一種測定巰基蛋白酶酶活的方法及其專用穩定溶液的製作方法
2023-12-10 02:24:31 1
專利名稱：一種測定巰基蛋白酶酶活的方法及其專用穩定溶液的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶活力測定方法及其專用穩定溶液，特別是涉及一種巰基蛋白酶活力測定的方法及其專用穩定溶液。
背景技術：
使用巰基蛋白酶進行紅細胞血型、免疫性血型抗體檢定已有近60年的應用歷史。木瓜蛋白酶(Papain)、菠蘿蛋白酶(Bromelein)和無花果蛋白酶(Ficin)是幾種常用的血型血清學使用的巰基蛋白酶。
酶活力效價的標化是涉及體外血型血清實驗檢定質量的關鍵內容，國際眾多學者，如R，Lsmbert(Medical Sciences 1978；35233)、PK Phillips(J ClinPathol 1988；457)、M.L.Scoott(Medical Laboratory Sciences 1988；457)等人都曾報導過血型血清學使用的巰基蛋白酶的活力效價分析方法，但這些活力效價分析方法與體外血型血清檢定實驗方法差距較遠，如ISBT/ICSH-1994工作條約顯示用M.L.Scoott等人的報導方法標化的木瓜蛋白酶試劑進行的體外血型血清學實驗檢定會產生「假陽性」反應。
發明內容
本發明的目的是提供一種較準確地測定巰基蛋白酶活力效價的方法及其專用穩定溶液。
本發明所提供的巰基蛋白酶的穩定溶液，含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mmol/L普魯蘭。
為了增加巰基蛋白酶在溶液中的穩定性，所述穩定溶液一般還含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二鉀和0.2-0.3mol/L甘露醇。
磷酸鹽優選的是磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，所述磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的摩爾比為20-22∶1。
穩定溶液的pH為5.3-5.7。
本發明所提供的測定巰基蛋白酶活力效價的方法，是用巰基蛋白酶、專用穩定溶液配製的酶樣品，用pH6.8-7.2的1-2％偶氮化白蛋白(底物溶液)溶液與酶樣品溶液在36.5-37.5℃反應10分鐘，在430nm測定OD值，計算酶活力效價；所述巰基蛋白酶的穩定溶液含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普魯蘭。
所述底物溶液是用偶氮化白蛋白、磷酸鹽溶液配製的，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，它們的摩爾比為1.5-2.5∶1。
在上述內容的基礎上，酶活力效價測定的具體步驟包括1)將濃度為30-40mg/100ml的樣品溶液、底物溶液在36.5-37.5℃水浴箱中預熱10分鐘；2)將底物溶液和樣品溶液按體積比10∶1比混合，置37℃±0.5℃水浴箱反應10分鐘；3)加入4-6％三氯乙酸溶液1ml，混合；4)離心取上清液，加入等體積的0.5mol/L氫氧化鈉溶液；5)在430nm測定酶水解液OD值。
本發明由於採用了上述技術方案，具有以下優點1、使用了較強的緩衝體系，將酶反應過程的pH控制在了7.0±0.1範圍內，降低了測量不定度。
2、由0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸、0.05-0.10mmol/L普魯蘭配製酶原料的樣品溶液，對酶樣品的激活、酶樣品溶液的穩定是重要的，可以克服酶樣品溶液的活力衰減，降低測量不定度。
3、控制酶與底物的水解反應時間、反應溫度、離子強度、pH條件等實驗條件，使酶活力效價的測定條件與體外血型血清學實驗檢定條件保持一致，為體外血型血清學實驗檢定使用的巰基蛋白酶質量標準評價，以及體外血型血清學實驗檢定技術的評價提供了數據化保證。
4提出了酶試劑溶液的活力控制標準，10-16U/50μl，或100-160U/50μl。
具體實施例方式
實施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取與製備取1000g的番木瓜果漿冰凍物，用微波加熱融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸鹽緩衝液(pH5.5)，在勻漿器中勻漿。
加入1％殼聚糖溶液100ml，勻漿攪拌，室溫靜置2小時後過濾，去除沉澱，保留濾液。
