通過間期細胞核的探針螢光原位雜交檢測染色體間不平衡的方法及系統的製作方法
2023-12-10 07:41:37 2
專利名稱：通過間期細胞核的探針螢光原位雜交檢測染色體間不平衡的方法及系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過間期細胞核的螢光探針原位雜交(FISH)(hybridation in situ de sondes fluorescents)，檢測染色體間不平衡的方法。它還涉及實施所述方法的一系統。
背景技術：
新生嬰兒身上最常見的組成染色體不平衡涉及染色體21、18、13及性染色體。三體性染色體21(唐氏先天愚徵)即為最常見的一種異常嬰兒患病率約為千分之1.7(Stoll et al，1998)。
三體性染色體21發病數隨母親年齡增大而增加，尤其母親年齡超過35歲時，所以若高齡生育，建議作產前檢查。現在的趨勢是晚育35歲以上才生小孩的母親的百分比在四年間，從8％增至19％(Stoll et al，1994)。顯然，這個比例還會繼續增加，但從現在開始，法國每年新生嬰兒數為750 000個，需作三體性染色體21檢查的可能約為每年150 000例。
自70年代以來，羊膜腔穿刺術後的產前檢查採用的是傳統的細胞遺傳學，所述細胞遺傳學可確定中期染色體的染色體組型，並可檢測染色體異常數。這種技術的主要缺點在於取樣與得出診斷結果之間的等待期相對較長(2周)。另外，可利用中期不能百分百保證(失敗率為1％)，由於母細胞的存在，可能會出現假陰性(Vermaet al，1998)。
最近，螢光探針的原位雜交(FISH)可直接應用在間期細胞核上，無需細胞培養。所述技術在於藉助螢光探針，標註出染色體(如可參見US 5 756 696)或染色體區，並計算信號，即放射出螢光信號的染色體(Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996；Wei et al，1997；Eiben et al，1999)。因此，可在較短時間內得出結果(幾天)，分析也只需取樣少量細胞(幾百個)，而細胞培養則必需更多細胞(至少好幾萬)。
不同類型的探針可用於這些研究覆蓋染色體21中心區或長臂區的探針(cosmide，YAC)(Soloviev et al，1995，Van Opstad et al，1995；Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996)。通過用這些探針對染色體21所作的部分標註，可估計複製數。因此，必須人工或自動計算信號，以檢測出對應染色體21的有三個信號的細胞。
不少研究證明了胎兒細胞(cellules fétales)原位雜交技術的可靠性。但很少研究可獲得FISH技術與傳統細胞遺傳診斷法之間直接比較的結果(Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996；Wei et al，1997；Eiben et al，1999；Thein et al，2000)。這些研究的工作人員證明了這兩種方法之間的一致性高達97--100％，但也強調詮釋間期FISH結果的困難性。這些困難通常與必需一名人工操作員有關，所述操作員需識別並計算螢光信號。但不同操作員之間存在一定程度的變化，尤其地，信號異常數的細胞核數目的統計含義，會在診斷時造成一些問題。觀察者之間的差異不僅因為採用了不同的對「點」(即螢光信號)的定義標準，例如，其大小、強度、結構，還因為點通常在沿核內垂直軸Z的不同焦點平面裡。
