複合物的成分之一，85-B複合物是結核分支桿菌的特異性分泌蛋白，是在液體培養基和巨 噬細胞系統中表達最豐富的蛋白之一，所以活菌細胞內存在豐富的85-B mRNA分子。因此， 確定以85-B mRNA為靶點可檢測結核分支桿菌的活菌。 螢光定量PCR技術的出現，為我們提供了一個定量檢測85-B mRNA的準確方法。 1966年美國Applied Biosystems公司推出了實量螢光定量PCR技術，該技術融匯了 PCR高 靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量等優點，直接探測PCR過程中螢光信 號的變化以獲得定量結果，不需要PCR後處理或電泳檢測，完全閉管操作， 一舉克服了常規 PCR技術的諸多難題。與常規PCR相比，有以下優點1、可以進行準確的定量檢測，可用於
4適用基因診斷的各種疾病。以HBV-DNA為例，它不僅能檢測出B肝病毒在病人體內的複製、 傳染的情況，更重要的是能作為一個量化指標，能定量檢測出病人體內的病數，可以動態地 觀察病情病程，觀察治療效果，作為臨床治療的一個指標，可判斷藥物療效，指導臨床醫師 選擇有效藥物，確定藥劑、藥量和療程以及分析治療效果，確定進一步治療方案等方面，有 著重要而現實的意義。2、特異性極強，克服了假陽性的主要來源。3、定量範圍寬，樣品無需 梯度稀釋。4、操作迅速，無需PCR後處理，自動化程度高。 所謂實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號 積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在螢光 定量PCR技術中，通常以PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，螢光閾值 的預設設置是6-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍，而將每個反應管內的螢光信號 到達設定的閾值時所經歷的循環數設為Ct值。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起 始拷貝數的對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的參考 品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱橫標代表Ct值。因此，只要獲得 未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。 實時螢光定量PCR擴增過程中加入一對引物的同時也加入一條特異的螢光探針， 目前常用的為TaqMan螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和 一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發的螢光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒 光；在PCR擴增過程中，Taq酶的5' _3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和 淬滅基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號。每個循環過程結束檢測一次螢光強 度，反應結束後，便可得一條工作曲線。 由於螢光定量PCR具有重複性好，靈敏度高，定量結果準確可靠的特點，所以醫學 檢測方面，一些常規檢測方法所不能解決的問題得到了解決。例如，細胞形態學檢查可直接 觀測到腫瘤細胞，但由於腫瘤脫落至血循環中的數目微小，這種檢查的敏感性和特異性均 較差，陽性率低。免疫組織化學方法提高了血循環中腫瘤細胞染色的特異性，特別是單克隆 抗體的應用使染色的特異性和敏感性有了較大的改善，可查出104_105個有核細胞中的一 個腫瘤細胞。但該技術則需要特異性的抗體，生產相對複雜。同時，假陽性限制了此項技術 的廣泛應用。與這些技術相比，螢光定量PCR技術有著明顯的優點，螢光定量PCR簡便易 行，只要知道待測基因序列，即可設計合成引物進行逆轉錄及擴增；該方法具有較高的靈敏 度及可重複性，也保證了醫學檢測結果的準確性。

發明內容
所要解決的技術問題 本發明涉及一種結核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測試劑盒，具體是，本發 明提供結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)活菌RNA提取方法，以及運用該方法 結合螢光定量PCR技術獲得的結核分支桿菌活菌檢測試劑盒；該試劑盒能夠準確、靈敏、快 速鑑別結核分支桿菌的死活菌，而且能夠降低成本及縮短檢測時間，更為重要的是還是結 核病的診斷、藥物敏感性實驗、化療反應監測、新抗結核藥物篩選及結核病預防等研究的基 礎。 技術方案
