雙靶標/多靶標小核酸治療眼部疾病的組合物及應用的製作方法
2023-12-10 07:16:17
專利名稱：雙靶標/多靶標小核酸治療眼部疾病的組合物及應用的製作方法
雙靶標/多靶標小核酸治療眼部疾病的組合物及應用
技術領域
本發明主要涉及一種核苷酸藥物，特別涉及一種雙靶標/多靶標的小核酸雞尾酒藥物，應用RNA幹擾(RNAi)技術來治療眼部疾病如糖尿病視網膜病變等。
背景技術：
糖尿病視網膜病變是全球範圍內引發勞動力人口失明最常見的原因。該疾病主要通過損害眼部光敏感的視網膜組織的小血管，引起視網膜中央附近即斑點部位的液體洩漏，引發黃斑水腫。斑點為一些如閱讀、駕駛和人臉識別等活動提供中央視覺，黃斑水腫病人視網膜組織膨脹，如不及時治療將導致失明。
除了糖尿病視網膜病變，其他大量的眼部疾病也是由於過量血管增生(NV)所致， NV是眼內血管異常的增殖和生長。眼部NV本身就有許多副作用，也是許多嚴重眼病的早期病理學步驟，儘管有新的治療方法和製劑出現，但對於這些眼部NV病人幾乎沒有多少可供選擇的治療方法。
美國國立衛生研究院(NIH)下屬國立眼科研究所(NEI)估計，有40萬美國人患有不同種類的眼部皰疹，每年有5萬名新生或者復發病例，其中更嚴重的基質角膜炎大約佔了 25%。一項更大規模的研究表明，眼部皰疹的年復發率是10%，兩年復發率是23%，20年內的復發率高達63%。雖然抗病毒藥物可以在一定程度上控制單純皰疹病毒(HSV)感染，但在治療HSV引起的基質角膜炎和保護病人免遭失明方面沒有效果。
我國眼部疾病主要以眼部炎症、白內障、青光眼、乾眼病視疲勞、近視眼為主，各疾病症狀患病率絕對值均不高(在2. 5%。左右)。但隨著人口的增長和老齡化的發展，我國眼科疾病發病率呈上升態勢。據衛生部統計年鑑及對醫生的實地調查，患病率最高的眼科疾病依次為白內障、青光眼、視網膜病、屈光不正、結膜病、眼外傷。而視網膜脫落與斷裂為患病率居第三的眼科疾病，該病患者佔眼科患者比例接近15%。
眼部血管增生(NV)疾病可分為影響眼睛前部和影響眼睛後部(視網膜)兩種，不同部位的NV有不同的原因，但其生物化學和生理學特徵幾乎是一樣的，與眼睛部位無關。因此，能有效幹擾眼部NV生化過程的方式將可以有效治療任何NV為主要病因或潛在病因的眼部疾病，不管疾病損害的是眼睛前部還是眼睛後部。
眼部血管增牛的牛物化學和牛理學與其他組織類似，眼部組織需要持續的營養供給，因此需要新血管生成，這一過程通過促進因子和抑制因子之間的平衡而保持平衡。然而，許多眼部血管增生疾病不能正確地維持平衡，導致損傷性新生血管過度生長。儘管病理學和失明的誘因差異很大，但這一過度增生過程幾乎是一致的，與眼睛或疾病的區域無關。病理學的共同特徵給大量眼部疾病的治療提供了有效的幹預方式。
正常眼角膜是無血管的，HSV本身也不表達任何血管新生蛋白，但是感染眼部組織後表達血管生長因子從而誘導角膜血管增生(NV)。血管生長因子最初由病毒感染的角膜表皮、非炎症細胞產生，接著由基質內的炎症細胞(中性粒細胞PMN和巨噬細胞)表達。通過植入純化的HSV病毒DNA片段(HSV DNA,富含CpG結構域)或合成的CpG寡聚核苷酸(CpG 0DN)，建立HSV誘導的角膜血管增生模型。這一模型已成為角膜血管增生和單純皰疹病毒性基質角膜炎疾病的臨床研究模型，有利於檢測抑制眼部血管增生疾病的的治療效果。
一種較好的幹擾治療方式是抑制這些疾病共同的病理學因素。大量研究表明， VEGF介導的血管新生和血管再生是許多眼部血管增生疾病發生的最主要原因。VEGF介導的血管新生在所有NV相關的眼部疾病的血管增生中起到核心作用。VEGF家族包括五個結構相關的生長因子VEGF-A、胎盤生長因子(PIGF )、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。已知的受體包括三種結構同源的酪氨酸激酶受體，VEGFR-1 (Flt-1 )、VEGFR-2 (KDR或Flk-1)和VEGFR-3 (Flt-4)，這些受體與不同的VEGF有不同的親和力，具有不同的功能。目前，對四種VEGF的功能和調控機制了解較少，僅知道VEGF-A和VEGFR-2結合誘導血管新生和血管再生，也增加血管通透性。
是正常血管形成和新生血管重塑過程中起重要作用的生長因子，某些疾病條件下，如腫瘤發生時，形成新血管用於傳輸氧和養分促進非正常組織的快速生長，此時VEGF 新生血管途徑被激活。眼內表達血管新生蛋白VEGF與人體血管增生紊亂及小鼠中缺血引起的視網膜血管增生密切相關。因此，由VEGF和VEGF受體組成的VEGF信號通路，是抑制視網膜血管新生的合理靶標。
在理解了 VEGF血管新生信號通路中關鍵因子後，目前許多研究採用VEGF-A的抑制劑作為候選治療製劑，用於治療眼部血管增生疾病。單獨使用這類製劑或者與雷射治療聯合，有明顯的臨床治療效果，能促進視覺恢復。這些製劑包括Ranibizumab (Lucentis)> Pegaptanib sodium (Macugen)和 Bevacizumab (Avastin),所有這些 VEGF 抑制劑通過阻斷 VEGF蛋白功能而起作用。Macugen 是一種抑制VFGE與其受體結合的適體寡聚核苷酸。儘管這些眼部血管新生的研究，與其他如腫瘤生長之類的血管新生疾病證明了 VEGF通路的臨床治療價值，但目前的實驗製劑對許多病人依然無效。很明顯，需要開發更好的VEGF通路抑制劑來治療這些眼部疾病。