向濾液中加入硫酸銨至35％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉澱；向離心上清液中加入硫酸銨至50％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉澱；在上清液中加入過量酒石酸溶液，調節pH至＜2.5，室溫靜置60分鐘。10000×g離心20分鐘，棄去沉澱物；最後再向上清液中加入硫酸銨至70％飽和度，室溫靜置60分鐘，10000×g離心20分鐘，收集沉澱物。
將沉澱物用200ml純水溶解，然後用截留分子量為1萬的聚碸中空纖維超濾膜超濾，在超濾過程中分次加入2-8℃水，在0.1兆帕的條件下循環超濾1h，得到超濾濃縮液。
向上述溶液中加入100ml 0.2mol/L磷酸鈉緩衝液(pH5.5)，混勻。用該磷酸鉀緩衝液預先平衡纖維素CM-92色譜柱，然後以5ml/min的速度，將溶液上柱，以0.7mol/L磷酸鈉緩衝液(pH5.5)為洗脫液，收集木瓜凝乳蛋白酶洗脫液，用截留分子量為1萬的聚碸中空纖維超濾膜濃縮洗脫液。
向濃縮液加入普魯蘭0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷凍乾燥得到木瓜凝乳蛋白酶乾燥物30g。
實施例2、巰基蛋白酶製劑的製備本實施例製備了木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶的製劑，其中木瓜凝乳蛋白酶為實施例1所得，木瓜酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶為市售商品酶。
一、木瓜凝乳蛋白酶製劑1配方普魯蘭 0.048mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol木瓜凝乳蛋白酶 200000PU2、製備工藝及過程定量稱取上述溶質，溶解於純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶2000PU規格分裝至潔淨西林瓶。用冷凍乾燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然後啟動乾燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓乾燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到成品木瓜凝乳蛋白酶製劑。
二、木瓜蛋白酶製劑1配方普魯蘭 0.05mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol
抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol木瓜蛋白酶 200000PU2、製備工藝及過程定量稱取上述溶質，溶解於純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶2000PU規格分裝至潔淨西林瓶。用冷凍乾燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然後啟動乾燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓乾燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到木瓜蛋白酶製劑。
三、菠蘿蛋白酶製劑1配方普魯蘭 0.042mmol甘露醇 0.28mol海藻糖 0.02mol抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.055mol菠蘿蛋白酶 200000PU2、製備工藝及過程定量稱取上述溶質，溶解於純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶2000PU規格分裝至潔淨西林瓶。用冷凍乾燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然後啟動乾燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓乾燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到菠蘿蛋白酶製劑。
四、無花果蛋白酶製劑1配方普魯蘭 0.04mmol甘露醇 0.24mol海藻糖 0.02mol抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol無花果蛋白酶200000PU2、製備工藝及過程定量稱取上述溶質，溶解於純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶2000PU規格分裝至潔淨西林瓶。用冷凍乾燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然後啟動乾燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓乾燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到無花果蛋白酶製劑。