本發明提供一種結核分支桿菌活菌檢測方法，其特徵在於，它具有快速、高質量提 取RNA的方法和檢測試劑盒。 本發明提供RNA提取方法，其操作步驟包括 ①在痰液標本中加入2倍體積的4% NaOH溶液(自備)，吹打均勻後室溫放置30 分鐘使之液化。取約lml液化痰液，15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留50 左右沉 澱，在沉澱中加入1XTE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留 50iU左右沉澱，在沉澱中加入1XTE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心lOmin，吸 棄上清，保留5iU左右沉澱。 ②在沉澱中加入0. 5ml Trizol試劑，旋渦振蕩10sec，室溫放置5min。③加入0. lml氯仿，振蕩混勻充分乳化、不分層，4t: 15， OOOrmp離心10min。吸取
上清到另一無RNA酶的1. 5ml離子管。 ④加入等體積的異丙醇，振蕩混勻後室溫放置10min，4°C 15， OOOrmp離心lOmin後 小心棄去上清。 ⑤加入75 %冰乙醇500 ill ，振蕩懸起沉澱後於4°C 、 15， OOOrmp離心10min，小心棄 去上清。乾燥5 lOmin後使乙醇揮發。 ⑥沉澱中加入10ii1 DNase I處理緩衝液(1 P 1 lOXDNase I Buffer、2U 的DNase I (RNase-free)禾P DEPC水)，室溫(37 °C )孵育15min後；加入1 yl的20mM EDTA(RNase-free) ，7(TC放置5min，4。C 13， OOOrmp離心lmin即可進行RT-PCR，或-70。C保 存l周左右。 本發明提供檢測試劑盒的特異性引物探針，包括如下序列 上遊引物SEQ ID N01 :5' -CGC GCC CAA GAC GAC TAC A -3' 下遊引物SEQ ID N02 :5' -AGG CCG GGC TGTACC AGT-3'檢測探針SEQ ID N03 :5' -MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCT TCT_MAR-3， 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列； 或者與上述序列同源性大於85 %的序列； 或者上述序列的鹼基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。 上述的一組結核分支桿菌(MTB)活菌螢光定量RT-PCR引物和探針的優選技術方案。 本發明提供檢測試劑盒組成包括細胞裂解液、水、含有權利要求3所述引物序列 SEQ ID N01-2的RT-PCR反應液、含有權利要求3所述探針序列SEQID N03的檢測探針、逆 轉錄酶、DNA聚合酶、參考品、陽性對照和陰性對照。 所說的RT-PCR反應液組成為RT-PCR緩衝液、MgCl2、特異弓|物對、dNTPs、無RNA酶 的水。 上述檢測試劑盒的參考品為如下DNA序列SEQ ID N04 : 5' -CGCGCCCAAG ACGACTACAA CGGCTGGGAT ATCAACACCCCGGCGTTCGA GTGGTACTAC CAGTCGGGAC TGTCGATAGTCATGCCGGTC GGCGGGCAGT CCAGCTTCTA CAGCGACTGGTACAGCCCGG CCT_3，。 作為特例，參考品是含有插入結核分支桿菌(MTB)特異性保守序列的T載體，該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖。 上述檢測試劑盒所說的水為無RNA酶的水。 —般，無RNA酶的水獲得方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃 度為0.01% (V/V)，室溫(22-25°C)放置10-12小時後，121°C， 20分鐘高壓，室溫放置備 用； 上述檢測試劑盒所說的陰性對照為無結核分支桿菌(MTB)活菌的正常人痰液樣 本。 上述檢測試劑盒所說的陽性對照為含有結核分支桿菌(MTB)活菌的患者痰液樣 本。 上述檢測試劑盒所說的細胞裂解液由細胞裂解液I和細胞裂解液II組成。
