含有核酸的脂質粒子及相關的方法

2023-12-10 07:58:12

專利名稱：含有核酸的脂質粒子及相關的方法
含有核酸的脂質粒子及相關的方法
技術領域：
本申請要求2009年11月4日提交的美國臨時申請No. 61/280,510的權益，將其通過引用整體併入本文。
背景技術：
脂質納米粒子(LNP)是接收了調控批准的最臨床進展的具有基於7個LNP的藥物的藥物遞送系統。這些批准的藥物含有小分子諸如抗癌藥物及相比"游離的"藥物呈現改善的功效和/或減少的毒性。LNP載體技術也已應用於遞送"遺傳"藥物諸如用於表達治療性蛋白或用於沉默貢獻於疾病進展的基因的小幹擾RNA(SiRNA)寡核苷酸(OGN)的質粒。siRNA OGN和其他遺傳藥物的有效體內遞送的作出方法是阻礙這些劑作為治療劑的革命性的潛力的主要問題。
遺傳藥物的包裹和遞送需要的LNP技術的新近發展及陽離子脂質的設計點亮了LNP系統解決體內遞送問題的潛力。LNP-siRNA系統已顯示在靜脈內(靜脈內)注射之後誘導動物模型，包括非-人靈長類動物中治療關聯的靶基因的沉默，且目前在幾個臨床試驗中評估下。已開發各種方法來配製含有遺傳藥物的LNP系統。這些方法包括在乙醇的存在下混合預形成的LNP與OGN或混合溶解於乙醇的脂質與含有OGN的水性介質和得到具有IOOnm或更小的直徑的LNP和65 95%的OGN包裹效率。這些方法均依賴於陽離子脂質的存在，以達到OGN和聚(乙二醇)(PEG)脂質的包裹，以抑制大結構的聚集和形成。產生的LNP系統的性質，包括尺寸和OGN包裹效率，敏感於各種製劑參數諸如離子強度，脂質和乙醇濃度，pH, OGN濃度及混合速度。一般而言，使用當前製劑過程難於控制參數諸如在混合時的相對脂質和OGN濃度，以及混合速度，導致在製備物之內及之間產生的LNP的特徵的變異性。微流體裝置提供以nl尺度控制性地和快速混合流體的能力，精確控制溫度，駐留時間和溶質濃度。控制的及快速微流體混合已之前應用於合成無機納米粒子和微粒，及可勝過納米粒子的大規模產生中的大規模系統。微流體2-相滴技術已應用於產生單分散聚合物微粒用於藥物遞送或用於產生用於細胞包裹的大囊泡，蛋白或其他生物分子。已展示水動力流聚焦，常見的微流體技術的使用以提供試劑的快速混合，以創建控制的尺寸的單分散脂質體。此技術也已證明相比本體產生方法，對於隨著小分子的更高包裹，獲得更小，更多單分散粒子的聚合物納米粒子的產生有用。儘管含有遺傳藥物的LNP系統的方法的開發的發展，存在對製備含有治療性物質的脂質納米粒子的裝置和方法，以及改善的含有治療性物質的脂質納米粒子的需求。本發明尋求實現此需求及提供進一步相關的優勢。發明概述一方面，本發明提供包含核酸的脂質粒子。在一實施方式中，脂質粒子包含(a) —種或更多陽離子脂質，(b) —種或更多第2脂質，及(C) 一種或更多核酸，其中脂質粒子包含基本上實體核心，如本文定義。在一實施方式中，陽離子脂質是DLin-KC2-DMA。在特定實施方式中，粒子包含約30 約95摩爾百分率陽離子脂質。在一實施方式中，第2脂質是PEG-c-DMA。在一實施方式中，第2脂質是I，2-二硬脂醯-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)。在特定實施方式中，粒子包含約I 約10摩爾百分率第2脂質。核酸可為DNA，RNA，鎖核酸，核酸類似物，或能表達DNA或RNA的質粒。在另一實施方式中，脂質粒子包含(a) —種或更多陽離子脂質，(b) 一種或更多中 性脂質，(C) 一種或更多PEG-脂質，(d) —種或更多甾醇；及(e) —種或更多核酸，其中脂質粒子包含基本上實體核心，如本文定義。在一實施方式中，陽離子脂質是DLin-KC2-DMA。在一實施方式中，PEG-脂質是PEG-c-DMA。在一實施方式中，中性脂質是1，2_ 二硬脂醯-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)。在一實施方式中，甾醇是膽甾醇。在一實施方式中，核酸是siRNA。在進一步實施方式中，脂質粒子由一種或更多陽離子脂質，及一種或更多核酸組成。