在內皮增殖中上調，這可能是對VEGF-A或缺氧的直接反應。一般認為VEGFR-2是血管生長的血管新生信號，在人體中名為激酶插入區受體(KDR)，小鼠中名為胎肝激酶-1 (Flk-1)，是受體酪氨酸激酶(RTK)家族ΠΙ的一員。VEGFR-2包含7個細胞外免疫球蛋白樣結構域、一個跨膜結構域和一個包含激酶插入序列的細胞內酪氨酸激酶結構域。VEGFR-2 的表達基本僅限於內皮細胞，全長的VEGFR-2前體蛋白包含1356個胺基酸，其中有19個胺基酸為信號肽。VEGFR-2與VEGF高親和力結合，在腫瘤血管新生和其他包含病理性血管新生的疾病中發生重要作用。採用中和抗體或小分子酪氨酸激酶受體(TKR)抑制劑阻斷 VEGFR-2能破壞血管新生、阻止腫瘤侵襲。
大量研究證實VEGF在新血管形成中起到核心作用，但令人費解的是，VEGF拮抗劑的治療效果卻有限。最近，研究表明轉化生長因子(TGF-bl)與新血管形成有關，Smad-4 (mothers against decapentaplegic protein homo log 4,一種細胞內信號轉導分子)在 TGF-b信號轉導中起最重要的作用。一項研究顯示氧誘導的新生小鼠視網膜病與視網膜中 TGF-b和Smad-4的mRNA表達上升有關，也有研究發現TGF_b能誘導細胞凋亡。例如，用TGF-bl刺激人二倍體成纖維細胞將引發出現SIPS的生物標誌物，如細胞衰老β -半乳糖苷酶(SA-β -Gal)的活性，同時衰老相關基因Apo J、纖粘連蛋白(fibronectin、FN)和平滑肌22 (SM22)的mRNA水平穩定上升。不同細胞系的體外研究顯示TGF-bl受到氧化應激的誘導，因此，有假設認為氧化應激誘導的早衰是TGF-bl表達上升引起的。之前有研究顯示哺乳動物衰老過程中視網膜色素上皮細胞(RPE)發生衰老，而體外細胞實驗證實人RPE細胞暴露在高濃度氧中將發生凋亡。老年黃斑變性(AMD)是否發生RPE細胞衰老還不清楚， 組織化學檢測表明AMD病人RPE細胞中的TGF-bl表達量增加。使用TGF-bl的中和抗體治療，能夠阻止氧化應激誘導的衰老生物標誌物的上升。另一方面，TGF-bl也是一種促炎症因子，參與組織疤痕形成，被懷疑為抗血管增生治療中視網膜疤痕形成的一個原因。因此， 敲低VEGF通路的多種因子或在敲低VEGF通路因子的同時抑制(或沉默)TGF-bl將是治療眼部疾病如糖尿病視網膜病變和AMD的新手段。發明內容
本發明涉及用核酸幹擾(RNAi)介導的抑制基因表達和生化途徑來獲得對眼病有效的治療。RNAi製劑包括雞尾酒小核酸寡聚核苷酸來抑制(I) VEGF和VEGFR-2、(2)促炎症因子TGF-bl。
本發明提供的組合物，有包含二種小核酸分子和藥物載體的，該二種小核酸分子靶向的基因選自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b I基因中的二種；也有包含三種小核酸分子和藥物載體的，該三種小核酸分子靶向的基因分別為VEGF基因、VEGFR2基因、TGF_b I基因。
幹擾(RNA interference, RNAi),是由雙鏈RNA寡聚核苷酸促進的序列特異性的信使R NA (mRNA)降解的過程，經常被稱為「基因沉默」。這一強有力的方法已經被證實是基因功能發現和確證的重要工具，也有巨大的潛力成為新的基因特異性藥物。在我們的抑制眼部血管增生的抗血管新生RNAi設計中，選擇了 VEGF-A、VEGFR_2和TGF-bl。根據Tuchl 研究團隊提出的通用規則設計小幹擾RNA (小核酸)，為21個核苷酸長度的雙鏈RNA，3』末端有2個懸浮的鹼基突出，其中的負鏈與靶向的mRNA序列互補。敲低這些基因中的一個或多個的表達，對阻斷血管新生通路抑制NV有重要作用，可減輕基質角膜炎的症狀。同樣的方法也適用於NV相關的其他眼部疾病。
過量而有害的眼部血管增生是一個複雜的過程，通常涉及多個生化信號通路，因此，幹擾一個靶點或一條通路還不足以完全控制疾病的病理學(血管增生)。本發明提供的是聯合幹擾方式，即同時幹擾一條生化信號通路的多個靶標，或者幹擾多個信號通路，或者兩種方式同時採用(幹擾多個信號通路，每個信號通路的多個靶標)。例如，本發明提供了幹擾VEGF通路的多個靶標，包括聯合VEGF-A和VEGFR-2的小核酸，甚至更進一步提出了幹擾包括VEGF信號通路的多個信號通路。本發明也提供了這些聯合的組合治療方式，例如 VEGF通路和TGF-b通路的小核酸的聯合。這種聯合具有抗血管新生和抗疤痕形成的效果， 疤痕是糖尿病視網膜病變病人的常見問題，因為抗血管新生治療引起的傷疤常常導致視覺損害，而外科手術去除這些傷疤非常麻煩還不一定有效。
