一種抗腫瘤藥物組合物的製作方法

2023-12-10 06:09:07

一種抗腫瘤藥物組合物的製作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬於生物醫藥領域，更具體地，涉及一種抗腫瘤藥物組合物。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長 的正常調控導致異常增生與分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止 生長，他的生長不受正常機體生理調節，而是破壞正常組織與器官，這一點在惡性腫瘤尤其 明顯。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長速度快，呈浸潤性生長，易發生出血、壞死、潰瘍等，並 常有遠處轉移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發熱以及嚴重的臟器功能受損等，最 終造成患者死亡。
[0003] 目前抗腫瘤藥物是研究熱點，更有效的抗腫瘤藥物，仍有待研發。

【發明內容】

[0004] 針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種抗腫瘤藥物組合物，其 目的在於通過纖維蛋白調控藥物和腫瘤抑制劑的有機結合，由此提供一種具有優良抗癌效 果和較佳靶向的抗腫瘤組合物。
[0005] 為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種抗腫瘤藥物組合物，包括兩 周給藥劑量的纖維蛋白調控藥物和腫瘤抑制劑。
[0006] 優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其纖維蛋白調控藥物為溶栓藥物和/或抗凝藥 物。
[0007] 優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其溶栓藥物為鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原 激活劑、重組組織型纖溶酶原激活劑、單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶厥徽活劑、或乙醯化纖溶 酶厥-鏈激酶激活劑複合物。
[0008] 優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其抗凝藥物為注射用抗凝藥物、口服抗凝藥物或 凝血酶抑制劑;所述注射用抗凝藥物優選肝素、小分子肝素；所述口服抗凝藥物優選華法 林、雙香豆素，硝酸香豆素;所述凝血酶抑制劑優選水蛭素或阿加曲班。
[0009] 優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其腫瘤抑制劑為游離腫瘤抑制劑和/或腫瘤抑制 劑納米製劑。
[0010] 優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其瘤抑制劑為紫杉醇、阿黴素、多柔比星或基因 藥物。
[0011]優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其納米製劑為聚乙二醇-高分子材料納米乳。
[0012] 優選地，所述抗腫瘤藥物組合物，其高分子材料為聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚 己內酯或二硬脂醯磷脂醯乙醇胺。
[0013] 總體而言，通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，能夠取得下列有 益效果：
[0014] 本發明採用纖維蛋白調控藥物和腫瘤抑制劑結合，並控制纖維蛋白調控藥物的用 量，從而提高腫瘤抑制劑的遞送效果，通過增加具有正常功能的血管數量，來增加抗腫瘤藥 物的遞送，從而達到良好的抗腫瘤效果。
【附圖說明】
[0015] 圖1是實施例1建立荷A549肺癌的皮下腫瘤模型，檢測rtPA給藥對腫瘤內纖維蛋白 表達影響的實驗結果;其中圖IA為免疫9?光實驗結果，圖IB為Elisa結果。
[0016] 圖2是實施例2中rtPA對腫瘤內血流灌注的影響，並與生理鹽水組比較;其中圖2A 為免疫螢光實驗結果，圖2B為Image J統計的半定量結果。
[0017]圖3是實施例2納米粒的表徵結果，圖A為電鏡結果，圖B為粒徑儀測試結果。