在一實施方式中，脂質粒子包含基本上實體核心，如本文定義。在一實施方式中，陽離子脂質是DLin-KC2-DMA。在一實施方式中，核酸是siRNA。在其他方面，本發明提供使用脂質粒子的方法。在一實施方式中，本發明提供給受試者施用核酸的方法，包括施用本發明的脂質粒子給有需求的受試者。在一實施方式中，本發明提供將核酸導入細胞的方法，包括使細胞接觸本發明的脂質粒子。在一實施方式中，本發明提供調節靶多核苷酸或多肽的表達的方法，包括使細胞接觸本發明的脂質粒子，其中核酸能調節靶多核苷酸或多肽的表達。在一實施方式中,本發明提供治療受試者中表徵為多肽的過表達的疾病或病症的方法，包括給受試者施用本發明的脂質粒子，其中核酸能沉默或降低多肽表達。在其他方面，本發明提供製造脂質粒子的方法。在一實施方式中，本發明提供製造含有核酸的脂質粒子的方法，包括(a)將在第I溶劑中包含核酸的第I流導入微流體裝置；其中裝置具有適於將一個或更多流導流入裝置的第I區和用於用微流體混合器混合一個或更多流的內容物的第2區；(b)將在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2流導入裝置以提供在層流條件下流動的第I和第2流，其中裝置具有適於將一個或更多流導流入微通道的第I區和用於混合一個或更多流的內容物的第2區，其中脂質粒子-形成物質包含陽離子脂質，且其中第I和第2溶劑不相同；(c)使一個或更多第I流和一個或更多第2流從裝置的第I區流入裝置的第2區；以及(d)在裝置的第2區中混合在層流條件下流動的一個或更多第I流和一個或更多第2流的內容物以提供包含具有包裹的核酸的脂質納米粒子的第3流。在另一實施方式中，本發明提供製造含有核酸的脂質粒子的方法，包括
(a)將在第I溶劑中包含核酸的第I流導入通道；其中裝置具有適於將一個或更多流導流入通道的第I區和用於混合一個或更多流的內容物的第2區；(b)導入在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2流；其中通道具有適於將一個或更多流導流入通道的第I區和用於混合一個或更多流的內容物的第2區；(c)使一個或更多第I流和一個或更多第2流從通道的第I區流入通道的第2區，而維持2個流的物理隔離，其中一個或更多第I流和一個或更多第2流先不混合，直到到達通道的第2區後才混合；以及(d)在微通道的第2區中混合在層流條件下流動的一個或更多第I流和一個或更多第2流的內容物以提供包含具有包裹的核酸的脂質納米粒子的第3流。在以上方法的特定實施方式中，混合一個或更多第I流和一個或更多第2流的內容物包括改變一個或更多第I流和一個或更多第2流的濃度或相對混合速度。 在以上方法的特定實施方式中，方法還包含用水性緩衝劑稀釋第3流。在特定實施方式中，稀釋第3流包含使第3流和水性緩衝劑流入第2混合結構。在以上方法的特定實施方式中，方法還包含透析包含具有包裹的核酸的脂質粒子的水性緩衝劑以減少第2溶劑的量。在以上方法的特定實施方式中，第I溶劑是水性緩衝劑。在以上方法的特定實施方式中，第2溶劑是含水醇。在以上方法的特定實施方式中，所述混合第I和第2流的內容物包括雜亂平流。在以上方法的特定實施方式中，所述混合第I和第2流的內容物包括用微混合器混合。在以上方法的特定實施方式中，核酸包裹效率是約90 約100%。在以上方法的特定實施方式中，一個或更多第I流和一個或更多第2流的混合在第I區中被屏障阻止。在特定實施方式中，屏障是通道壁，鞘流體或同心管道。在本發明的另一方面，提供製造脂質粒子的裝置。在一實施方式中，本發明提供產生包裹核酸的脂質粒子的裝置，包括(a)第I入口，其用於接收在第I溶劑中包含核酸的第I溶液；(b)第I入口微通道，其與第I入口流通連接以提供在第I溶劑中包含核酸的第I流；(c)第2入口，其用於接收在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2溶液；(d)第2入口微通道，其與第2入口流通連接以提供在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2流；以及(e)第3微通道，其用於接收第I和第2流，其中第3微通道具有適於在層流條件下將第I和第2流導流入微通道的第I區和適於混合第I和第2流的內容物的第2區以提供包含具有包裹的核酸的脂質粒子的第3流。