作為特例，細胞裂解液I組成為320mM蔗糖、5mM MgC12、l% TritonX-100， 10mM Tris-HCl[pH7. 5]、水； 作為特例，細胞裂解液II組成為4M硫氰酸胍、0. 75M檸檬酸鈉(pH7. 0)和10% 月桂醯基肌氨酸鈉(Sarcosyl lg/10mL) 、14. 3M P -巰基乙醇JM醋酸鈉(pH4. 0)和水飽和 酚； 上述各方案中所說的逆轉錄酶和DNA聚合酶在試劑盒中的形式可以為混合兩種 酶的混合液。 一般而言，DNA聚合酶選用耐熱T叫DNA聚合酶。 上述檢測試劑盒各組分的量為細胞裂解液I 1瓶24mL、細胞裂解液II 1瓶6mL、 無RNA酶的水1瓶2mL、RT-PCR反應液1管210 y 1、檢測探針1管30 y L、參考品1管10 y L、 和陰性對照品l管10iiL。 本試劑盒中的細胞裂解液(即RNA總提取試劑)應於fC保存，RT-PCR試劑保存 於-2(TC，儘量減少反覆凍融。 本發明還提供所說的試劑盒的使用方法如下
首先，每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。
樣品要求
1 2ml結核病患者痰液樣本。 採集結核病患者痰液1 2ml，倒入15ml刻度離心管(血痰加等量細胞裂解液I 混勻靜置3 5min)，加入等量lg/dl胰酶Hanks液，置37。C水浴消化，直至痰液被完全消 化為止，混勻，分別吸500 ii 1到1. 5ml離心管中，再加入4g/dlNaOH處理3 5min離心留 沉澱。樣本處理後應立即使用，若不能立即使用，可以4t:保存1-2小時，但時間不宜再過 長，否則將影響檢測結果。
操作步驟
—、總RNA提取 1.在處理好的痰液標本(沉澱)中加入500 ii L細胞裂解液II，用移液器反覆吹 打混勻，室溫放置5分鐘。 2.加200iiL三氯甲烷，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4°C 15， OOOrpm 離心10分鐘，將上清移入新的離心管。 3.加入等體積異丙醇，旋渦振蕩5秒，室溫沉澱10分鐘，4°C 15， OOOrpm離心5分
鍾，棄上清。
7
4.加入500ii L預冷的75X乙醇洗滌，上下顛倒10次，4。C 10， OOOrpm離心5分鐘， 吸乾上清，沉澱室溫乾燥10-20分鐘，加入20 ii L無RNA酶水稀釋混勻，立即使用或-7(TC保 存。 二、RT-PCR 將裝有RT-PCR反應液、MTB檢測探針、混合酶、參考品、對照品的離心管從_20°C中 取出，置於冰盒上待其緩慢融化後，低速離心，用移液器將上述試劑RT-PCR反應液，混勻， 低速離心，置於冰盒上備有。 按下列組成配製RT-PCR反應體系(30 ii L體系)
RT-PCR反應體系
RT-PCR反應液 21iiL MTB檢測探針 3 PL
混合酶 2 u L
RNA模板 4 ii L RT-PCR反應條件37。C 30分鐘；95。C 5分鐘;(95°C 10秒，60°C 45秒，40個循環)。
三、標準曲線的製作 將參考品貯存液(6X107copies/ii L)梯度稀釋為6X 106， 6X 105， 6X 104， 6X 103， 6X 102，6X 10、取4ii L為模板，同待測樣品一同進行RT-PCR擴增，製作標準定量曲線。
結果判斷
1.使用實時螢光定量PCR儀的隨機軟體進行文件保存及閾值的設定。
2.選中不同濃度參考品，應用相應軟體進行分析，得出標準曲線及相關信息。
3.選中所有樣品檢測測孔，應用相應軟體進行分析，得出待測樣品的起始模板數 (M)。 有益效果 本發明建立了利用TaqMan技術檢測結核分支桿菌活菌的方法，並且經過對結核 病患者痰液標本進行檢測，表明該法切實可行。由於本方法採用了螢光定量PCR，使得結核 分支桿菌活菌的檢測敏感性和特異性大大的提高，降低了常規PCR擴增的假陽性率，從而 使得本發明可以在極少量的標本中獲得足夠的信息。 在本檢測項目中，本發明採用了目前最為先進的實時螢光定量PCR檢測技術，在 保持高敏感性的前提下，儘量減少假陽性的幹擾。在實量螢光定量PCR檢測技術出現之前， 人們對PCR模板的定量都要通過PCR產物電泳，再將電泳結果經計算機圖像處理，根據電泳 條帶的高度來確定最終PCR產物量的多少，或將帶標記的PCR產物以ELISA的方式進行檢 測，再由此推測出起始模板的量，但這些方法實際上都有屬於半定量水平，因為即使PCR條 件已最優化，電泳及後續步驟的操作的不穩定性仍會給結果的分析帶來影響，從而影響定 量這一 目的。隨著本發明實時螢光定量PCR技術的應用，可以真正地做到對PCR模板的精 確定量，這種定量不僅保持了常規PCR的高敏靈性，而且由於特異性螢光探針雜交技術的
8應用，使得被子檢測基因的特異性大大提高。 本發明的引物、探針和試劑盒採用螢光定量RT-PCR方法，該方法靈敏、特異、重複性好，結果用拷貝數表示，準確可靠，利於統一標準。方法靈敏，重組質粒定量模板，按io倍梯度稀釋，可檢出IO個拷貝，並由此制出標準曲線，線性範圍寬(0 107拷貝)，方法的穩定性、重複性、相關性好，相關係數為0.997。螢光定量RT-PCR方法是結核分支杆活菌的診斷、藥物敏感性實驗、化療反應監測、新抗結核藥物篩選及結核病預防等研究基礎。結核分支桿菌的藥物敏感性試驗，特別是化療療效的評價對活菌的存在有嚴格的依賴性。因此，結核分支桿菌活菌的檢測具有臨床意義及廣泛的應用價值。