截至目前，沒有報導過用於將RNAi製劑導入眼血管增生部位的合適的技術，包括我們在本發明中採用的HKP也沒有報導過。因此，對能夠用作RNAi製劑導入眼部血管增生部位的專有核酸導入系統存在巨大需求。對RNAi機制的理解及其快速擴展的應用是過去十年生物醫藥領域一項最主要的突破。使用小核酸幹擾特定基因的表達需要將小核酸送至靶位點，但正是因為缺少有效的將小核酸運輸至眼部NV疾病部位的載體系統而限制了小核酸的應用。隨著小核酸作為基因功能研究工具的高速發展，越來越多的研究將小核酸作為一種新的治療方式。時至今日，已經有二十多個小核酸藥物正在進行臨床評估。但將小核酸作為治療藥物依賴於有效的局部和系統導入方法。小核酸作為治療藥物的優勢是具有特異性、穩定性、高效性等特點，作用機理也是天然的，還有因為靶向不同基因的小核酸都是核苷酸序列而具有化學性質的均一性。
我們採用一種基於多肽的組氨酸-賴氨酸聚合物(HKP)作為體內外導入小核酸的載體。這一技術(參見專利WO 0147496，內容以引文的方式併入本發明中)能夠大幅降低小鼠中CpG和單純皰疹病毒感染引起的角膜血管增生及缺氧引起的視網膜血管增生。為評估眼部組織分布情況，採用了大白耳兔模型。我們在小核酸設計及其實驗的成功顯示了 RNAi 方法在治療如糖尿病黃斑水腫、老年黃斑病變、單純皰疹性基質角膜炎和其他血管新生疾病等糖尿病視網膜病變上具有很好的療效。
除了採用HKP作為藥物載體外，本發明還能採用其他陽離子多肽。一類多肽是第五個胺基酸殘基連接有組氨酸或咪唑單體的多聚線性賴氨酸。另一類多肽是分枝狀的多聚賴氨酸和第五個胺基酸殘基連接有組氨酸或咪唑單體的多聚分枝狀賴氨酸。還有一類多肽是含組氨酸-組氨酸-賴氨酸(HHK)三肽或組氨酸-組氨酸-賴氨酸-賴氨酸(HHKK)四肽的聚合物，聚合物可以是線狀或分枝狀，分枝狀聚合物的單體可以與另一個單體的第一個或第五個氨基結合，或者同時與兩個氨基結合。優選那些30%-70%賴氨酸單體的伯胺基上結合有組氨酸或咪唑的多聚賴氨酸。多聚賴氨酸聚合物優選分子量在5000-100000，更優選分子量為10000-30000。帶2-10倍的過量正電荷的多肽，能與帶負電的核苷酸治療製劑自動形成複合物。
在藥物載體中，一類接枝聚合物是連接有親水性聚合物的多肽，親水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚卩惡唑啉(polyoxazoline)、聚縮醒(polyacetal,某些情形下也稱為柔性水泥Fleximer)、甲基丙烯酸輕基丙基酯(HPMA)和聚丙三醇(polyglycero l)。另一類接枝聚合物是連接的親水性聚合物上還含有配體的接枝聚合物，配體包括多肽、糖類、維生素、營養素和抗體，或者這些物質的組分。帶2-10倍的過量正電荷的陽離子接枝聚合物能自動與帶負電的核苷酸治療製劑形成複合物，優選攜帶2-6倍正電荷的接枝聚合物。
藥物載體中的非天然的合成的陽離子聚合物含有乙烯亞氨基(-C-C-N-)，包括聚 [I惡唑啉(polyoxazoline)和聚乙烯亞胺(PEI)。線性或分枝狀聚卩惡唑啉或PEI含衍生的組氨酸或咪唑單體，優選連接的組氨酸或咪唑單體中30%_70%的殘基(basic moiety)是咪唑的聚合物，優選分子量在5000-100000的聚合物，更優選分子量為10000-30000的聚合物。 帶2-10倍的過量正電荷的陽離子非天然合成聚合物和帶負電的核苷酸治療製劑能自動形成複合物，優選攜帶2-6倍正電荷的非天然合成聚合物。
藥物載體中還包括含有聚縮醛骨架結構的陽離子聚合物，線性聚縮醛、分枝狀聚縮醛均含衍生殘基，殘基包括賴氨酸、伯胺基、組氨酸和咪唑單體的混合物。優選連接的賴氨酸、伯胺基、組氨酸和咪唑單體中30%-70%的殘基是咪唑的聚合物，優選分子量在 5000-100000的聚合物，更優選分子量為10000-30000的聚合物。帶2_10倍的過量正電荷的陽離子聚縮醛和帶負電的核苷酸治療製劑能自動形成複合物，優選攜帶2-6倍正電荷的聚縮醛。
藥物載體中的陽離子膠團是嵌段聚合物，一段是親水聚合物，另一段是疏水聚合物，包括聚環氧丙烯，疏水的聚噁唑啉，疏水聚合物衍生的伯胺基或咪唑或伯胺基和咪唑， 疏水聚合物衍生的殘基(該殘基與治療製劑形成可被酶切的連接鍵，如_■硫鍵的疏基)， Schiff鹼的醛基，酯中的酸或醇類。優選的，膠團是親水聚合物上連接有配體的嵌段聚合物，·體包括多肽、糖類、維生素、營養素和抗體，或者這些物質的組分。帶2-50倍的過量正電荷的陽離子膠團和帶負電的核苷酸治療製劑能自動形成複合物，優選攜帶4-20倍正電荷的膠團。
本發明提供的組合物，能夠製備成治療眼部疾病的藥物。該眼部疾病，包括增生性糖尿病視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、單純皰疹病毒性基質角膜炎、老年黃斑變性、葡萄膜炎、虹膜紅變、結膜炎、角膜炎、瞼緣炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑退化和視網膜病。該組合物的給藥位點為結膜下、玻璃體內或皮下組織，給藥方式為局部給藥或注射給藥。組合物中小核酸介導的抗血管新生效果作用於眼部組織和血管增生疾病組織，抑制那些誘導有害的眼部血管增生的多個因子和生化途徑。