在一實施方式中，裝置還包含用於稀釋第3流的設施以提供稀釋的包含穩定化的具有包裹的核酸的脂質粒子的流。在特定實施方式中，用於稀釋第3流的設施包含微混合器。在一實施方式中，微通道具有約20 約300 ii m的水動力直徑。在一實施方式中，微通道的第2區包含淺浮雕結構。在一實施方式中，微通道的第2區具有主流方向和一個或更多表面，所述表面具有至少一個限定於其中的凹槽或突起，凹槽或突起具有與主方向成角的取向。在一實施方式中，第2區包含微混合器。在特定實施方式中，裝置還包含用於改變第I和第2流的流速的設施。在特定實施方式中，裝置還在第I區中包含對於物理隔離一個或更多第I流與一個或更多第2流有效的屏障。

本發明的上述方面和許多伴隨優勢會變得更容易被同意為與通過參考下列詳述，參照附圖更佳明白的相同的。圖I是本發明的代表流體裝置的示意圖。圖2是本發明的代表流體裝置的示意圖，其為圖I中例證的裝置的明細。 圖3是本發明的代表流體裝置的示意圖，其為圖2中例證的裝置的明細。圖4是本發明的代表流體裝置和方法的示意圖。圖5是本發明的代表陣列的示意圖，其包含圖4中例證的流體裝置中的10個。圖6是本發明的代表流體裝置的示意圖。圖7是本發明的代表陣列的示意圖，其包含圖6中例證的代表流體裝置中的10個。圖8是本發明的代表流體裝置的示意圖，其具有3個入口和單個出口(裝置800包括混合通道810)。圖9是本發明的代表流體裝置的示意圖，其具有2個入口和單個出口(裝置900包括混合通道910)。圖10是本發明的代表流體裝置的示意圖，其具有多重(n)系列個入口和單個出口(裝置 1000 包括混合通道 1010a, 1010b, IOlOc 和 IOlOd)。圖11是本發明的代表流體裝置的示意圖，其具有3個入口和單個出口(裝置1100包括混合通道1110a, IllOb和IllOc)。 圖12是本發明的代表流體裝置的示意圖，其具有7個入口和單個出口(裝置1200包括混合通道 1210a, 1210b, 1210c 和 1210d)。圖13是本發明的代表流體裝置的示意圖，其具有多層混合器(裝置1300包括混合通道1310)。圖14是圖14中例證的多層混合器的近觀視圖。圖15A是製造脂質納米粒子(LNP)的本發明的代表微流體(MF)方法的示意圖月旨質-乙醇和siRNA-水溶液泵入微流體混合裝置的入口 ；裝置的鯡骨狀特徵誘導層式流的雜亂平流及導致脂質物質與水流快速混合及形成脂質納米粒子。混合通道是200 u m寬和79 ii m高。鯡骨狀結構是31 ii m高和50 y m厚。圖15B是製造脂質納米粒子(LNP)的預形成的囊泡(PFV)方法的示意圖(a)將脂質-乙醇溶液加入水溶液，pH4. 0，導致囊泡類型粒子的形成；(b)通過SOnm聚碳酸酯膜(Nuclepore)於室溫使用Lipex擠出機的擠出提供更均一的粒子分布；及(C)添加siRNA溶液而渦旋及於35°C溫育30分鐘促進siRNA的包裹。圖16A 16C例證微流體裝置中的流速對混合及LNP粒徑的影響。2個10 ii M螢光素(在PH8. 8螢光，在pH5. 15非-螢光)溶液混合而產生完全螢光溶液。圖16A比較了通過沿著通道寬度的平均螢光強度測定的混合程度)作為從平均流體速度及行進長度(0. 2,0. 8，I. 4和2mL/min)計算的混合時間(msec)的函數。圖16B和16C比較由以40 11. 5 47. 5 I 的摩爾比，siRNA-總脂質比 0.06wt/wt 的 Dlin-KC2-DMA/DSPC/膽甾醇/PEG-c-DMA組成的LNP的平均粒徑，IOmM脂質-乙醇相與含有siRNA的25mM乙酸鹽緩衝劑，PH4混合。圖16B比較LNP的平均粒徑(nm)作為流速(mL/min)的函數。圖16C比較LNP的平均粒徑(nm)作為乙醇/水流速比的函數。誤差條代表通過動態光散射測量的平均粒徑的標準偏差。