一種用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒的製作方法

2023-12-09 21:02:52 1

本發明屬於動物醫學動物疫病分子生物學診斷技術領域，主要涉及一種用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，主要用於鑑別Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒4重聚合酶鏈式反應。

背景技術：

自2015年下半年以來，在我國部分省份如河南、安徽、遼寧、河北、北京、山東、山西、江蘇、廣東等地雞場中出現了一種新發疾病，該病以心包積液和肝臟腫大為特徵，被稱為「心包積液-肝炎症候群」，目前認為其病原為Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)。FAdV粒子直徑為70-90nm，無囊膜，呈正二十面體對稱結構，核酸為雙股DNA。Ⅰ群禽腺病毒分為A、B、C、D、E共5個禽腺病毒種，每個種內的病毒主要根據交叉中和試驗結果進一步分為不同的血清型。本病既能水平傳播，又能垂直傳播，種雞群感染會造成商品雞群質量嚴重下降，死淘率上升，經濟損失巨大。

馬立克病(Marek′s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)引起雞的一種高度接觸傳染性淋巴組織增生性腫瘤性疾病，以內臟器官、外周神經、性腺、虹膜、肌肉和皮膚單獨或多發的淋巴樣細胞浸潤為特徵。MD存在於世界上所有的養禽國家和地區，對養禽業造成嚴重的經濟損失，在使用疫苗免疫以前，產蛋雞死亡率可高達60％，而肉雞的的淘汰率高達10％。馬立克病在養禽業中仍需得到高度的重視，主要源於疾病爆發的不可預測性、疫苗免疫的失敗以及馬立克病毒毒力的不斷增強，以此，世界各國均把馬立克病視為養禽業重要的傳染病之一。近年來，世界各地相繼報導馬立克病毒出現新變異，毒力進一步增強，出現特超強毒株，給本病的預防和控制帶來了新的問題。

雞白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起的雞多種腫瘤性疾病的統稱。以在成年雞中產生淋巴樣腫瘤和產蛋量下降為特徵。臨診上有多種表現形式，主要是淋巴細胞白血病。禽白血病病毒(ALV)屬反轉錄病毒科，C型腫瘤病毒屬禽白血病/肉瘤病毒群。並分為A、B、C、D和E5個亞群。A亞群是最常見的，並且與淋巴白血病最密切相關。自1868年首次報導淋巴白血病以來，一直被認為是嚴重危害養禽業的最重要的禽病之一。該病幾乎波及所有商品雞群。儘管該病呈漸進性發生和持續的低死亡率，但由於它以垂直傳播為主，使該病難以控制，使雞群在增重和產蛋方面受嚴重影響。尤其是患雞抵抗力下降，容易感染多種疾病，給雞群的飼養管理帶來極大困難。雞白血病是一種世界性分布的疾病，我國也普遍存在，給我國養雞業造成的損失是巨大的。因此，控制和消滅雞白血病是我國當前非常重要和十分迫切的問題。

禽網狀內皮組織增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是由網狀內皮組織增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起雞、鴨、鵝、火雞及其他禽類，以急性網狀細胞腫瘤形成、矮小症候群、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特徵的一群病理症候群。REV感染不僅能引起腫瘤，還可引起感染雞胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮，使雞的免疫功能下降、甚至喪失，導致免疫抑制，使感染雞極易繼發感染其他病毒病和細菌病。在我國，REV感染及在雞群中造成的危害已相當普遍並且愈發嚴重。

目前，對以上4種傳染病的檢測診斷手段主要有病毒分離鑑定，血清學技術如瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、間接免疫螢光，聚合酶鏈反應(PCR)技術等，其中以PCR技術最為靈敏和快速。現在對Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒均有建立相應PCR檢測方法的報導，翟新驗等利用雙重PCR技術對REV和MDV感染細胞以及臨床樣品進行檢測，認為所建立的方法是常規血清學、病理組織學方法所不能比擬的，可用於REV和MDV鑑別診斷。何秀苗等研製出了三重PCR方法，用以區別鑑定MDV、ALV和REV，方便和簡化了腫瘤病料的實驗室檢測。

但目前為止，通過一次PCR檢測就能直接診斷Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒感染的技術仍未見報導。針對以上4種病毒性傳染病在臨床上均引起肝脾腫大的病理特徵，能引起嚴重的免疫抑制，有一定的相似性，因此發明一種一次檢測就能診斷清楚這一類疾病的診斷試劑盒，顯得十分必要。

技術實現要素：

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一種用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV 4重PCR檢測試劑盒，主要用於鑑別Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒4重聚合酶鏈式反應，可一次檢測就能診斷出是否為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒感染。該試劑盒具有操作簡便、結果直觀、靈敏度高、特異性好、大幅縮短檢測時間，能直接用於臨床樣品檢測的特點。