為了評估新型開發的抗血管增生製劑用於治療眼部血管增生(NV)疾病的效果，可以利用已發表的臨床相關的動物模型，如通過氧誘導過量視網膜血管生成的動物模型，或者是利用雷射灼傷視網膜誘導血管新生的動物模型。臨床常用的角膜NV模型可以採用將前述的CpG植入角膜基質的微袋或者用HSV感染獲得，在這些模型中檢測新生血管被抑制的效果也非常容易。候選製劑的效果可以先通過體外細胞培養檢測，接著用臨床相關的疾病動物模型選擇。
本發明組合物中的小核酸製劑，包括雙鏈的RNA (dsRNA)寡聚核苷酸(可以有末端突出鹼基，也可以無末端突出鹼基，可以是粘性末端，也可以是平末端)、小的頸環結構的 RNA (shRNA)及DNA來源的RNA CddRNA)0小核酸是一種可用於敲低基因表達、以序列特異性方式毀壞mRNA的強有力工具，是一種快速持續地研究生物學功能的工具。小核酸製劑設計時，要保證核苷酸序列與靶基因的部分序列匹配(互補結合)，選定的小核酸序列可以與基因表達過程中的mRNA的任何部位匹配。小核酸包含的「反義鏈」序列能與靶基因的mRNA 雜交(互補結合)，同時還包含與反義鏈結合的「正義鏈」。選定的針對靶基因的小核酸序列不能與細胞內任何除靶基因外的mRNA序列同源(即不能與任何其他mRNA互補結合)，小核酸所針對的序列也不能是那種無法轉錄成mRNA的序列。目前有大量的設計原則用於篩選 20到27個鹼基對的靶向mRNA的小核酸序列，其中包含一些商業化的方法。這些設計方法不斷改善，使得最新的方法隨時可用。利用這些方法中可以設計出一系列首選的小核酸序列。本發明首先製備至少6種首選的小核酸序列，然後在培養的細胞中檢測基因被抑制的程度，一般都可以選出至少兩種活性的小核酸序列。如果沒有篩選到活性小核酸，則進行第二輪的設計和篩選。
除了鑑別活性的小核酸序列，設計過程中還要確保選定的小核酸只與靶標的mRNA 序列同源。與靶基因mRNA序列之外的基因組序列同源性低的小核酸序列能在mRNA水平或基因水平降低脫靶效應，小核酸中「正義鏈」與其他序列的同源性低也有利於減少脫靶效應。通過Clone Manager Suite軟體的DNA比對和在線的BLAST (序列比對)搜索分析， 選定基因的靶序列應該與包括人同源基因在內的任何其它基因缺少同源性。例如，與小鼠mVEGF-A的mRNA匹配的序列應該是獨特的只針對mVEGF-A的，而不能與其他mVEGF-B、 mVEGF-C、mVEGF-D匹配，也不能與人體中同源的hVEGF165_a(AF486837)相匹配。然而，匹配序列可以針對 mVEGF-A 的多個亞型(isoform)，例如 mVEGF (M95200)、mVEGF115 (U502791 )、 mVEGF-2 (S38100)和 mVEGF-A (NM_192823)，這些同形物分別編碼 190 個胺基酸(aa)、141 個aa、146個aa和148個aa的mVEGF-A。所有已發表的mVEGF-A亞型的cDNA序列，除了 mVEGF-A (NM_192823，成熟的蛋白形式)外，在N末端均有一個26個胺基酸(aa)的信號肽。 因此，靶向mVEGF的mRNA的小核酸序列不能選在信號肽區域，而應該選擇所有mVEGF-A亞型共有的編碼成熟蛋白的區域。靶向mVEGFR-2的小核酸序列也經過相同的方法確定。本發明包含不同形式的幹擾RNA分子，例如，根據抑制的規則設計的針對上述靶基因序列的小核酸序列是25個鹼基對的平末端寡聚核苷酸序列，參見表1-3。
製劑針對基因序列的特異性依賴於預期要靶向的機體(動物)種類。多數哺乳動物基因都含有大量的同源序列，使得RNAi製劑可以抑制多個物種的同源基因的表達。我們優先採用同源性的小核酸抑制劑，既可以抑制人基因的mRNA，也可以抑制實驗動物的mRNA。 用來檢測的動物模型是眼部患病動物，並且應該是經常用於藥效學和毒理學研究的動物， 如小鼠、兔或猴。
序列依賴性的脫靶效應至少需要17個核苷酸(nt)與其它非靶基因序列同源，對於25個鹼基對的小核酸來說，分別需要對8種17 nt的的核苷酸序列進行比對(Blast)，看是否存在序列依賴性的脫靶效應，並將這一信息作為最終選擇小核酸治療製劑中的小核酸藥物中間體(API)的一項重要參數。
我們儘量在小核酸候選藥物中排除那些能在體內外通過Toll樣受體(TLR)通路激活幹擾素反應的免疫刺激結構域(富含⑶的結構域，5』-UGUGU-3』或5』-GUCCUUCAA-3』)。 最終，我們描繪出每種小核酸針對的mRNA的靶向區域，這對於理解小核酸候選藥物是否能準確靶向靶標mRNA及其替代轉錄本非常重要。