因此，根據這些標準得到的結果也大為不同，所述標準本身又取決於各實驗室中的樣本準備。極大的偏差是由「定點(cut-off)」的確定造成的，即一「正性臨界」值，根據所述值，樣本可被視為異常(Ruangvutilert et al，2000)。所述值很難確定，因為在對照情況中，存在三個信號的細胞核的百分比在被分析核的10至20％之間。所述數目視研究而不同，因為被分析細胞數本身又在50到200之間變化，這可解釋所述統計結果的極大差異性。另外，要對所述檢測進行醫學解釋，重要的是要可靠地識別有染色體數目異常的細胞核(嵌合mosaique))的比例的值。
本發明的目的在於提出一種自動化檢測方法，甚至從其概念就可看出，所述方法因此可消除由於人工操作員讀取產生的困難，可解決由於樣本準備的差異而造成的問題，到目前為止，這仍影響著分析的結果。
所述目的依靠一檢測方法得以實現，所述方法即使用一信息化系統，通過對間期細胞核作探針螢光原位雜交，以檢測染色體間的不平衡，所述檢測方法包括以下階段——對兩不同染色體作探針螢光原位雜交，——用不同螢光染料顯現各探針，——測量所有細胞核的分別對應於所顯現各探針的信號強度，所述測量，一方面在對照細胞群體內、另一方面在被檢測細胞群體內實施，——計算分別對應所述探針的所述信號之間的比，所述比率計算，一方面需計算所述對照細胞群體的比以提供一參考比，另一方面，需計算所述被檢測細胞群體的比，——比較對應於被檢測細胞群體的信號之間的比與參考比，——處理所述比較結果，以檢測染色體間的不平衡。
本發明在於通過原位雜交提供一種技術，所述技術可利用與所研究的細胞對應的一特殊序列的探針，辨識出AND(或ARN)序列。所述技術基於核苷酸的補充性上(A/T，A/U，G/C)，它可在染色體、細胞或組織培養的精確的物理化學條件下實施。原位雜交方法的結果即在探針與目標之間形成雜交。原位雜交包括一變性階段，這個所謂探針與目標的原位雜交階段，及一檢測雜交或探針階段，在螢光原位雜交範圍內，探針以螢光團標記著，螢光標記顯現出雜交。所述技術的最新發展可使甚至在準備的同時看到分別由不同螢光團顯現的多個探針。
有利地是，測量分別對應於各探針的兩個或多個信號可通過圖象細胞計數法來實施。例如，兩探針可分別用一綠色螢光染料和一紅色螢光染料顯現。
因此，發展出一種圖象細胞計數方法，所述方法既有通過FISH法分析間期細胞核的優點，又具備快速、準確、可量化及客觀的讀取信號的優點，因為它不受觀察者的影響。
所述方法在於使用染色體的染色體染色或染色體區，所述染色體一方面具有不平衡的染色體，另一方面還有另一染色體(常染色體或性染色體)，選擇該後一染色體是為了使利用染色體染色所獲得的雜交信號與由不平衡的染色體染色所獲得的信號進行比較。實際上，參考染色體和不平衡染色體在可能的測量範圍內大小相近。因此，例如，所述方法在於，一方面使用染色體21、另一方面使用染色體20或22的染色圖象或染色區；染色體20或22可當作參考染色體，因為用染色體21的圖象所獲得的雜交信號可與用大小相近的染色體20或22的圖象所獲得的信號相比較。至於染色體13的非整倍性(例如三體性染色體13)，參考染色體最好選擇染色體14或15。至於染色體18的非整倍性(例如三體性染色體18)，參考染色體最好選擇染色體17、19或20。至於染色體X的非整倍性，例如，參考染色體最好選擇染色體6、7、8、9、10、11和12。至於染色體Y的非整倍性，參考染色體最好選擇染色體19、20、21和22。
根據一最佳實施方式，原位雜交中所實施的探針為染色體染色探針。所謂「染色體染色探針」或「染色體染色」即指一探針，所述探針的成分在雜交條件下，適於和一目標雜交，所述目標包括一有多染色體組的預定染色體。若在與探針的所述成分發生雜交的樣本中僅有一個所述染色體片段存在，則這一片段發生雜交並被識別出來。事實上，染色探針可與第二、第三等......混合，以便同時對預定的第二、第三......染色體作出標記和進行檢測。目前，市場上有各種不同的染色探針(GIBCO-BRL；ONCOR BOEHRINGER-MANHEIM；......)。它們的製作或通過IRS-PCR放大法(如可參見WO 00 22164)，或通過使用染色體的已退化起爆劑PCR的DOT-PCR法，或通過染色體分類隔離出的染色體片段，或使用流體血細胞計數法或染色體微解剖法。另外，本發明中所實施的探針為這類探針，所述探針覆蓋中心區(衛星ANDα)，一染色體臂(例如聚合序列TTAGGn)的全部或部分，或一個或多個染色體的特殊重複AND序列的特殊性(典型衛星AND 1、2及3)。