實施例3、巰基蛋白酶原料的活力效價測定本實施例分別測定木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶的酶活，其中木瓜凝乳蛋白酶為實施例1所得，木瓜酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶為市售。
1、溶液配製1)酶激活—穩定劑(pH5.5±0.2)L-半胱氨酸 0.025mol乙二胺四乙酸二鉀0.03mol甘露醇 0.3mol普魯蘭 0.05mmol磷酸二氫鉀 0.064mol磷酸氫二鈉 0.003mol將上述溶質溶解於900ml純水中，用純水定容至1000ml。
2)樣品溶液分別稱取酶樣品30mg，用酶激活—穩定劑溶解，稀釋至100ml定容。
3)配製底物溶液(pH7.0±0.1)稱取磷酸氫二鈉0.93mol，磷酸二氫鈉0.06mol，，用蒸餾水溶解，稀釋至1000ml定容。稱取偶氮化白蛋白2.0g，溶解於100ml上述磷酸鹽溶液中。
2、酶活力效價測定1)將樣品溶液、底物溶液在37℃±0.5℃水浴箱中預熱10min。
2)用加樣器吸取底物溶液1.0ml、樣品溶液100μl注入試管中，置37℃±0.5℃水浴箱反應10分鐘。
3)取出試管，加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4)1000×g離心5分鐘，吸取上清液1ml，加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液1ml，混合。
5)在430nm下測定該溶液OD值。
6)活力效價定義在上述條件下，酶樣品溶液在430nm產生0.002吸光值的改變為一個酶活力效價單位。
7)活力效價計算公式公式IPU＝A/0.002×10×100/10/W式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為係數；100為酶樣品溶液體積，(ml)；10為反應時間(分鐘)；W為酶樣品重量，(mg)。
公式IIPU＝A/0.002×10×100/W式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為係數；100為酶樣品溶液的體積(ml)；W為酶樣品重量，(mg)。
按照上述的計算公式I計算酶活力木瓜凝乳蛋白酶為750PU/mg，木瓜蛋白酶為500PU/mg，菠蘿蛋白酶450PU/mg，無花果蛋白酶為480PU/mg。
按照上述的計算公式II計算酶活力，木瓜凝乳蛋白酶為7500PU/mg，木瓜蛋白酶為5000PU/mg，菠蘿蛋白酶4500PU/mg，無花果蛋白酶為4800PU/mg實施例4巰基蛋白酶製劑活力效價測定本實施例分別測定木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶製劑的活力效價，所測定的酶樣品均為本發明實施例2製備。
1溶液配製1)磷酸鹽溶液磷酸二氫鉀 0.064mol磷酸氫二鈉 0.003mol將上述溶質溶解於900ml純水中，用純水定容至1000ml。
2)樣品溶液取標示活力效價同為2000PU規格的木瓜凝乳蛋白酶製劑、木瓜蛋白酶製劑、菠蘿蛋白酶製劑和無花果蛋白酶製劑各1瓶，用上述的磷酸鹽溶液10毫升溶解，混合均勻。
3)底物溶液(pH7.0±0.1)稱取磷酸氫二鈉0.93mol，磷酸二氫鈉0.06mol，，用蒸餾水溶解，稀釋至1000ml定容。
稱取偶氮化白蛋白2.0g，溶解於100ml上述磷酸鹽溶液中。
2、酶活力效價測定1)將樣品溶液、底物溶液在37℃±0.5℃水浴箱中預熱10min。
2)用加樣器吸取底物溶液1.0ml、樣品溶液100μl注入試管中，置37℃±0.5℃水浴箱反應10分鐘。
3)取出試管，加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4)1000g離心5分鐘，吸取上清液1ml，加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液1ml，混合。
5)在430nm下測定該溶液OD值。
6)活力效價定義在上述條件下，酶樣品溶液在430nm產生0.002吸光值的改變為一個酶活力單位。