圖17通過比較平均粒徑(nm)作為乙醇中的脂質濃度(mM)的函數例證脂質濃度對LNP粒徑的影響。增加脂質濃度導致平均粒徑增加。在微流體晶片中混合的乙醇相中的總脂質含量變動為IOmM 50mM。LNP由以40 11. 5 47.5 I的摩爾比，siRNA-總脂質比0. 06wt/wt的Dlin-KC2-DMA/DSPC/膽留醇/PEG-c-DMA組成。微流體混合器之內的總流速維持在2ml/min。誤差條代表通過動態光散射測量的平均粒徑的標準偏差。圖18A和18B例證PEG-脂質和陽離子脂質對LNP系統的影響。圖18A比較平均粒 徑(nm)作為通過PFV和MF方法製備的LNP的PEG-c-DMA含量(LNP中的mol% )的函數。PEG-脂質在LNP組合物中變動為Imol % IOmol %。PEG-脂質含量的改變通過調節膽甾醇含量而補償。LNP由以40 11.5 47.5 I (_x) I (+x)的摩爾比，(其中X= I 9)，siRNA-總脂質比 0. 06wt/wt 的 Dlin_KC2_DMA/DSPC/ 膽甾醇 /PEG-c-DMA 組成。圖 18B比較平均粒徑(nm)作為通過PFV和MF方法製備的LNP的DLin_KC2_DMA含量(mol% )的函數。陽離子脂質變動為40mol% 70mol%。PEG-c-DMA保持恆定在Imol %和與DSPC-膽甾醇維持0. 25摩爾比。微流體混合器之內的總流速維持在2ml/min。IOmM脂質-乙醇相與含有siRNA的25mM乙酸鹽緩衝劑，pH4混合。誤差條代表通過動態光散射測量的平均粒徑的標準偏差。圖19通過比較平均粒徑(nm)及包裹(％ )作為siRNA/脂質比(wt/wt)(也表達為核苷酸/磷酸(N/P))的函數而例證siRNA/脂質比對粒徑和包裹的影響。通過使用陰離子交換旋柱從游離的siRNA分離LNP懸浮液測定包裹。LNP由以40 11.5 47.5 I的摩爾比，siRNA-總脂質比 0. 06wt/wt 的 Dlin_KC2_DMA/DSPC/ 膽甾醇 /PEG-c-DMA 組成。微流體混合器之內的總流速維持在2ml/min。IOmM脂質-乙醇相與含有siRNA的25mM乙酸鹽緩衝劑，PH4混合。誤差條代表通過動態光散射測量的平均粒徑的標準偏差。圖20A和20B例證通過微流體混合器使用冷凍-傳輸電子顯微鏡檢(TEM)製備的PEG-脂質和陽離子脂質LNP系統的形態。LNP通過Cryo-TEM以29K放大率成像。圖20A是由以 40 11.5 : 47.5 I 的摩爾比的 Dlin-KC2-DMA/DSPC/膽甾醇/PEG-c-DMA 組成的空LNP的像。圖20B是由以40 11.5 47. 5 I的摩爾比，siRNA-總脂質比0. 06wt/wt的Dlin-KC2-DMA/DSPC/膽甾醇/PEG-c-DMA組成的siRNA裝載的LNP的像。使用微流體混合器以20mM脂質在乙醇相中進行製劑。含有Imol% PEG-c-DOMG的裝載的LNP-siRNA和空粒子呈現同一形態，且結構非常均質。比例尺代表lOOnm。圖21通過比較相對FVII蛋白水平(％ )作為LNP中的DLin-KC2-DMA含量40mol% 60mol%變化的siRNA劑量(mg/kg)的函數例證因子VII小鼠模型中的LNP產生的微流體的體內沉默活性。含有Imol % PEG-c-DOMG和60mol% DLin_KC2_DMA的LNP製劑提供類似於之前報導的使用替代性的方法的FVII沉默。在40mol% 60mol%的範圍，含有DLin-KC2-DMA的LNP基因沉默漸進地改善。通過尾靜脈注射(η = 3每劑量水平)進行LNP-siRNA向小鼠的系統性注射。在注射後24小時之後進行血收集和因子VII水平通過比色測定來測定。LNP DSPC :膽甾醇比保持在O. 2wt/wt及含有Imol% PEG-c-DOMG。LNPsiRNA :脂質比是 O. 06wt/wt。圖22A 22C例證通過微流體學方法製備的脂質納米粒子的冷凍電子顯微鏡檢。通過微流體學製備的空脂質納米粒子(40% DLinKC2-DMA, 11. 