根據一最佳實施方式，染色體染色探針由一非同位素實體如發光劑、著色劑或其它來標記。所述標記可間接實施用酶、生物素、抗生物素蛋白、steptavidine、digoxygénine、半抗原或其它可用發光劑或著色劑來顯現的物質。根據激勵能量源的發光劑可歸為幾類發光無線電波、化學發光、生物發光、光激發光(包括螢光和磷光)。「螢光」一詞通常指當所述物質被一能量源如紫外線激勵時，一種可發光物質(如螢光團)的特性。最好用螢光來標記探針。
在本發明中，發明者提出對動物或人體間期細胞——最好在來自羊水或母體血液的胎兒細胞內——進行染色體間不平衡的檢測。例如，先天或後天(如癌症)染色體不平衡檢測還可在循環血液細胞、皮膚細胞、口腔細胞中進行，更廣泛地說，可在方便可用的任何細胞類型中進行，以實施診斷檢查。
在本發明中，發明者提出檢測染色體間的不平衡，而不是檢測被分析染色體的複製數目——染色體21、22(例如)的探針原位雜交後，各探針可用不同螢光團顯現(綠和紅)；——利用圖象血細胞計數，在系統識別後，可在對照細胞群體及待檢測細胞群體內，測量最少上百個細胞核(例如500)的各探針的強度；——計算各探針的兩強度信號之間的比，將其與正常的基準值相比較，這樣可確定至少有一個多餘數字的染色體存在(例如染色體21)。這樣，染色體間的不平衡則大於1，若為三體性染色體，則等於1.5。計算各探針的兩強度信號之間的比，還可通過與正常基準值相比，確定是否存在單染色體。若有，則染色體間的不平衡為0.5。
根據本發明的檢測方法與現行的檢測方法相比，其優點在於——由於採用FISH技術，根據本發明的檢測方法可避免與細胞培養相關的所有缺陷，得出結果也更快(幾天)，且可採用的細胞，統計學上數量相當大，甚至對貧細胞樣本也沒有限制(細胞數約在500與約上千之間)。
——採用所述方法，不再存在所有與人工操作員讀取和解釋相關的困難，因為是由信息化系統自動進行分析。尤其地，間期細胞核的識別——在所述核中，與各探針雜交相關的所有螢光性強度測量——使得分析比採用目前所用的螢光信號的識別及計數(計算點或《spot counting》Tkachuk et al，1991)的方法簡單可靠得多。
另外，即使使用小尺寸的探針，也可給出用於計數的更高解析度的信號，所述信號因而更容易與背景噪音雜交在一起，因此信號與噪音之比很小，尤其因為羊水中包含有蛋白質膜，所述膜是主要的背景噪音源。發明者使用染色體染色的方法，由於所獲得信號的尺寸，可確保信號與噪音之比大於用小尺寸信號計數法的信噪比。
由於羊水採樣的特徵，背景噪音的估測及消減可在困難條件下檢測出三體性染色體細胞。
另外，與樣本準備相關的差異問題不會再影響到分析。實驗條件的可能變化不會改變螢光性之比，因為兩信號會同樣受到影響。利用最佳的統計準確度，能更可靠地檢測細胞群體內兩個群體的存在，因為能快速分析更多數量的細胞核。這樣可識別感染了母細胞的病例或嵌合病例(即只有部分胎兒細胞出現異常)。
最後，無論所改變的染色體性質如何，都可更可靠地檢測特殊病例，包括細胞等臂染色體(des iso chromosomes)21或易位t(21；21)(Stoll et al，1998)。用染色體染色顯現出一斑點，所述斑點的大小及強度都應增加一倍；考慮到信號的大小，用適合的攝像頭進行測量仍然更準確。所述方法不僅可應用在涉及染色體13、18、性染色體的其它病理學中，還可應用在其它病理學中，其中出現染色體數目不平衡(單染色體、三體性染色體、四體性......、多體性)。需注意，螢光探針的原位雜交FISH技術已在已公布專利申請FR2783253中描述的一種不同方法中實施過，所述專利申請是關於更準確地檢測間期細胞核內的染色體內的不平衡，以檢測整個或部分染色體臂的遺傳物質的遺失或增加(刪除、插入、擴大、複製......)。在所述檢測方法中，染色體的長臂及短臂的兩各不同的特殊螢光團標註的兩探針，在所述同一染色體上發生雜交。