圖1為樣本標準檢測圖。
圖2為樣品標準曲線圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。 下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆操作手冊，或按照製造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠，Trizol試劑購自上海生工公司，限制性內切酶購自上海申能博彩生物公司，匪LV逆轉錄酶、T叫DNA聚合酶、01igo(dT)15—18均購自美國Promega公司，引物和探針均由上海生工公司合成。E卯endorf梯度式PCR擴增儀購自德國E卯endorf公司，PE7500螢光PCR儀為ABI公司產品。
實施例1 實時螢光定量RT-PCR法檢測結核分支桿菌活及其應用
—、引物及探針設計與合成 以結核分支桿菌全長cDNA序列(GenBank登錄號NC_000962)為模板，使用Oligo軟體分析TaqMan引物和探針的位點，並根據同時考慮結核分支桿菌基因組DNA序列的情況，從中選擇最佳組合。 參考品PCR上遊引物序列為5' -CTG CGG TTT ATC TGC TCG AC-3';下遊引物序列為5' —GAC AGC GAG CCG GCG TAG A—3'; 檢測用PCR上遊引物序列為5' -CGC GCC CAA GAC GAC TAC A-3';下遊引物序列為5' -AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3'; 螢光探針序列為5' -MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCT TCT_MAR-3，；
二、檢測參考品製備 採集結核病患者痰液1 2ml，倒入15ml刻度離心管(血痰加等量細胞裂解液I混勻靜置3 5min)，加入等量lg/dl胰酶Hanks液，置37。C水浴消化，直至痰液被完全消化為止，混勻，分別吸500 ii 1到1. 5ml離心管中，再加入4g/dlNaOH處理3 5min離心留
9沉澱。採用TRIzol試劑提取總RNA，取1 ii gRNA，在25 y L總反應體系中用Oligo (dT)15—18為引物對其進行逆轉錄後，用參考品上、下遊引物在Eppendorf梯度式PCR擴增儀上進行PCR擴增，反應條件為95。C變性5分鐘，再按95°C 20秒、56。C 20秒、72。C 45秒進行35個循環擴增，最後於72t:延伸7分鐘後置於4°C。 PCR擴增產物經電泳檢測後送上海超世生物公司進行克隆(質粒由應公司提供)，並將陽性克隆經測序驗證(由上海英駿公司測序)。提取陽性克隆質粒，即為參考品，測定其濃度並換算成(拷貝數/體積)。
三、標本檢測 取5例經確定的結核病患者和2例正常人痰液標本1. 5ml，加入等量lg/dl胰酶Hanks液，置37t:水浴消化，直至痰液被完全消化為止，混勻，分別吸500 y 1到1. 5ml離心管中，再加入4g/dlNaOH處理3 5min離心留沉澱，用TRIzol試劑提取總RNA，取4 y L RNA提取液，在30 ii L總反應體系中，用檢測用上、下遊引物在PE7500螢光PCR儀上進行PCR擴增，反應條件均為37。C保溫30分鐘，95。C變性5分鐘，再按95°C 10秒、6(TC 45秒進行40個循環擴增，同時加入參考品檢測作標準曲線，測定結果經儀器處理根據標準曲線計算出
檢測標本的拷貝數。 五、結果( — )參考品的製備 經測序，上述設計的參考品完全與預期相符，回收的參考品片段序列如下
5' -CTGCGGTTTA TCTGCTCGAC GGCCTGCGCG CCCAAGACGACTACAACGGCTGGGATATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGGTACTACCAGT CGGGACTGTC GATAGTCATGCCGGTCGGCGGGCAGTCCAG CTTCTACAGC GACTGGTACA GCCCGGCCTGCGGTAAGGCT GGCTGCCAGACTTACAAGTG GGAAACCTTCCTGACCAGCG AGCTGCCGCA ATGGTTGTCC GCCAACAGGGCCGTGMGCCCACCGGCAGC GCTGCAATCG GCTTGTCGATGGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG-3'
(二)樣品檢測 參考品檢測結果見圖l，標準曲線見圖2。 5例患者(其中一例已治癒)和5例正常人痰液標本螢光定量RT-PCR檢測結果如下編號性別年齡標本拷貝數(copies/mL)1男64痰液2. 11X1022女40痰液5. 18X1053女33痰液1. 90X1034男56痰液5. 44X1025女49痰液6男52痰液7男46痰液8女29痰液9女58痰液10男66痰液 同樣的10例樣本，採用以DNA為檢測模板的試劑盒進行檢測。麼、司的結核分支桿菌(TB)核酸擴增