本發明提供的組合物用於治療眼睛前部或者後部的血管增生疾病，眼部的任何組織都能通過新生血管靶向的導入製劑治療，本發明中的給藥方式包括局部給藥、眼睛局部給藥和末梢位點的靜脈注射給藥。本發明中，眼睛前部的治療，可以採用結膜下注射的局部給藥方式治療，或者眼睛局部給藥治療，或者眼周注射治療，或者眼內注射治療，或者末梢位點的靜脈注射治療。本發明的組合物包括I)通過靜電相互作用與核酸結合的陽離子製劑，包括非天然的合成的聚合物、接枝聚合物、嵌段共聚物、多肽、脂質體和膠團， 2)減少組織和細胞非特異性吸附的親水製劑，包括非天然的合成的聚合物、多肽和糖類，3)組織和細胞滲透劑，包括表面活性劑、多肽、非天然的合成的聚合物和糖類，4)磷硫醯 (Phosphorothioate)、硼燒憐酸酯(Boranophosphate)、甲基勝酸酯(Methylphosphonate) 和磷酸二酯(Phosphodiester)修飾的小核酸寡聚核苷酸。
本發明提供了成熟的將包括小核酸在內的治療製劑送至細胞和組織的導入載體， 該載體可以保護核酸免遭降解及促進組織和細胞對治療製劑的吸收。將RNAi或其他帶負電荷的製劑與本發明中的導入載體聯合，細胞能大量吸收治療製劑，內源靶基因的表達也被抑制。本發明使用局部給藥的方式，將小核酸和其它治療製劑導入眼部治療眼部疾病，包括基質感染、角膜血管新生、基質角膜炎和葡萄膜炎等。儘管局部給藥比系統給藥的擴散性強，也有因感染或刺激導致炎症的風險，局部導入給藥依然是臨床上優選的方式，例如，在治療嚴重血管增生(NV)或快速生長的腫瘤時都是如此。本發明也整合了增加組織吸附和通過角膜內皮的滲透性的製劑，這一組合製劑通過滴眼液的形式局部給藥。
本發明的組合物中，小核酸或其他治療製劑可以通過局部給藥、局部注射或靜脈注射(1. V.)給藥來治療眼部血管增生疾病。
圖1顯示了 25個鹼基對的平末端小核酸與21個鹼基對粘末端小核酸對VEGF基因抑制的效果比較。(A)首先分別從6條小核酸中擇最有效的21和25個鹼基對的小核酸， 然後利用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen, CA)體外轉染表達人VEGF的兩株細胞系 (DLD-1結腸癌細胞和MBA-MD-435乳腺癌細胞)，RT-PCR技術檢測。O. 3yg或2. Oyg劑量下，25個鹼基對小核酸比21個鹼基對小核酸表現出更強的抑制活性，特別是2. 0μ g劑量差別更明顯。(B)在MCF-7/VEGF165細胞中比較25個鹼基對的平末端小核酸與21個鹼基對粘末端小核酸抑制基因表達的效果。轉染後5天檢測VEGF的表達水平，25個鹼基對的平末端小核酸確實比21個鹼基對的粘末端小核酸更有效。
圖2為選擇靶向VEGF的最有效的小核酸。八條針對VEGF的25鹼基對的小核酸及對照小核酸轉染人293細胞和小鼠F3細胞，分別用小核酸轉染相應的細胞，設置標準基因標靶對照，接著進行Q -RT-PCR分析。體外研究表明選定的最有效的小核酸(hmVEGFc)具有高效敲低人和小鼠細胞中靶基因的巨大活性。
圖3為鑑別靶向VEGFR-2的最有效的小核酸。用Invitrogen公司的基於網頁的小核酸設計工具BLOCK-1T RNAi Designer來設計25個鹼基對的平末端小核酸。基於交互式的算法，用戶可以選擇系統設定參數或用戶自定義參數來選擇小核酸序列。將靶標mRNA 序列或靶標基因在基因庫(GenBank)中的編號輸入程序中，每個靶基因mRNA能夠得到10 條以上一星級到五星級的25鹼基對的小核酸候選序列。星級越高的候選小核酸,理論上敲低革El基因的效果更好。通過BLOCK-1T RNAi Designer或我們自己的算法,我們選擇了八條 25個鹼基對的平末端小核酸。接著，將這些小核酸轉染小鼠SVR細胞後進行Q-RT-PCR分析 (A)，或者轉染人HUVEC細胞後進行ELISA分析(B)。通過電轉方式將八條VEGFR-2的小核酸及對照的針對綠色螢光蛋白的25鹼基對的Luc-小核酸(7 μ g小核酸/I ' IO6個細胞) 轉進細胞。轉染後48小時，收集HUVEC細胞開展hVEGFR-2的ELISA實驗，檢測細胞裂解液中VEGFR-2的濃度(每孔加入的裂解蛋白量為3 mg)。數據均以「平均值土標準差」(Mean 土 STD)的方式列出。ELISA方法選定的有效的25個鹼基對的小核酸將進一步用於後期的腫瘤動物模型研究。選定的VEGFR-2特異性的最有效的小核酸是VEGFR2-h。
圖4為設計和選擇靶向TGF- β I的最有效的小核酸。選擇25個鹼基對的平末端小核酸是基於其活性和效力的持久性，每種小核酸序列能靶向人和小鼠的同源基因。在用相應的細胞檢測這些小核酸(由Qiagen合成)之前，先簡單的用人PC-3細胞測試，因為該細胞能表達(預期要通過小核酸來敲低的)三個靶標基因(Α)，同時也在小鼠C166細胞中測定 TGF-β I的表達(B)。為篩選每個靶基因的八條小核酸，首先將小核酸轉染細胞，接著提取總RNA進行Q-RT-PCR分析，選擇抑制TGF- β I表達的最有效的小核酸。以持家基因核糖體蛋白S15 (rig/S15)擴增的361 bp的片段來校正樣品濃度，選定的hmTF25f序列如表3所/Jn ο