在根據本發明的方法的一特別優化實施例中，測量階段包括一獲取步驟，即在一確定的測量平面內，獲得一定數量的區域，以便對於確定圖象的放大獲取至少預定數目的可分析細胞核(成百上千)。
另外，獲取階段還包括利用一窄通頻帶的連續光學過濾，捕獲對於各觀察區分別對應於與眾多螢光染料波長相對應的眾多平面的數個圖象(例如，藍色螢光的4.6-Diamidino-2-phénylindole(DAPI)，綠色螢光的螢光素isothiocyanate(FITC)，紅色螢光的Texas RedTM)，存儲所述獲得的圖象，並把所述獲得及存儲的圖象重疊在一起。
根據本發明的另一特徵，它提出一種系統，以通過間期細胞核的螢光探針原位雜交，檢測染色體內的不平衡，所述系統可用於實施根據本發明的方法，它包括——用於對兩不同染色體實施螢光探針原位雜交的裝置，——用不同螢光染料顯現各探針的裝置，——測量分別對應於如此顯現的各探針的強度信號的一裝置，所述測量一方面在對照細胞群體中、另一方面在所述待檢測細胞群體內的一組細胞核進行，——計算分別對應於所述探針的所述信號之間的比的裝置，一方面需計算關於所述對照細胞群體的以提供一基準比，另一方面需計算關於所述被檢測細胞群體的，——比較對應於被檢測細胞群體的信號之間的比與基準比的裝置，及——處理所述比較結果以檢測染色體間不平衡的裝置。
有利地是，圖象血細胞計數裝置包括——應用於細胞群體的多螢光顯微鏡裝置，所述細胞群體預先進行了不同的螢光探針原位雜交，
——用於獲取由螢光顯微鏡裝置產生的所有圖象的裝置，——用於存儲所述所獲圖象的裝置，及——分析所述所獲取並存儲的圖象的裝置。
螢光顯微鏡裝置及圖象獲取裝置協作，以在一定測量平面內，獲得一定數量的區域，以對於放大某一圖象可獲得至少預定數量的可分析細胞核。
在根據本發明的一檢測系統的最佳實施例中，所述檢測系統還包括一過濾裝置，所述過濾裝置與螢光顯微鏡裝置及獲取裝置協作，可獲得多個圖象，所述圖象分別對應各區域裡眾多平面，所述平面又和眾多螢光染料的波長相對應(例DAPI，FITC(綠色)，Texas Red(紅色))。
此外，有利地是，螢光顯微鏡裝置及獲取裝置可協作，以在同一研究平面內，獲得對應於對照細胞群體的圖象及對應被檢測細胞群體的圖象。
本發明的其它特徵和優點可在後文中參照附圖，以非限制性方式詳細描述一實施例中體現出來，附圖中——圖1示出了根據本發明的檢測染色體不平衡的方法的主要步驟；——圖2簡略示出了根據本發明的一檢測系統的結構；及——圖3中的代表性方框圖示出了對由根據本發明的檢測系統所獲得的圖象實施的檢測及量化操作。
具體實施例方式
尤其如圖1所示，在實施根據本發明的檢測方法的一實施例中，首先描述檢測及量化階段之前的初始準備及雜交階段。
樣本準備先準備好目前來自羊水的待檢測樣本，如可在平板上作傳統細胞遺傳分析，即指培養或直接分析採樣。但為提高對平板的自動分析，推薦使用井式離心機——所述離心機可使平板精確展開(如細胞旋轉(cytospinTM))，以平坦地展開細胞。這可減少自動讀取過程中在「焦點」外的細胞數量。有限的展開還可縮短圖象獲取時間。
培養的羊水樣本按傳統產前診斷程式處理。要直接分析羊水，可在作完胃蛋白酶處理後，再用分解細胞團的介質處理。
展開還可利用一井式離心機實施。對照平板可根據相同程式，用正常羊水或正常纖維原細胞準備。另外，還可分析血液樣本。若採樣來自母體外圍血液時，可預先作胎兒細胞檢測。