7)活力效價的計算公式公式IPU＝A/0.002×10×2/10式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為係數；2為酶樣品溶液體積，ml10為反應時間(分鐘)公式IIPU＝A/0.002×10×2式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為係數；2為酶樣品溶液的體積(毫升)；按照上述的計算公式I計算酶活力木瓜凝乳蛋白酶製劑的活力效價為2010PU/瓶，木瓜蛋白酶製劑的活力效價為2002PU/瓶、菠蘿蛋白酶製劑的活力效價為2004PU/瓶，無花果蛋白酶製劑的活力效價為2012PU/瓶；依照體外血型血清學實驗檢定靈敏度的評價標準，每50μl上述的巰基蛋白酶試劑溶液所應具備的活力效價為10-16PU。
按照上述的計算公式II計算酶活力，木瓜凝乳蛋白酶製劑的活力效價為20100PU/瓶，木瓜蛋白酶製劑的活力效價為20020PU/瓶、菠蘿蛋白酶製劑的活力效價為20040PU/瓶，無花果蛋白酶製劑的活力效價為20120PU/瓶；依照體外血型血清學實驗檢定靈敏度的評價標準，每50μl上述的巰基蛋白酶試劑溶液所應具備的活力效價為100-160PU。
權利要求
1.一種巰基蛋白酶的穩定溶液，含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普魯蘭。
2.根據權利要求1所述的穩定溶液，其特徵在於所述巰基蛋白酶的穩定溶液還含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二鉀和0.2-0.3mol/L甘露醇。
3.根據權利要求1或2所述的穩定溶液，其特徵在於所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物。
4.根據權利要求3所述的穩定溶液，其特徵在於所述磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的摩爾比為20-22∶1；所述溶液pH為5.3-5.7。
5.根據權利要求1或2所述的穩定溶液，其特徵在於所述每50μl酶試劑溶液應具有的活力效價是1/10分鐘10-16PU，或10分鐘100-160PU。
6.一種測定巰基蛋白酶活力效價的方法，是用穩定溶液配製的巰基蛋白酶酶樣品溶液與pH6.9-7.1的1-2％偶氮化白蛋白底物溶液與酶樣品溶液在36.5-37.5℃反應10分鐘，在430nm測定OD值，計算酶活力效價；所述巰基蛋白酶的穩定溶液含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普魯蘭。
7.根據權利要求6所述的測定巰基蛋白酶酶活的方法，其特徵在於所述的巰基蛋白酶的穩定溶液還含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二鉀和0.2-0.3mol/L甘露醇。
8.根據權利要求6或7所述的測定巰基蛋白酶酶活的方法，其特徵在於所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，它們的摩爾比為20-22∶1。
9.根據權利要求6或7所述的測定巰基蛋白酶酶活的方法，其特徵在於所述偶氮化白蛋白是用磷酸鹽溶液配製的，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，它們的摩爾比為1.5-2.5∶1。
10.根據權利要求6所述的測定巰基蛋白酶酶活的方法，其特徵在於所述酶活力效價測定的步驟包括1)將濃度為30-40mg/100ml的樣品溶液、底物溶液在36.5-37.5℃水浴箱中預熱10分鐘；2)將底物溶液和樣品溶液按體積比10∶1比混合，置37℃±0.5℃水浴箱反應10分鐘；3)加入4-6％三氯乙酸溶液1ml，混合；4)離心取上清液，加入等體積的0.5mol/L氫氧化鈉溶液；5)在430nm測定酶水解液OD值。
全文摘要
本發明公開了一種測定巰基蛋白酶酶活的方法及其專用穩定溶液，涉及酶活測定方法。本發明所提供的巰基蛋白酶的穩定溶液，含有0.06－0.08mol/L磷酸鹽、0.025－0.05mol/L L－半胱氨酸、0.05－0.10mol/L普魯蘭。本發明所提供的測定巰基蛋白酶酶活的方法，包括如下步驟用磷酸鹽溶液配製酶樣品，用pH6.8－7.2的2％偶氮化白蛋白溶液與酶樣品溶液在36.8－37.2℃反應10分鐘，430nm下測定OD值，計算酶活；所述磷酸鹽溶液含有0.06－0.08mol/L磷酸鹽、0.025－0.05mol/L L－半胱氨酸、0.05－0.10mol/L普魯蘭。本發明的酶活效價的測定方法與體外血型血清學檢定實驗條件相一致，測定結果穩定、精確，適用於體外血型血清學檢定實驗使用的巰基蛋白酶試劑的酶活力測定。
文檔編號C12Q1/37GK1584047SQ20041004610
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月31日 優先權日2004年5月31日
發明者盧世昌, 劉俊鳳 申請人:廣州偉仕科技有限公司