為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案予以實現。

一種用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，用於鑑別Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒4重聚合酶鏈式反應，其特徵在於，包括裂解液、擴增反應混合液、陰性對照物和陽性對照物。

所述裂解液的成分為DNAiso Reagent；所述擴增反應混合液的原料成分包含滅菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1FADV-F上遊引物、25μmol·L-1FADV-R下遊引物、25μmol·L-1MDV-F上遊引物、25μmol·L-1MDV-R下遊引物、25μmol·L-1ALV-F上遊引物、25μmol·L-1ALV-R下遊引物、25μmol·L-1REV-F上遊引物、25μmol·L-1REV-R下遊引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶；所述陰性對照物為滅菌三蒸水；所述陽性對照物為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒的陽性質粒混合物。

所述FADV-F上遊引物的序列為：5』-ATGACTGCGCTTACTCCCGA-3』；

所述FADV-R下遊引物的序列為：5』-ACCCAGATAGTTGGTACC-3』；

所述MDV-F上遊引物的序列為：5』-CAGCTGCGTATTTTCCCCG-3』；

所述MDV-R下遊引物的序列為：5』-AATTACTTGGTCTTTAACC-3』；

所述ALV-F上遊引物的序列為：5』-TGTAGTGTTATGCAATACTC-3』；

所述ALV-R下遊引物的序列為：5』-GGGTATGTTGGCTCCCTGCA-3』；

所述REV-F上遊引物的序列為：5』-AATGTGGGAGGGAGCTCCGG-3』；

所述REV-R下遊引物的序列為：5』-ACATTTTCCCTCATTGGA-3』。

優選地，所述擴增反應混合液中的各原料成分的體積比為14.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5。

上述用於鑑別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒對Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒4重聚合酶鏈式反應的檢測方法，包括以下步驟：

1)吸取100μL疑似病例樣品置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然乾燥，再用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得到疑似病例樣品的DNA溶液，備用；

2)吸取100μL陰性對照物置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然乾燥，再用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用；

3)取擴增反應混合液23μL，加入疑似病例樣品的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到疑似病例樣品擴增反應產物，備用；

4)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產物，備用；

5)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產物，備用；

6)分別將疑似病例樣品擴增反應產物、陰性對照樣品擴增反應產物和陽性對照物擴增反應產物在10g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳。

電泳結果為陰性對照不出條帶，陽性對照出1085bp、750bp、508bp、312bp共4個條帶，說明所述4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒有效；如果樣品中出現1085bp一個條帶，即為單一馬立克氏病病毒感染；樣品出現750bp一個條帶，即為單一Ⅰ群禽腺病毒感染；樣品出現508bp一個條帶，即為單一禽網狀內皮組織增生症病毒感染；樣品出現312bp一個條帶，即為單一雞淋巴細胞白血病病毒感染。如果出現2條、3條或4條特異性條帶，即為相應病毒的2重、3重或4重混合感染。

本發明的用於鑑別診斷FAdV/MDV/ALV/REV 4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒的驗證性試驗，包括特異性試驗、靈敏度試驗、穩定性試驗以及田間試驗，具體試驗如下：

①特異性試驗

使用本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，按照以上說明，提取Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒等DNA病毒的DNA作為模板，同時將這4種病毒混合作為1個樣品提取DNA作為模板，用擴增混合液進行多重PCR，擴增完畢後電泳觀察。按照RNAiso Reagent試劑說明提取新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、H9禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒總RNA，反轉錄獲得第一鏈cDNA，用本發明的用於鑑別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒的擴增混合液進行多重PCR，擴增完畢後電泳觀察。

結果顯示：馬立克氏病病毒出現1085bp一個條帶，Ⅰ群禽腺病毒出現750bp一個條帶，禽網狀內皮組織增生症病毒出現508bp一個條帶，雞淋巴細胞白血病病毒出現312bp一個條帶，以上4種病毒混合樣品出現1085bp、750bp、508bp、312bp共4個條帶，新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、H9禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒均沒有出現條帶(見圖1)。回收各陽性樣本的條帶，純化後連接pMD18-T載體，轉化DH5ɑ感受態細胞，取PCR鑑定為陽性得菌液，提取質粒進行測序，將測得的序列與所用毒株基因序列進行比較，發現序列完全一致。

結果證實本發明的一種用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法具有很高的特異性，能準確擴增Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒基因片段，並能直觀區分這4種病毒的感染情況。