探針準備染色體染色的原位雜交可按通常程式實施(Truong et al，1998)。先把平板在2SSC鹽水溶液中浸泡15分鐘，然後用PBS緩衝液衝洗，再放在0.01N(4μg/ml，SIGMA)HCI中10分鐘，作胃蛋白酶處理。用PBS溶液中止溶解5分鐘，再把平板放在Carnoy(乙醇/乙酸3∶1(v/v))中浸泡10分鐘，最後拿出試條晾乾。
探針在10分鐘內，在70攝氏度時，在PH值為7的70％的甲醯胺(FLUKA)/2SSC溶液中變性。目標AND，即平板上的細胞核在3分鐘內，在相同條件下改變性質。再用2SSC溶液衝洗平板，用一系列酒精溶液脫水。探針雜交會在黑暗中37攝氏度時發生。雜交後的洗滌即放在72攝氏度的緩衝液2SSC中5分鐘。
若使用地高辛(digoxigénine)或生物素標註的探針，探針的檢測是通過使用與不同螢光染料(綠及紅)搭配的抗體來實施。
若使用直接用螢光染料標註的探針，平板放在DAPI(1μg/ml，分子探測器)中會立即染上顏色，若在p-phenyl-diamine(二元胺苯基)中則會顯現出匹配。
探針螢光信號的檢測及量化方法如圖2所示，在根據本發明的染色體間不平衡檢測系統中所實施的圖象細胞計數裝置1包括有一螢光顯微鏡2的獲取部分10、一黑白冷卻(refroidie noir et blanc)攝像機CCD5——所述攝像機可允許40微秒到10秒的集成時間、可自動改變由螢光試條4——所述螢光探針安放在燈與顯微鏡3之間，並可能在顯微鏡3、攝像機CCD5及X、Y型機動樣本平板擱板13之間，所述平板擱板由裝置1自動控制以便系統採樣——激勵並發射的光線光譜的一裝置(機動過濾器支承輪或機動過濾器支承架)、及一處理和控制部分14，所述部分由一計算機構成，所述計算機尤其包括一圖象獲取卡。
螢光性測量分為兩步1)在所研究平板上確定一分析區域後，獲取並存儲圖象。
2)分析圖象，並利用分析圖象得出的數據。
第一步驟在於，在一確定表面內，獲得多個給定數量的區域，利用40x放大物鏡，以得到500到1000個可分析的細胞核。利用選擇性幹擾光學過濾器，用CCD攝像機獲取到圖象。把各區域中對應不同螢光染料(藍、綠及紅)波長的三個圖象平面存儲併疊放在一起(如圖2所示)。確定基準點，以避免被觀察區域處在焦點之外。因而可在相同條件下(尤其是相同的集成時間、相同的攝像機拍攝內容)，分析被檢測的平板11及對照平板12。
包括細胞核檢測及信號量化的第二步驟中，如圖3所示，需進行以下各階段1)分割各圖象，檢測待分析的細胞核，所述階段包括分離開細胞核團，並根據尺寸及形態標準排除假象(artifact)，這可在負染色平面內設立起一層細胞核護罩(masque)，例如在DAPI中，在其中測量螢光性強度。
2)量化各細胞核內的各螢光染料(紅及綠)的強度，所述強度對應由各探針所發射的螢光，完全不必假設信號的形狀及位置。
3)量化各區域內在細胞核外各顏色的背景級；確定最常見的噪聲級為參考值。
4)減去各探針核內的背景級(參考值)。
5)計算各核根據基準值校正過的綠/紅強度之比。
6)用圖形表示數據，例如柱形圖或「散點圖」(兩色彩強度值的二維式圖形)。
7)自動確定通過簇分析——即分析雪點，確定這些雪點的重力中心——而選擇的一細胞核群體的螢光性之比的均方根偏差及平均值。
在相同條件下，用相同方式計算各樣本的螢光性之比。因此，若標準化的病人樣本的螢光性與對照樣本的螢光性之比為1.5，則可檢測出三體性染色體21。
當然，本發明並不局限於上面所描述的實施例，可參照所述實施例延伸出許多構型，但這並未超出本發明的範圍。因此，根據本發明的檢測方法可適用於其它染色體X、Y、13及18中，或其它不常見的反常病例中。
檢測系統的特徵在於——圖象細胞計數裝置還包括用於檢測細胞核及量化有眾多波長的螢光性信號的若干裝置；——裝配檢測及量化裝置是為了通過形狀、體積、螢光密度等多重標準——所述標準一般稱為形態、密度計量學標準——的分析，以分割細胞核，使得為測量平面的所有區域設立起一護罩。