性別 年齡 標本
女
女男女
女女
3356495246295866
6440
痰液痰液痰液痰液痰液痰液痰液痰液
痰液痰液
拷貝數(copies/mL)4. 38X1047. 417X106
3. 88X1043. 75X1046. 620 X103 實驗方案如下 試劑盒採用上海復星醫學科技發展有限公(PCR)螢光檢測試劑盒(檢測方法詳見使用說明書)。 5例患者(其中一例已治癒)和5例正常人外周血標本原位RT-PCR檢測結果如下編號[O川]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 可見，結核分支桿菌螢光檢測試劑盒檢測結果拷貝數高於以mRNA為模板的結核分支桿菌活菌螢光定量RT-PCR檢測試劑盒，但其中一例已治癒患者仍然被檢測出為陽性，說明可能有死菌及DNA裂解的延滯和L型培養以及持留菌、休眠菌的存在等，因此不能為結核分支杆活菌的診斷、藥物敏感性實驗、化療反應監測、新抗結核藥物篩選及結核病預防等提供基礎性研究。0123] 核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
〈110〉上海復星醫藥(集團)股份有限公司
上海復星醫學科技發展有限公司〈120〉 一種結核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測試劑盒〈130>081010〈140>CN
〈141>2008-10-10〈160>4
〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>19〈212>DNA
〈213>Mycobacterium tuberculosis〈220〉
〈221>SEQ ID N01〈222〉 (1) (19)〈400>1
cgcgcccaag acgactaca 19
0124]0125]0126]0127]0128]0129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]:0142] 〈210>2
:0143] 18
:0144] 〈212>DNA
:0145] 〈213〉Mycobacterium tuberculosis
:0146] 〈220〉
:0147] SEQ ID N02
:0148] 〈222〉 (1) (18)
:0149] 〈400>2
:0150] aggccgggct gtaccagt 18
:0151] 3
:0152] 〈211>23
:0153] 〈212>DNA
:0154] 〈213>Mycobacterium tuberculosis
:0155]
:0156] 〈221>SEQ ID N03
:0157] 〈222>(1). . (21)
:0158] 〈223> "n =廳"，"y =應"
:0159]
:0160] 〈221>misc_feature
:0161] 〈222>(1). . (1)
:0162] 〈400>3
:0163] ntcggcgggc agtccagctt cty 23
:0164] 〈210>4
:0165] 〈211>133 〈212>DNA Mycobacterium tuberculosis 〈220〉 〈221>SEQ ID N04 〈222>(1). (133) 〈400>4 cgcgcccaag acgactacaa cggctgggat atcaacaccc cggcgttcga gtggtactac 60 cagtcgggac tgtcgatagt catgccggtc ggcgggcagt ccagcttcta cagcgactgg 120 tacagcccgg cct 13權利要求
一種結核分支桿菌活菌檢測方法，其特徵在於，它具有快速、高質量提取RNA的方法和檢測試劑盒。
2. 根據權利要求1所述的RNA提取方法，其操作步驟包括① 在痰液標本中加入2倍體積的4% NaOH溶液(自備)，吹打均勻後室溫放置30分鐘 使之液化。取約lml液化痰液，15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留50 y 1左右沉澱，在沉 澱中加入1 X TE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留50 左 右沉澱，在沉澱中加入1XTE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心lOmin，吸棄上清， 保留5iU左右沉澱。② 在沉澱中加入0. 5ml Trizol試劑，旋渦振蕩10sec，室溫放置5min。