②靈敏度試驗

使用本發明提供的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，提取Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒DNA，紫外分光光度計測定濃度後稀釋調整各病毒DNA濃度為200pg·L-1，混合4種病毒DNA作為模板，按照10倍濃度梯度稀釋至10-9，用本發明的用於鑑別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒提供的擴增混合液進行多重PCR，擴增完畢後電泳觀察。結果顯示，本發明的用於鑑別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒能檢測的極限為2.0×10-5pg·L-1，提示本方法靈敏度高(見圖2)。

③穩定性試驗

本發明提供的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒保存條件為-20℃，每月1次用Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒及對照進行檢測試驗，連續檢測6個月，檢測試劑盒存放的穩定性。

結果顯示，6個月內試劑盒檢測結果完全一致，說明本發明提供的用於鑑別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒有良好的穩定性。

④田間試驗

採集了陝西省雞場臨床肝脾腫大的組織病料和血清共50份，用本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法進行診斷，發現臨床存在多種感染現象，有單一的Ⅰ群禽腺病毒感染，有馬立克氏病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒雙重混合感染，有Ⅰ群禽腺病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒雙重混合感染，有馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒3重混合感染現象(見圖3)。

田間試驗證明本發明提供的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒的實用性和適用性良好。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

本發明採用多重PCR擴增，4種病變相似且同為DNA病毒的病毒病一次檢測，檢測總時間控制在3小時左右，達到了易於操作、方便快捷、快速檢測的目的。本發明能徹底解決這4種病變相似且同為DNA病毒的病毒病診斷問題，快速、靈敏，特異性好，能在3小時診斷清楚4種病毒病，非常適合大面積快速檢測普查，適用於各實驗室、動物疫病預防控制中心以及條件具備的大中型養殖場。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

圖1為本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法的特異性試驗電泳圖；

圖中M為DL2000 DNA分子質量標準，1為馬立克氏病病毒，2為Ⅰ群禽腺病毒，3為禽網狀內皮組織增生症病毒，4為雞淋巴細胞白血病病毒，5為以上4種病毒混合液，6為新城疫病毒，7為傳染性支氣管炎病毒，8為H9禽流感病毒，9為傳染性法氏囊炎病毒；

圖2為本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法的靈敏度試驗電泳圖；

圖中M為DL2000 DNA分子質量標準，1～9為馬立克氏病病毒、Ⅰ群禽腺病毒、禽網狀內皮組織增生症病毒和雞淋巴細胞白血病病毒DNA梯度稀釋，濃度範圍為200×10-1pg·L-1～200×10-9pg·L-1；

圖3為本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒對部分臨床樣品的檢測結果圖；

圖中M為DL2000 DNA分子質量標準，1-16為部分組織病料檢測結果。其中1為馬立克氏病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒雙陽性結果；2、7、8、13分別為馬立克氏病病毒、禽網狀內皮組織增生症病毒和雞淋巴細胞白血病病毒三陽性結果；5為Ⅰ群禽腺病毒陽性結果；10為禽網狀內皮組織增生症病毒和雞淋巴細胞白血病病毒雙陽性結果；3、4、6、9、11、12、14、15、16為陰性結果。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域的技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。

實施例1

(1)引物的設計與製備

參考GenBank上公布的Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒基因組序列，結合本課題組數年研究測定的相關病毒基因序列，用DNAStar生物軟體綜合分析比對，針對以上4種病毒基因設計了8條引物，引物的序列如下：

FADV-F上遊引物：5』-ATGACTGCGCTTACTCCCGA-3』；

FADV-R下遊引物：5』-ACCCAGATAGTTGGTACC-3』；

MDV-F上遊引物：5』-CAGCTGCGTATTTTCCCCG-3』；

MDV-R下遊引物：5』-AATTACTTGGTCTTTAACC-3』；

ALV-F上遊引物：5』-TGTAGTGTTATGCAATACTC-3』；

ALV-R下遊引物：5』-GGGTATGTTGGCTCCCTGCA-3』；

REV-F上遊引物：5』-AATGTGGGAGGGAGCTCCGG-3』；

REV-R下遊引物：5』-ACATTTTCCCTCATTGGA-3』。

(2)陰性對照物和陽性對照物的製備

陰性對照物為滅菌三蒸水，陽性對照物為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒的陽性質粒混合物。

(3)用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒的製備

本實施例的用於鑑別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒由以下組分組成：

1)裂解液：成分為DNAiso Reagent，20個反應共計20mL，裝成1瓶；

2)擴增反應混合液：由滅菌三蒸水、10倍稀釋的(10×)PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1FADV-F上遊引物、25μmol·L-1FADV-R下遊引物、25μmol·L-1MDV-F上遊引物、25μmol·L-1MDV-R下遊引物、25μmol·L-1ALV-F上遊引物、25μmol·L-1ALV-R下遊引物、25μmol·L-1REV-F上遊引物、25μmol·L-1REV-R下遊引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶組成，每個反應的體積比為14.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共計23μL，20個反應共計460μL，裝成1管；