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1.通過對間期細胞核作探針螢光原位雜交檢測染色體間的不平衡的方法，所述檢測方法包括以下階段——對兩個不同染色體作探針螢光原位雜交，——用不同螢光染料顯現各探針，——測量一組細胞核的分別對應於所顯現的每一探針的強度信號，所述測量一方面在對照細胞群體內進行，另一方面在被檢測的細胞群體內進行，——計算分別對應於所述探針的所述信號之間的比，所述計算一方面在所述對照細胞群體中進行以提供一參考比，另一方面在所述被檢測的細胞群體中進行，——比較對應於被檢測細胞群體的信號之間的比與參考比，——處理所述比較結果，用於檢測染色體間的不平衡。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，分別對應於各探針的兩個信號的測量由自動圖象細胞計數方法進行。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，兩探針分別用兩種不同的螢光染料來顯現(例如，一綠色螢光染料、一紅色螢光染料)。
4.根據上述任一權利要求所述的方法，其特徵在於，各探針的強度信號在可由操作員確定的數目的核，如約幾百個，上測量。
5.根據上述任一權利要求所述的方法，其特徵在於，測量階段包括第一獲取階段，在一確定的測量平面內獲得一定數量的區域，以便對於給定圖象放大率獲取至少預定數目的可分析細胞核。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，獲取階段還包括利用連續光學過濾，對於各區域捕獲分別與對應於多個螢光染料波長的多個平面相對應的多個圖象(例如，負染色區為藍色，探針標記為綠色、紅色)，存儲所述獲得的圖象，並將所述獲得及存儲的圖象重疊在一起。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，對照細胞群體和被檢測細胞群體的獲取階段在大致相同的獲取條件下實施。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，分別對應於對照細胞群體及被檢測細胞群體的獲取在同一測量平面內的兩個區域中實施。
9.根據權利要求5至8中任一項所述的方法，其特徵在於，測量階段還包括檢測細胞核及量化螢光強度信號的第二步驟。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，檢測及量化步驟包括對一個測量平面內各區域中的細胞核進行分割。
11.根據權利要求10所述的方法，其特徵在於，細胞核分割包括分離開細胞核團。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其特徵在於，細胞核分割包括根據尺寸及形態學標準排除假象。
13.根據權利要求9至12中任一項所述的方法，其特徵在於，檢測及量化步驟包括對於對應於各探針的各種顏色量化結合到各細胞核內的各螢光信號強度。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，檢測及量化步驟還包括對各顏色計算各區域內在細胞核外的背景級。
15.根據權利要求14所述的方法，其特徵在於，檢測及量化步驟還包括確定最常見的背景級作為噪聲參考值，並利用所述參考值校正各細胞核內的已量化的螢光信號強度。
16.通過對間期細胞核作螢光探針原位雜交檢測染色體間不平衡的系統，所述系統實施根據上述任一項權利要求所述的方法，該系統包括——用於對兩個不同染色體實施螢光探針原位雜交的裝置，——用不同螢光染料顯現各探針的裝置，——測量一組細胞核的分別對應於所顯現的每一探針的強度信號的裝置，所述測量一方面在對照細胞群體中、另一方面在被檢測細胞群體中進行，——計算分別對應於所述探針的所述信號之間比的裝置，所述計算一方面在所述對照細胞群體上進行以提供一參考比，另一方面在所述被檢測細胞群體上進行，——比較對應於被檢測細胞群體的信號之間的比與參考比的裝置，及——處理所述比較結果以檢測染色體間不平衡的裝置，如嵌合的情況。