[0018]圖4是實施例3建立荷A549肺癌的皮下腫瘤模型，用近紅外染料DiR標記納米粒，觀 察納米粒在rtPA處理組及生理鹽水組腫瘤內的分布差異。
[0019] 圖5是實施例4建立荷A549肺癌的皮下腫瘤模型，用香豆素 -6標記納米粒，觀察納 米粒在rtPA處理組及生理鹽水組腫瘤切片內的分布差異。
[0020] 圖6是實施例5及實施例6建立荷A549肺癌皮下腫瘤動物模型，評價rtPA聯合納米 藥物對胰腺癌的治療情況。共分為四組:生理鹽水組，rtPA組，生理鹽水+NP-PTX組和rtPA+ NP-PTX組；圖6A為腫瘤的體積變化，圖6B為動物體重變化，圖6C為處死動物後剝離的腫瘤， 圖6D為剝離腫瘤的重量，圖6E為上述剝離的腫瘤行石蠟包埋切片後的TUNEI凋亡染色(放大 倍數分別為100倍）。
【具體實施方式】
[0021] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並 不用於限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特徵只要 彼此之間未構成衝突就可以相互組合。
[0022] 本發明提供的抗腫瘤藥物組合物，包括兩周給藥劑量的纖維蛋白調控藥物和腫瘤 抑制劑。
[0023]所述纖維蛋白調控藥物為溶栓藥物和/或抗凝藥物。所述溶栓藥物為鏈激酶、尿激 酶、組織型纖溶酶原激活劑（tPA)、重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)、單鏈尿激酶型纖維 蛋白溶酶厥徽活劑(SCUPA)、或乙醯化纖溶酶厥-鏈激酶激活劑複合物(APSAC)。所述抗凝藥 物為注射用抗凝藥物、口服抗凝藥物或凝血酶抑制劑;所述注射用抗凝藥物優選肝素、小分 子肝素;所述口服抗凝藥物優選華法林、雙香豆素，硝酸香豆素;所述凝血酶抑制劑優選水 蛭素或阿加曲班。
[0024] 所述腫瘤抑制劑為游離腫瘤抑制劑和/或腫瘤抑制劑納米製劑。所述腫瘤抑制劑 為紫杉醇、阿黴素、多柔比星或基因藥物。所
[0025] 所述腫瘤抑制劑的納米製劑，優選為表面聚乙二醇修飾的脂質體、納米粒、聚合物 泡囊、聚合物膠束、固體脂質納米粒。腫瘤抑制劑以包裹或共價連接的方式與納米載體結 合，所述納米製劑粒徑為10-300nm〇
[0026] 述納米製劑進一步優選為聚乙二醇-高分子材料納米乳。所述高分子材料為聚乳 酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚己內酯或二硬脂醯磷脂醯乙醇胺。聚乙二醇分子量為1000- 20000Da，優選2000-5000Da，聚乳酸分子量為 5000-50000Da，優選20000-4000Da。
[0027]本發明抗腫瘤組合物的抗腫瘤效果按照如下方法測定：
[0028]以PEG-PLA為載體，採用單乳法製備納米粒。Zeta/雷射粒度儀測定納米粒的平均 粒徑和電位，透射電鏡觀察其形態。
[0029] 建立皮下荷A549肺癌動物模型，調控腫瘤內纖維蛋白的形成後，通過免疫螢光和 El isa技術評價腫瘤內纖維蛋白的變化情況。
[0030] 採用免疫螢光評價調控腫瘤內纖維蛋白後，腫瘤內部灌流的變化情況。
[0031] 用紅外染料DiR標記納米粒後，通過小動物活體成像儀評價調控腫瘤內纖維蛋白 後，納米載體在實驗組和對照組的腫瘤內富集差異。
[0032] 用綠色螢光探針香豆素-6標記納米粒後，通過冰凍切片觀察調控腫瘤內纖維蛋白 後後，納米載體在實驗組和對照組的腫瘤內分布差異。
[0033]通過腫瘤生長抑制實驗，評價本發明提供的抗腫瘤組合物對A549腫瘤的抑制效 果。
[0034] 本發明提供的組合物具有良好的抗腫瘤效果，可能是由於以下原因：
[0035] 腫瘤內部的有效血液灌流是腫瘤遞藥的基礎。腫瘤的新生血管由於周細胞缺乏， 基底膜不完整而功能不完善，加上細胞外基質在一定程度上擠壓瘤內血管，腫瘤內的血流 灌注往往低於周圍正常組織，從而阻止藥物有效到達腫瘤從而影響腫瘤的藥物遞送。為了 增加腫瘤內的灌注，血管豐富和基質豐富的腫瘤其策略有所不同。針對血管豐富的腫瘤，既 往研究一般採用血管正常化的手段。由於這種促進血管正常化的手段在一定程度上減少了 血管內皮細胞之間的空隙，一般只能增加小分子藥物或者粒徑偏小的納米藥物（10-40nm) 的遞送，無法增加 IOOnm左右的納米藥物的遞送。