圖5顯示了用於小核酸導入的組氨酸-賴氨酸分枝狀聚合物。經過優化的分枝狀組氨酸-賴氨酸聚合物(HKP)已經被廣泛用於體外和體內導入小核酸,其中的H3K4b具有一個賴氨酸骨架結構，有四個包含重複的組氨酸和賴氨酸的分支結構。以N/P (氮磷比)質量比為4:1的比例，H3K4b用於小核酸的包裹。用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察自動形成的納米顆粒(平均直徑為150 nm)。
圖6顯示HKP-小核酸納米顆粒的表徵。採用90Plus Nanoparticle Size Distribution Analyser (納米顆粒粒徑分布分析儀,Brookheaven Instruments Limited, NY)檢測HKP-小核酸，結果表明製備的HKP-小核酸納米顆粒平均直徑是159. 9 nm CA), Zeta電位為38 (B)，這些結果與SEM分析的結果一致。
圖7顯示HKP包裹有利於促進結膜下小核酸的導入。在結膜下注射小鼠眼睛評估小核酸導入效率之前，FITC標記的小核酸與HKP自動形成納米顆粒。標記的小核酸經眼睛結膜下(SCJ)給藥後24小時能在角膜切片中觀察到(A)，而同樣給要的不含HKP的FITC標記SiClab信號微弱(B)。箭頭所指為FITC標記的小核酸的位置。
圖8顯示系統和局部導入的抗血管新生活性比較。給藥後第4天，比較HKP介導的靶向VEGF、VEGFRl和VEGFR2的小核酸雞尾酒的局部導入和不同的納米顆粒載體(配體導向聚合物，LDP)介導的系統導入效果。對照組、裸露的小核酸和包裹的小核酸均使用HKP或 LDP 檢測。N=6, * 表示 ρ〈0· 05, ** 表示 ρ〈0· 01。
圖9顯示玻璃體內注射後小核酸的分布。在兔眼部模型中通過玻璃體內注射H3標記的小核酸來評估小核酸的分布情況。注射後24小時和72小時，處死動物收集組織，解剖左眼收集房水、虹膜、玻璃體液、視網膜和鞏膜(包括脈絡膜)。用液體閃爍波譜分析每個樣品的放射性活性。注射裸露的小核酸(2 mg)和HKP-小核酸(250 μ8)，72小時後，HKP-小核酸組中水晶體和視網膜中小核酸的濃度明顯高於裸露小核酸組。
圖10顯示玻璃體內注射HKP-小核酸後的控釋和視網膜聚集。(A)注射後24小時和72小時，從所有組織樣品中回收小核酸，黃色為裸露的小核酸，藍色代表HKP-小核酸，兩個時間點後者的回收率都明顯高於前者。(B)視網膜中的小核酸的定量，紅色為裸露的小核酸，綠色代表HKP-小核酸，後者明顯更多聚集於視網膜內。
圖11顯示用小鼠ROP模型分析小核酸雞尾酒治療後FITC灌注的視網膜。缺氧誘導的眼部血管增生模型第17天後典型的FITC灌注視網膜。第I組為不接受治療組，第2 組為玻璃體內注射的HKP-小核酸_tMl對照組，第4組為結膜下注射的HKP-小核酸_tMl 對照組，第5組為正常對照組，第6組為玻璃體內注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，第8組為結膜下注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，其中第6組通過視網膜分離觀察可以看到明顯的抗新血管生成作用。
圖12顯示用小鼠ROP模型分析比較小核酸雞尾酒治療後的典型的組織切片。缺氧誘導的眼部血管增生模型第17天後典型的組織切片圖。第I組為不接受治療組，第2組為玻璃體內注射的HKP-小核酸_tMl對照組，第4組為結膜下注射的HKP-小核酸_tMl對照組，第5組為正常對照組，第6組為玻璃體內注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，第8組為結膜下注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，其中第6組的切片血管染色更少，表明具有更好的抗新血管生成的治療效果。
圖13顯示mRNA水平的靶基因敲低。HKP包裹的小核酸雞尾酒通過玻璃體內注射缺氧誘導的眼部血管增生模型，通過Q-RT-PCR檢測每個靶基因的mRNA水平。從結果可以看出，使用相應小核酸處理後的VEGF和VEGFR2的mRNA水平明顯低於對照組。
圖14顯示蛋白水平的靶基因敲低。HKP包裹的小核酸雞尾酒通過玻璃體內注射到缺氧誘導的眼部血管增生模型，通過ELISA檢測每個靶基因的蛋白水平。從結果可以看出， 使用相應小核酸處理後的VEGF和VEGFR2的蛋白水平明顯低於對照組。
圖15顯示HKP介導的TGF- β I小核酸導入導致快速的傷口癒合。HKP-TGF- β I 小核酸治療組傷口癒合速率明顯提高，快速的傷口癒合是靶標基因的沉默所致。
圖16顯示HKP-TGF-β I小核酸治療後疤痕形成更少。組織學分析表明，與不治療的傷口皮膚相比，HKP-TGF-β I小核酸治療後的傷口表皮結構與正常皮膚結構十分接近。 箭頭所指為皮膚傷口區域的疤痕大小。