5% DSPC，47. 5%膽甾醇，1%PEG-c-DMA)顯示指示實體核心結構的電子緻密內部(圖22A)。用POPC組成的樣品顯示與水性核心囊泡關聯的欠密內部(圖22B)。具有被POPC的單層圍繞的三油精疏水核心的含有POPC/三油精的系統顯示類似於樣品A的電子緻密內部(圖22C)。圖23例證用DLinKC2-DMA/PEG-脂質系統(90/10，mol/mol)使用微流體混合製備的限制尺寸LNP通過比較平均粒徑(nm)作為LNP的乙醇/水流速比的函數，LNP在siRNA存在(N/P = I)及siRNA不存在(無siRNA)下產生。製劑使用與25mM乙酸鹽緩衝劑，pH4 混合的IOmM脂質-乙醇相進行。粒徑通過動態光散射測定及報導數-加權的平均直徑。圖24A 24C例證使用微流體混合在50 % DLinKC2_DMA，45 %膽甾醇和5 %PEG-c-DMA中包裹的siRNA的31P NMR。忽略DSPC以避免從磷脂發生的衝突磷信號。完整LNP或添加150mM乙酸銨之後不可檢測來自siRNA的31P信號(圖24A)(圖24B)。僅可在添加1% SDS而溶解粒子之後檢測信號(圖24C)。圖25是例證RNA酶保護測定的結果的電泳凝膠。siRNA使用微流體方法(MF)或PFV方法包裹，或保持未包裹。將Triton X-100加入，以完全溶解及裂解脂質粒子。在20%天然聚丙烯醯胺凝膠上進行凝膠電泳，並將siRNA通過用CYBR-SAFE染色來可視化。圖26例證以百分率脂質混合作為時間(秒)的函數代表的脂質混合融合測定的結果。為了評定LNP的最外層中存在的暴露的陽離子脂質的量，製備3個LNP系統在siRNA缺失下(無siRNA)，以N/P = 4，及N/P= I。在pH5. 5進行脂質測定，以確保陽離子脂質的幾乎完全電離，及反應通過將LNP注射進含有高度陰離子D0PS/NBD-PE/Rh-PE(98 :1:1摩爾比)囊泡的比色杯來起始。圖27是通過根據本發明的方法微流體混合而形成的實體核心LNP siRNA系統的示意圖。圖28A和28B分別例證平均粒徑(nm)及ζ電勢(mV)，作為使用微流體混合器製備的連續脂質納米粒子組合物的函數。圖29是用於脂質納米粒子的連續組裝的本發明的代表裝置和方法的示意圖。圖30是本發明的代表裝置和方法的示意圖。圖31是本發明的代表裝置和方法的示意圖。圖32是本發明的代表裝置和方法的示意圖。圖33是本發明的代表裝置和方法的示意圖。發明詳述本發明提供含有治療劑的脂質粒子，製造含有治療劑的脂質粒子的方法和裝置，及使用脂質粒子遞送治療劑的方法。脂質粒子一方面，本發明提供含有治療劑的脂質粒子。脂質粒子包括一種或更多陽離子脂質，一種或更多第2脂質，及一種或更多核酸。陽離子脂質.脂質粒子包括陽離子脂質。如本文所用，術語"陽離子脂質"指稱陽離子或隨著PH降低到脂質的可離子化的基團的PK以下成為陽離子(質子化的)，但是在更高PH值漸進地更中性的脂質。在PK以下的pH值，則脂質能結合帶負電的核酸(例如，寡核苷酸)。如本文所用，術語"陽離子脂質"包括推定在PH減小後正電荷的兩性離子脂質。術語"陽離子脂質"指稱在選擇性pH，諸如生理學pH攜帶淨正電荷的許多脂質物質之任何。該脂質包括，但未限制於，N，N-二油基-N，N-二甲基銨氯化物(DODAC) ；N-(2,
3-二油醯氧基)丙基)_N，N，N-三甲基銨氯化物(DOTMA) ；N, N- 二硬脂基-N，N- 二甲基銨溴化物(DDAB) ;N-(2，3-二油醯氧基)丙基)-N，N，N-三甲基銨氯化物(DOTAP) ；3-(N-(N/，N/ -二甲基氨基乙烷)_氨基甲醯基)膽甾醇(DC-Chol)和N-(l，2-二肉豆蘧醯氧基丙-3-基)-N，N- 二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)。此外，陽離子脂質的許多商業製備物可在本發明中使用。