[0036] 纖維蛋白作為凝血瀑布的終產物，除了在內皮損傷部位富集外，還可以作為腫瘤 基質的成分之一在腫瘤細胞外沉積，並且呈交聯狀態，與血栓、損傷部位的纖維蛋白結構類 似。腫瘤基質中纖維蛋白主要是由於腫瘤血管的滲漏性以及腫瘤細胞表面的組織因子共同 作用而形成。正常組織由於血管內皮的完整性而不會有纖維蛋白的表達。纖維蛋白除了具 備高度的腫瘤特異性外，其瘤內分布也在存在一定的位置特異性。對於血管較為豐富的腫 瘤，腫瘤內的纖維蛋白主要分布於血管附近，這是由於纖維蛋白原滲入血管後即被腫瘤內 過表達的組織因子所啟動的凝血瀑布轉化為纖維蛋白所致。大量的纖維蛋白可能會對腫瘤 內血管造成一定程度的擠壓，從而減少腫瘤內的血流灌注而進一步減弱腫瘤的藥物遞送。
[0037] 本發明採用纖維蛋白調控藥物和腫瘤抑制劑結合，並控制纖維蛋白調控藥物的用 量，從而提高腫瘤抑制劑的遞送效果，通過增加具有正常功能的血管數目，來增加藥物遞 送，從而達到良好的抗腫瘤效果。
[0038]以下為實施例：
[0039] 實施例1
[0040] 荷A549肺癌模型小鼠經過rtPA連續兩周（劑量為25mg/kg/d)腹腔注射後，製備冰 凍切片。免疫螢光染色結果顯示，生理鹽水組纖維蛋白呈條索狀分布在血管周圍，而在遠離 血管處分布很少（圖IA，B)。而rtPA處理後，腫瘤內纖維蛋白斷裂呈散在分布（圖IC，D)，說明 rtPA可以有效降解腫瘤內纖維蛋白。進一步通過Elisa定量分析發現纖維蛋白的特異性降 解產物D-二聚體在rtPA處理組約為對照組的2.3倍，再次證明rtPA對腫瘤內纖維蛋白的有 效破壞。
[0041 ] 實施例2
[0042] rtPA給藥結束後尾靜脈給予DyLight? 488標記的凝集素（DyLight? 488-lectin)，劑量為5mg/kg，lh後二氧化碳室息處死動物後迅速用PBS及4%多聚甲醛溶液灌 流，並製備冰凍切片。⑶31免疫螢光染色後，共聚焦顯微鏡分析功能化血管（DyLight? 488 +⑶31 + )佔所有血管(⑶31 + )的比例，結果顯示，rtPA處理後，腫瘤內部功能化的血管明顯增 多，從生理鹽水組的38.3 ± 3.9 %增加到了 75.5 ± 7.0 %，大大提升了腫瘤內的血流灌注（圖 2)。我們推測主要是因為rtPA破壞了腫瘤血管附近的纖維蛋白，解除了纖維蛋白對腫瘤血 管的擠壓，使得部分原先受擠壓的血管在擠壓解除後重新獲得灌流，成為有功能的血管，為 納米藥物的有效遞送建立了條件。
[0043] 實施例3
[0044] 納米粒採用單次乳化法製備。24mg的聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)，用ImL二氯甲 烷溶解後加入到5mL 0.6%的膽酸鈉溶液中，之後冰水浴5s/5s脈衝超聲15次，功率為200W。 旋轉蒸發除去二氯甲烷後濃縮至合適濃度即得未修飾納米粒(NP)。粒度/電位測定儀結果 顯示納米粒粒徑為115.5±0.7nm(圖3A)，電位為11.5±0.6mv，電鏡下納米粒子大小均一， 分散性好，表面光滑呈規則圓球形（圖3B)。
[0045] 實施例4
[0046] rtPA給藥結束後，用近紅外染料DiR標記納米粒，按10yg/kg劑量尾靜脈給藥後24h 採用小動物活體成像儀檢測納米粒在腫瘤部位的聚集程度，結果提示rtPA處理更有利於納 米粒在腫瘤內聚（圖4A左邊:rtPA，右邊:生理鹽水組），離體組織成像及半定量結果證實， rtPA處理組的腫瘤組織內平均螢光強度是生理鹽水組腫瘤組織的2.0倍左右（圖4B和C)，而 實驗組與對照組相比，正常器官中的平均螢光值沒有顯著性差異（圖4D和E)。說明rtPA的處 理可以有效增加納米粒在腫瘤組織內的分布，但是對正常器官內的納米粒分布沒有影響。
[0047] 實施例5
[0048] rtPA給藥結束後，用綠色螢光探針香豆素-6標記納米粒，按0.05mg/kg劑量尾靜脈 給藥後4h，灌流並製備冰凍切片。共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，rtPA處理組納米粒子可以廣 泛地分布在腫瘤內部，併到達距離血管較遠處的腫瘤部位（圖5，C，D)。而生理鹽水中，納米 粒子主要部分在血管附近，且螢光較rtPA組更弱（圖5，A，B)。我們推測是由於rtPA的作用破 壞了血管附近的纖維蛋白，解除了血管擠壓並減弱了可能存在的納米藥物穿透阻力，可以 將納米藥物有效遞送到腫瘤組織並較為均一地分布到整個腫瘤組織中。
[0049] 實施例6