③ 加入0. lml氯仿，振蕩混勻充分乳化、不分層，4t: 15， OOOrmp離心10min。吸取上清 到另一無RNA酶的1. 5ml離子管。④ 加入等體積的異丙醇，振蕩混勻後室溫放置10min，4。C 15， OOOrmp離心10min後小心 棄去上清。⑤ 加入75 %冰乙醇500 ill ，振蕩懸起沉澱後於4°C 、 15， OOOrmp離心10min，小心棄去上 清。乾燥5 lOmin後使乙醇揮發。 沉澱中加入10 ii 1 DNase I處理緩衝液(1 ii 1 lOXDNase I Buffer、2U的 DNase I (RNase-free)和DEPC水)，室溫(37 °C )孵育15min後；力Q入1 ii 1的20mM EDTA(RNase-free) ，7(TC放置5min，4。C 13， OOOrmp離心lmin即可進行RT-PCR，或-70。C保 存1周左右。
3. 根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，它具有特異性引物和探針，包括如 下序列上遊引物SEQ ID NOl :5' -CGC GCC CAA GAC GAC TAC A -3， 下遊引物SEQ ID N02 :5' -AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3' 檢測探針SEQ ID N03 :5'-廳-TCG GCG GGC AGT CCA GCTTCT-廳-3， 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列； 或者與上述序列同源性大於85%的序列； 或者上述序列的鹼基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4. 根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，其組成包括細胞裂解液、水、含有 權利要求3所述引物序列SEQ ID N01-2的RT-PCR反應液、含有權利要求3所述探針序列 SEQ ID N03的檢測探針、逆轉錄酶、DNA聚合酶、參考品、陽性對照和陰性對照。
5. 根據權利要求4所述的檢測試劑盒的組成，其特徵在於，所說的參考品為如下DNA序 列SEQ ID N04 :5' -CGCGCCCAAG ACGACTACAA CGGCTGGGAT ATCAACACCCCGGCGTTCGA GTGGTACTAC CAGTCGGGAC TGTCGATAGTCATGCCGGTC GGCGGGCAGT CCAGCTTCTA CAGCGACTGGTACAGCCCGG CCT-3，。
6. 根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所說的水為無RNA酶的水。
7. 根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所說的陰性對照為無結核分支杆 菌活菌的正常人痰液樣本。
8. 根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所說的陽性對照為含有結核分支 桿菌活菌的患者痰液樣本。
9. 根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所說的細胞裂解液由細胞裂解液I 和細胞裂解液II組成。
10. 根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於，每盒中各組分的量為細胞裂解 液I l瓶24mL、細胞裂解液I1 1瓶6mL、無RNA酶的水l瓶2mL、RT-PCR反應液l管210iiL、 檢測探針1管30 ii L、參考品1管10 ii L、和陰性對照品1管10 ii L。
全文摘要
本發明涉及一種結核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測試劑盒，具體是，本發明提供結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)活菌RNA提取方法，以及運用該方法結合螢光定量PCR技術獲得的結核分支桿菌活菌檢測試劑盒；該試劑盒能夠準確、靈敏、快速鑑別結核分支桿菌的死活菌，而且能夠降低成本及縮短檢測時間，更為重要的是還是結核病的診斷、藥物敏感性實驗、化療反應監測、新抗結核藥物篩選及結核病預防等研究的基礎。
文檔編號C12Q1/68GK101760518SQ20081020163
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者吳大治, 夏懿, 沈維祥 申請人:上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司