這些包括，例如，LIP0FECTIN (可商購的陽離子脂質體包含DOTMA和1,2-二油醯-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE),自 GIBCO/BRL, Grand Island, NY);陽離子脂質體 (可商購的陽離子脂質體包含N-(l-(2，3-二油醯氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧醯氨基)乙基)-N，N-二甲基銨三氟乙酸鹽(DOSPA)和(DOPE)，自 GIBC0/BRL);及 TRANSFECTAM: (可商購的陽離子脂質包含乙醇中的二-十八烷基氨基甘氨醯羧基精胺(DOGS)自PromegaCorp.，Madison, WI)。下列脂質是陽離子且在生理學pH以下具有正電荷D0DAP，DODMA,DMDMA, I，2~ _■亞油基氧基_N，N- _■甲基氣基丙燒(DLinDMA) ,1,2- _■亞麻基氧基-N，N- _.甲基氨基丙烷(DLenDMA)。在一實施方式中，陽離子脂質是氨基脂質。在本發明中有用的適合的氨基脂質包括描述於WO 2009/096558的那些，其通過引用整體併入本文。代表氨基脂質包括1，2- _■亞油基氧基_3-( _■甲基氣基)乙酸氧基丙燒(DLin-DAC), 1, 2- _■亞油基氧基_3_嗎啉代丙烷(DLin-MA)，1，2-二亞油醯-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)，1，2-二亞油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)，1_亞油醯_2_亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP) ,1,2- _■亞油基氧基_3- 二甲基氣基丙燒氣化物鹽(DLin-TMA Cl), I,2- 二亞油醯-3-三甲基氨基丙烷氯化物鹽(DLin-TAP Cl),I,2- 二亞油基氧基_3_(N_甲基哌嗪並)丙烷(DLin-MPZ)，3- (N，N- 二亞油基氨基)-I，2-丙二醇(DLinAP)，3- (N，N-二油基氨基)_1，2-丙二醇(DOAP)，1，2-二亞油基氧代-3 (2N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2，2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)。適合的氨基脂質包括具有下式的那些
權利要求
1.脂質粒子，其包含 (a)一種或更多陽離子脂質； (b)一種或更多第2脂質；以及 (C) 一種或更多核酸， 其中脂質粒子包含實體核心。
2.權利要求I的粒子，其中陽離子脂質是氨基脂質。
3.權利要求I或2的粒子，其中陽離子脂質選自DODAC，DOTMA,DDAB, DOTAP,DOTAP Cl, DC-Chol，DOSPA, DOGS, DOPE, DODAP, DODMA, DODMA 和 DMRIE。
4.權利要求I 3之任一項的粒子，其中陽離子脂質具有下式
5.權利要求I 4之任一項的粒子，其中陽離子脂質是二亞油基氨基脂質。
6.權利要求I 5之任一項的粒子，其中陽離子脂質是DLin-KC2-DMA。
7.權利要求I 6之任一項的粒子，其包含約30 約95摩爾百分率陽離子脂質。
8.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質選自PEG-修飾的磷脂醯乙醇胺，PEG-修飾的磷脂酸，PEG-修飾的神經醯胺，PEG-修飾的二烷基胺，PEG-修飾的二醯基甘油，PEG-修飾的二烷基甘油。
9.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質選自PEG-c-D0MG，PEG-c-DMA和PEG-c-DMG。
10.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質是PEG-c-DMA。
11.權利要求I 10之任一項的粒子，其中第2脂質是中性脂質。