3)陰性對照物為滅菌三蒸水，20個反應共計2.0mL，裝成1瓶；陽性對照物為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網狀內皮組織增生症病毒陽性質粒混合物，20個反應共計40.0μL，裝成1管；

本發明試劑盒裂解液保存條件為常溫，擴增反應混合液、陰性對照物和陽性對照物的保存條件為-20℃。

實施例2

(1)引物的設計與製備

同實施例1。

(2)組織病料樣品的處理與DNA溶液的提取

1)取疑似病例組織病料如腫大的肝臟、脾臟3～5g，剪碎成糊狀，加5倍無菌PBS，用組織研磨器充分研磨，收集懸液，4℃、12 000r/min離心10min，吸取上清液，備用。

2)吸取100μL疑似病例組織病料的上清液置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管空氣中自然乾燥，用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得疑似病例組織病料的DNA溶液，備用。

3)同時進行陰性對照樣品溶液的處理：吸取100μL陰性對照物滅菌三蒸水置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然乾燥，再用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用。

(3)用本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒檢測MDV、FAdV、REV和ALV

4)取擴增反應混合液23μL，加入疑似病例組織病料的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次進行95℃預變性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，並依此進行35個循環，最後72℃延伸10min，得到疑似病例組織病料擴增反應產物，備用。

5)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產物，備用。

6)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產物。

實施例3

(1)引物的設計與製備

同實施例1。

(2)血清樣品的處理與DNA溶液的提取

1)對疑似病例雞進行翅靜脈採血，自然凝固，待血清析出後分離血清，備用。

2)吸取100μL待檢分離血清置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用75％乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管空氣中自然乾燥，用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得到待檢分離血清的DNA溶液，備用。

3)同時進行陰性對照樣品溶液的處理：吸取100μL陰性對照物滅菌三蒸水置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然乾燥，再用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用。

(3)用本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒檢測MDV、FAdV、REV和ALV

4)取擴增反應混合液23μL，加入待檢分離血清的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次進行95℃預變性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，並依此進行35個循環，最後72℃延伸10min，得到待檢分離血清擴增反應產物，備用。

5)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產物，備用。

6)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產物。

實施例4

(1)引物的設計與製備

同實施例1。

(2)全血樣品的處理與DNA提取

1)注射器中加入肝素鈉抗凝劑，對疑似病例雞進行翅靜脈採血，混勻後即得抗凝血，備用。

2)吸取100μL待檢抗凝血置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用75％乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管空氣中自然乾燥，用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得待檢抗凝血的DNA溶液，備用。

3)同時進行陰性對照樣品溶液的處理：吸取100μL陰性對照物滅菌三蒸水置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉澱10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然乾燥，再用40μL的8mmol·L-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用。

(3)用本發明的用於診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒檢測MDV、FAdV、REV和ALV

4)取擴增反應混合液23μL，加入待檢抗凝血的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次進行95℃預變性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，並依此進行35個循環，最後72℃延伸10min，得到待檢抗凝血的擴增反應產物，備用。

5)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產物，備用。

6)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環，最後在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產物。

結果判定

(1)稱取1.0g瓊脂糖，加入100mL 1×TAE緩衝液中，微波爐中加熱融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙錠，混勻，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為5mm，待冷卻凝固後拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1×TAE緩衝液淹沒膠面；

(2)分別取5μL上述實施例2～4所得的各個擴增產物和上樣緩衝液混勻，加入加樣孔中，同時加5μL DL2000 DNA分子量標準；

(3)電壓80V～100V，或電流40mA～50mA，電泳30min；

(4)取出凝膠，置入紫外分析儀中觀察，或置入凝膠成像系統中觀察照相；

(5)以DL2000 DNA分子質量標準作為參照，陰性對照不出條帶，陽性對照出1085bp、750bp、508bp、312bp共4個條帶，說明對照成立。樣品中出現1085bp一個條帶，即為單一馬立克氏病病毒感染；樣品出現750bp一個條帶，即為單一Ⅰ群禽腺病毒感染；樣品出現508bp一個條帶，即為單一禽網狀內皮組織增生症病毒感染；樣品出現312bp一個條帶，即為單一雞淋巴細胞白血病病毒感染。如果出現2條、3條或4條特異性條帶，即為相應病毒的2重、3重或4重混合感染。

雖然，本說明書中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。