[0050]待腫瘤直徑達到4-5mm時，將24隻荷瘤裸鼠模型平均分成四組，每組6隻。a，對照組 (兩周生理鹽水腹腔注射，從第二周開始尾靜脈給予生理鹽水）；b，rtPA組(兩周rtPA腹腔注 射，從第二周開始尾靜脈給予生理鹽水）；c，NP-PTX組(兩周生理鹽水腹腔注射，從第二周開 始尾靜脈給予NP-PTX);d，rtPA+NP-PTX組(兩周rtPA腹腔注射，從第二周開始尾靜脈給予 NP-PTX)。尾靜脈給藥開始計為第0天，PTX給藥劑量為8mg/kg，每兩天給藥一次，實驗期間每 兩天記錄一次腫瘤的大小和荷瘤小鼠的體重。給藥結束後繼續監測4天後二氧化碳室息法 處死動物，取腫瘤組織，稱重並製備冰凍切片，參照TUNEL試劑盒的說明書進行凋亡染色，採 用lμg/ml的Hochest33342室溫染色5min，PBS洗三次後置於螢光顯微鏡下觀察不同處理組 腫瘤組織內腫瘤細胞凋亡的狀況。根據記錄的裸鼠的重量繪製小鼠體重變化曲線，計算腫 瘤生長抑制率。腫瘤體積變化曲線顯示，生理鹽水組腫瘤持續增長，僅給予rtPA組的腫瘤增 長情況與生理鹽水組類似。而僅給予NP-PTX組可以一定程度抑制腫瘤的生長。在給予rtPA 的基礎上，NP-PTX可以較單給藥NP-PTX組更為顯著地抑制腫瘤的生長（圖6A，C，D) JP-PTX 及rtPA+NP-PTX組對腫瘤生長的腫瘤重量抑制率分別為:35.7 %和73.7 %，對腫瘤體積抑制 率分別為42.8%和71.7%。整個實驗期間，各組荷瘤小鼠的體重無明顯差異（圖6B)，說明 PTX劑量在小鼠可承受範圍內，未引起明顯毒副作用。TUNEL染色結果顯示生理鹽水組與 rtPA組僅有散在的單個細胞凋亡，而NP-PTX組可以引起略多的腫瘤細胞凋亡，rtPA+NP-PTX 組則可以引起腫瘤組織內廣泛的細胞凋亡（圖6E)(從左至右依次為對照組，rtPA組，NP-PTX 組和rtPA+NP-PTX組），該結果與反應腫瘤生長情況的腫瘤體積變化曲線相一致。
[0051]本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以 限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含 在本發明的保護範圍之內。
【主權項】
1. 一種抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，包括兩周給藥劑量的纖維蛋白調控藥物和腫 瘤抑制劑。2. 如權利要求1所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述纖維蛋白調控藥物為溶栓 藥物和/或抗凝藥物。3. 如權利要求2所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述溶栓藥物為鏈激酶、尿激 酶、組織型纖溶酶原激活劑、重組組織型纖溶酶原激活劑、單鏈尿激酶型纖維蛋白溶酶厥徽 活劑、或乙醯化纖溶酶厥-鏈激酶激活劑複合物。4. 如權利要求2所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述抗凝藥物為注射用抗凝藥 物、口服抗凝藥物或凝血酶抑制劑;所述注射用抗凝藥物優選肝素、小分子肝素;所述口服 抗凝藥物優選華法林、雙香豆素，硝酸香豆素;所述凝血酶抑制劑優選水蛭素或阿加曲班。5. 如權利要求1所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述腫瘤抑制劑為游離腫瘤抑 製劑和/或腫瘤抑制劑納米製劑。6. 如權利要求5所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述腫瘤抑制劑為紫杉醇、阿 黴素、多柔比星或基因藥物。7. 如權利要求5所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述納米製劑為聚乙二醇-高 分子材料納米乳。8. 如權利要求7所述的抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，所述高分子材料為聚乳酸、聚 乳酸-聚羥基乙酸、聚己內酯或二硬脂醯磷脂醯乙醇胺。
【專利摘要】本發明公開了一種抗腫瘤藥物組合物，包括兩周給藥劑量的纖維蛋白調控藥物和腫瘤抑制劑。本發明採用纖維蛋白調控藥物和腫瘤抑制劑結合，並控制纖維蛋白調控藥物的用量，從而提高腫瘤抑制劑的遞送效果，在維持血管正常功能的前提下，儘可能的靶向給藥，從而達到良好的抗腫瘤效果。
【IPC分類】A61K45/06, A61K38/49, A61P35/00, A61K31/337, A61K9/14, A61K9/10
【公開號】CN105709227
【申請號】CN201610079038
【發明人】胡豫, 張波, 姜婷, 梅恆, 石威, 唐亮, 鄧君
【申請人】華中科技大學