圖17顯示用於小核酸導入的第一代納米顆粒。我們已經開發和獲得了一系列用於促進小核酸導入的臨床可用納米顆粒材料，並取名為Snano系列載體。Snano-1是基於 HKP的系統，Snano-2是樹枝狀大分子(Dendrimer)系統，Snano-3是基於聚(乳酸-輕基乙酸)共聚物PLGA的系統，Snano-4是小分子量的聚乙二醇-聚乙醯亞胺(PEG-PEI)共聚物， Snano-5是陽離子脂質體S-DOTAP, Snano-6是基於亞精胺(spermidine)的系統。
圖18顯示小核酸寡聚體的化學修飾。為了提高小核酸的穩定性，儘量降低其副作用(如脫靶效應)，採用了如圖中所示的各種化學修飾硫磷醯、硼烷、甲基膦酸酯、磷酸二酯。修飾位置可以是2-0-甲基化或2-0-甲氧乙烷基(2-0-M0E)，這些修飾的結構如圖所/Jn ο
圖19為新藥臨床試驗申請(IND)的設計與流程。我們已經針對HKP-小核酸製劑治療眼部疾病設計了流程 圖，包括新藥臨床試驗申請所需的主要任務和流程。三個方面的任務包括(DHKP-小核酸的劑型工藝確認；(2)藥理學和毒理學研究；(3)活性藥物中間體(API)和輔料的化學、製備與控制(CMC)。
具體實施方式
具體實施例1 :25個鹼基對長度的小核酸比21個鹼基對的小核酸效果更好儘管最初的研究主要是利用化學合成的19和21個鹼基對的小核酸雙鏈，但有證據表明23、25、27個鹼基對的小核酸雙鏈都比19和21個鹼基對的寡核苷酸雙鍊表現出了更好的抑制活性。更長的小核酸(23個鹼基對或更長)所具有的潛在激活幹擾素效應是一種依賴於細胞類型的現象。我們發現，在MBA-MD-435或DLD-1細胞系及攜帶腫瘤的動物模型中， 25個鹼基對的帶有平末端的小核酸雙鏈具有最好的抑制效果。我們針對人VEGF基因為靶標的25個鹼基對的小核酸hVEGF-25c (正義鏈鏈5』 -UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG-3』)進行了檢測，並與已被測試過很多次的、被認為最有效的 21 個鹼基對的 VEGF 序列 hVEGF-21a (正義鏈5』 -UCGAGACCCUGGUGGACAUTT-3』 ；反義鏈5』 -AUGUCCACCAGG⑶CUCGATT-3』 )進行了比較，前者顯示比後者更強的抑制效果。在培養細胞模型中，用Q-RT-PCR技術(圖1A)檢測顯示25個鹼基對的帶有平末端的小核酸雙鏈比21個鹼基對粘末端小核酸更有效。而ELISA分析蛋白表達水平(圖1B)也表明，兩種長度的小核酸對VEGF表達抑制具有顯著的差異。
具體實施例2 :詵擇特異件針對人和小鼠VEGF mRNA的小核酸依據專有的以計算機為基礎的算法，我們針對VEGF設計了小核酸(表1)，它們具有如下特徵a.最佳熱力學特徵；b.增強與RISC的結合能力；c.消除免疫激活結構域；d. 具有人鼠同源性；e.通過已有智慧財產權搜索序列；f.使用blast儘量避免「脫靶效應」;g. 能作為小核酸雞尾酒藥物。通過Q-RT-PCR (MyiQ，Bio-Rad)檢測選擇針對每個基因的最有效的小核酸。用於體外細胞培養研究的25個鹼基對小核酸由Qiagen (Germantown,MD)合成，更大量的用於動物疾病模型體內研究的小核酸由Dharmacon (Bolder, CO)合成。用於篩選最有效小核酸的細胞系應該是能夠表達靶基因的細胞系，例如，人293細胞和小鼠F3 細胞用於選擇VEGF特異性的小核酸(圖2)。經過試驗，選擇了靶向VEGF的最有效小核酸， 即 hmVEGFc (正義鏈5』 -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3』 )作為活性藥物中間體(API)用於VEGF基因的沉默。
具體實施例3 :詵擇特異件針對人和小鼠VEGFR-2 mRNA的小核酸依據專有的電子計算機為基礎的算法，我們針對VEGFR-2設計了小核酸(表2)，它們具有如下特徵a.最佳熱力學特徵；b.增強與RISC的結合能力；c.消除免疫激活結構域；d.具有人鼠同源性；e.通過已有智慧財產權搜索序列；f.使用blast儘量避免「脫靶效應」;g.能作為小核酸雞尾酒藥物。通過Q-RT-PCR (MyiQ，Bio-Rad)檢測選擇針對每個基因的最有效的小核酸。用於體外細胞培養研究的25個鹼基對小核酸由Qiagen(Germantown, MD)合成,更大量的用於動物疾病模型體內研究的小核酸由Dharmacon (Bolder, CO)合成。 用於篩選最有效小核酸的細胞系應該是能夠表達靶基因的細胞系，小鼠SVR細胞轉染小核酸後，提取總RNA進行Q-RT-PCR分析(圖3A)，人HUVEC細胞轉染小核酸後，分離蛋白進行酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)(圖3B)。經過試驗，選擇了靶向VEGFR-2的最有效小核酸，SP hmVR2h (正義鏈5 』 -GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3 』)作為活性藥物中間體(API)用於 VEGFR-2基因的沉默。