12.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質選自二醯基磷脂醯膽鹼，二醯基磷脂醯乙醇胺，神經醯胺，鞘磷脂，二氫鞘磷脂，腦磷脂和腦苷脂。
13.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質是選自下列的中性脂質二醯基磷脂醯膽鹼，二醯基磷脂醯乙醇胺，神經醯胺，鞘磷脂，二氫鞘磷脂，腦磷脂和腦苷脂。
14.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質是I，2-二硬脂醯-sn-甘油基_3_磷酸膽鹼(DSPC)。
15.權利要求I 7之任一項的粒子，其中第2脂質是甾醇。
16.權利要求I 15之任一項的粒子，其包含約I 約10摩爾百分率第2脂質。
17.權利要求I 16之任一項的粒子，其中核酸是DNA，RNA,鎖核酸，核酸類似物，或能表達DNA或RNA的質粒。
18.權利要求I 17之任一項的粒子，其中核酸是ssDNA或dsDNA。
19.權利要求I 17之任一項的粒子，其中核酸是siRNA或微RNA。
20.權利要求I 19之任一項的粒子，其中核酸是反義寡核苷酸。
21.脂質粒子，其包含 (a)一種或更多陽離子脂質； (b)中性脂質； (c)PEG-脂質； (d)甾醇；以及 (e)—種或更多核酸， 其中脂質粒子包含實體核心。
22.權利要求21的粒子，其中陽離子脂質是DLin-KC2-DMA。
23.權利要求21的粒子，其中PEG-脂質是PEG-c-DMA。
24.權利要求21的粒子，其中中性脂質是1，2-二硬脂醯-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
25.權利要求21的粒子，其中甾醇是膽甾醇。
26.權利要求21的粒子，其中核酸是siRNA。
27.脂質粒子，其由下列物質組成 (a)一種或更多陽離子脂質；以及 (b)一種或更多核酸， 其中脂質粒子包含實體核心。
28.權利要求21的粒子，其中陽離子脂質是DLin-KC2-DMA。
29.權利要求21的粒子，其中核酸是siRNA。
30.給受試者施用核酸的方法，包括給有需求的受試者施用權利要求I 29之任一項的脂質粒子。
31.將核酸導入細胞的方法，包括使細胞接觸權利要求I 29之任一項的脂質粒子。
32.調節靶多核苷酸或多肽的表達的方法，包括使細胞接觸權利要求I 29之任一項的脂質粒子，其中核酸能調節靶多核苷酸或多肽的表達。
33.治療受試者中表徵為多肽的過表達的疾病或病症的方法，包括給受試者施用權利要求I 29之任一項的脂質粒子，其中核酸能沉默或降低多肽表達。
34.製造含有核酸的脂質粒子的方法，包括 (a)將在第I溶劑中包含核酸的第I流導入微流體裝置；其中裝置具有適於將一個或更多流導流入裝置的第I區和用於用微流體混合器混合一個或更多流的內容物的第2區； (b)將在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2流導入裝置以提供在層流條件下流動的第I和第2流，其中裝置具有適於將一個或更多流導流入微通道的第I區和用於混合一個或更多流的內容物的第2區，其中脂質粒子-形成物質包含陽離子脂質，且其中第I和第2溶劑不相同；(C)使一個或更多第I流和一個或更多第2流從裝置的第I區流入裝置的第2區；以及 (d)在裝置的第2區中混合在層流條件下流動的一個或更多第I流和一個或更多第2流的內容物以提供包含具有包裹的核酸的脂質納米粒子的第3流。
35.製造含有核酸的脂質粒子的方法，包括 (a)將在第I溶劑中包含核酸的第I流導入通道；其中裝置具有適於將一個或更多流導流入通道的第I區和用於混合一個或更多流的內容物的第2區； (b)導入在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2流；其中通道具有適於將一個或更多流導流入通道的第I區和用於混合一個或更多流的內容物的第2區； (c)使一個或更多第I流和一個或更多第2流從通道的第I區流入通道的第2區，而維持2個流的物理隔離，其中一個或更多第I流和一個或更多第2流先不混合，直到到達通道的第2區後才混合；以及 (d)在微通道的第2區中混合在層流條件下流動的一個或更多第I流和一個或更多第2流的內容物以提供包含具有包裹的核酸的脂質納米粒子的第3流。