17.根據權利要求16所述的檢測系統，其特徵在於，它包括一圖象細胞計數裝置作為所述測量裝置。
18.根據權利要求17所述的檢測系統，其特徵在於，所述圖象細胞計數裝置包括——用於細胞群體的螢光顯微鏡裝置，所述細胞群體預先被進行了探針螢光原位雜交，——用於獲取由螢光顯微鏡裝置產生的圖象的裝置，——用於存儲所獲取的圖象的裝置，及——分析所述獲取的並存儲的圖象的裝置。
19.根據權利要求18所述的檢測系統，其特徵在於，所述螢光顯微鏡裝置及圖象獲取裝置協作，以在一確定的測量平面內，獲得一定數量的區域，以對於給定圖象放大率獲得至少預定數量的可分析細胞核。
20.根據權利要求19所述的檢測系統，其特徵在於，它還包括過濾裝置，所述過濾裝置與所述螢光顯微鏡裝置及獲取裝置協作，用於獲得多個圖象，對於各區域，所述圖象分別對應於多個平面，所述平面和多個螢光染料的波長相對應(例如負染色區為DAPI(藍色)，探針為FITC(綠色)，Texas RedTM(紅色))。
21.根據權利要求18至20中任一項所述的檢測系統，其特徵在於，螢光顯微鏡裝置及獲取裝置協作，用於在同一研究平面內獲得對應於對照細胞群體的圖象和對應於被檢測細胞群體的圖象。
22.根據權利要求17至21中任一項所述的檢測系統，其特徵在於，圖象細胞計數裝置還包括用於檢測細胞核及量化多個波長的螢光信號的多個裝置。
23.根據權利要求22所述的檢測系統，其特徵在於，所述檢測及量化裝置被配置為用於根據形態學測量和密度測量分析對細胞核進行分割，以便為測量平面內的一組區域建立起一護罩。
24.根據權利要求22或23所述的檢測系統，其特徵在於，所述檢測及量化裝置被配置為用於分割細胞核團。
25.根據權利要求22至24中任一項所述的檢測系統，其特徵在於，所述檢測及量化裝置被配置為用於根據尺寸及形態學標準排除假象。
26.根據權利要求22至25中任一項所述的檢測系統，其特徵在於，所述檢測及量化裝置被配置為用於對於各顏色量化結合到各細胞核內的螢光信號強度。
27.根據權利要求22至26中任一項所述的檢測系統，其特徵在於，所述檢測及量化裝置被配置為用於計算細胞核外各顏色的背景級。
28.根據權利要求22至27中任一項所述的檢測系統，其特徵在於，所述檢測及量化裝置被配置為用於確定最常見的背景級作為背景參考值，並從各核內的已量化的強度中減去上述參考值。
29.根據權利要求1至15中任一項所述的染色體間檢測方法在在母體血液中流動的胎兒細胞核上的應用。
全文摘要
本發明涉及通過間期細胞核的螢光探針原位雜交，檢測染色體間不平衡的系統，所述檢測包括以下階段對兩不同染色體作探針螢光探針原位雜交；由不同螢光染料顯現各探針；測量細胞核組的分別對應於所顯現探針的強度信號，一方面在對照細胞群體內測量，另一方面在被檢測細胞群體內測量；計算分別對應於所述探針的所述信號之間的比，一方面需計算所述對照細胞群體的比，以提供一參考比，另一方面需計算所述被檢測細胞群體的比；比較對應於被檢測細胞群體的信號之間的比與參考比；處理所述比較結果，以檢測染色體間的不平衡。
文檔編號G01N21/64GK1558955SQ02817247
公開日2004年12月29日 申請日期2002年7月3日 優先權日2001年7月3日
發明者弗朗索瓦絲·蘇薩利納, 巴納德·馬爾富瓦, 巴納德·迪特裡約, 瑪麗－諾埃勒·吉裡, 庫翁·特呂奧恩, 迪特裡約, 馬爾富瓦, 弗朗索瓦絲 蘇薩利納, 特呂奧恩, 蛋＠鍘ぜ 申請人:伊姆斯塔圖像和模型化策略，分析和實現, 國家科研中心, 居裡研究所, 原子能委員會, 伊姆斯塔圖像和模型化策略，分析和