36.權利要求34或35的方法，其中所述混合一個或更多第I流和一個或更多第2流的內容物包括改變一個或更多第I流和一個或更多第2流的濃度或相對混合速度。
37.權利要求34 36之任一項的方法，其還包括用水性緩衝劑稀釋第3流。
38.權利要求37的方法，其中所述稀釋第3流包括使第3流和水性緩衝劑流入第2混合結構。
39.權利要求34 38之任一項的方法，其還包括透析包含具有包裹的核酸的脂質粒子的水性緩衝劑以減少第2溶劑的量。
40.權利要求34 39之任一項的方法，其中第I溶劑是水性緩衝劑。
41.權利要求34 40之任一項的方法，其中第2溶劑是含水醇。
42.權利要求34 42之任一項的方法，其中核酸是DNA，RNA,鎖核酸，核酸類似物，或能表達DNA或RNA的質粒。
43.權利要求34 42之任一項的方法，其中氨基脂質具有下式
44.權利要求34 43之任一項的方法，其中第2流還包含第2脂質。
45.權利要求34 44之任一項的方法，其中所述混合第I和第2流的內容物包括雜亂平流。
46.權利要求34 45之任一項的方法，其中所述混合第I和第2流的內容物包括用微混合器混合。
47.權利要求34 46之任一項的方法，其中核酸包裹效率是約90 約100%。
48.權利要求35的方法，其中一個或更多第I流和一個或更多第2流的混合在第I區中被屏障阻止。
49.權利要求48的方法，其中屏障是通道壁，鞘流體或同心管道。
50.脂質粒子，其通過權利要求34 49之任一項的方法製造。
51.產生包裹核酸的脂質粒子的裝置，包括 (a)第I入口，其用於接收在第I溶劑中包含核酸的第I溶液； (b)第I入口微通道，其與第I入口流通連接以提供在第I溶劑中包含核酸的第I流； (c)第2入口，其用於接收在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2溶液； (d)第2入口微通道，其與第2入口流通連接以提供在第2溶劑中包含脂質粒子-形成物質的第2流；以及 (e)第3微通道，其用於接收第I和第2流，其中第3微通道具有適於在層流條件下將第I和第2流導流入微通道的第I區和適於混合第I和第2流的內容物的第2區以提供包含具有包裹的核酸的脂質粒子的第3流。
52.權利要求51的裝置，其還包含用於稀釋第3流的設施以提供稀釋的包含穩定化的具有包裹的核酸的脂質粒子的流。
53.權利要求51或52的裝置，其中微通道具有約20 約300u m的水動力直徑。
54.權利要求51 53之任一項的裝置，其中微通道的第2區包含淺浮雕結構。
55.權利要求51 54之任一項的裝置，其中微通道的第2區具有主流方向和一個或更多表面，所述表面具有至少一個限定於其中的凹槽或突起，凹槽或突起具有與主方向成角的取向。
56.權利要求51 55之任一項的裝置，其中第2區包含微混合器。
57.權利要求51 56之任一項的裝置，其還包含用於改變第I和第2流的流速的設施。
58.權利要求52 57之任一項的裝置，其中用於稀釋第3流的設施包含微混合器。
59.權利要求52 58之任一項的裝置，其還在第I區中包含對於物理隔離一個或更多第I流與一個或更多第2流有效的屏障。
全文摘要
本發明提供使用微流體混合裝置製備包含陽離子脂質DLinKC2-DMA的核酸-脂質納米粒子的方法，其中得到核酸-脂質納米粒子相比在常規進行的囊泡方法中產生的相同的製劑的核酸-脂質納米粒子呈現更小粒徑和更大核心密度。
文檔編號C12N15/88GK102712935SQ201080059999
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月4日 優先權日2009年11月4日
發明者A·勒恩格, A·維爾德, C·L·G·漢森, D·沃克, I·哈弗茲, J·泰勒, J·胡弗特, N·M·貝利維奧, P·R·庫裡斯, S·馬爾克姆 申請人:不列顛哥倫比亞大學