具體實施例4 :詵擇特異件針對人和小鼠TGF- β I mRNA的小核酸依據專有的電子計算機為基礎的算法，我們針對TGF-β I設計了小核酸(表3)，它們具有如下特徵a.最佳熱力學特徵；b.增強與RISC的結合能力；c.消除免疫激活結構域；d.具有人鼠同源性；e.通過已有智慧財產權搜索序列；f.使用blast儘量避免「脫靶效應」;g.能作為小核酸雞尾酒藥物。通過Q-RT-PCR(MyiQ，Bio-Rad)檢測選擇針對每個基因的最有效的小核酸。用於體外細胞培養研究的25個鹼基對小核酸由Qiagen(Germantown, MD)合成,更大量的用於動物疾病模型體內研究的小核酸由Dharmacon (Bolder, CO)合成。 用於篩選最有效小核酸的細胞系應該是能夠表達靶基因的細胞系，例如，人PC3細胞(圖 4A-B)和小鼠C166細胞(圖4B)用於選擇TGF-β I特異性的小核酸。經過試驗，選擇了靶向 TGF-β I 的最有效小核酸，即 hmVEGFc (正義鏈5』 -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3』)作為活性藥物中間體(API)用於TGF-β I基因的沉默。
具體實施例5 :詵擇小核酸組合物作為候詵藥物為了充分利用本發明中新型的聯合兩種小核酸或三種小核酸的藥物製劑模式，提高小核酸治療的效果，我們制定了如下的組合藥物(I)組合 I VEGF-VEGFR-2 小核酸VEGF 特異性的小核酸 hmVEGFc :5』 -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3』(正義鏈)與VEGFR-2 特異性的小核酸 hmVR2h :5』-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3』(正義鏈)組合的雙靶標小核酸作為活性藥物中間體(API)。
(2)組合 2 :VEGF-TGF-β I 小核酸VEGF 特異性的小核酸 hmVEGFc :5』 -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3』(正義鏈)與 TGF-β I 特異性的小核酸 hmTF25f :5』 -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3』(正義鏈)組合的雙靶標小核酸作為活性藥物中間體(API)。
(3)組合 3 VEGF-VEGFR-2-TGF-^ I 小核酸VEGF 特異性的小核酸 hmVEGFc :5』 -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3』(正義鏈)、 VEGFR-2 特異性的小核酸 hmVR2h :5』-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA_3』(正義鏈)與 TGF-β I 特異性的小核酸hmTF25f :5』 -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3』(正義鏈)組合的三靶標小核酸作為活性藥物中間體(API)。
具體實施例6 HKP~小核酸能自動形成納米顆粒經過優化的分枝狀組氨酸-賴氨酸聚合物(HKP)已經被廣泛用於體外和體內導入小核酸，其中兩種HK聚合物，H3K4b和H3K (+H) 4b，具有一個賴氨酸骨架結構，有四個包含重複的組氨酸、賴氨酸和天冬醯胺的分支。當這種HKP水溶液與小核酸以N/P (氮磷比)質量比為 4 :1混合時,將自動組裝形成平均直徑為100-200 nm的納米顆粒(圖5)。在Ranin Voyager 合成器上(PTI，Tucson，AZ)合成具有理想分支的組 氨酸-賴氨酸聚合物HKP。研究中使用的兩類HKP粒子為具有(R)K(R) -K(R) -(R)K(X)結構的H3K4b和PT73，其中H3K4b粒子中 R=KHHHKHHHKHHHKHHHK，而 PT73 粒子的 R= KHHHKHHHNHHHNHHHN, X=C (0)NH2, K=賴氨酸，H= 組氨酸，N=天冬醯胺。HKP水溶液與小核酸水溶液以4 1質量比進行混合，形成平均直徑為150-200nm的粒子。HKP-小核酸水溶液為半透明的，具有明顯的沉澱聚集現象，並且可以在4 °C的條件下儲存至少三個月。測定表徵後的HKP-小核酸納米顆粒的直徑和Zeta電位 (圖6)，我們同時使用H3K4b和H3K(+H)4來對眼部和其它組織實施高效的小核酸導入。
具體實施例7 =HKP-小核酸能增強小鼠眼部小核酸的局部導入角膜血管新生模型此模型通過純化的HSV DNA (富含CpG)和/或合成的CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)誘導小鼠角膜表達VEGF，此模型具有典型的炎症誘導型血管新生和淋巴管新生症狀，這與臨床常見的角膜血管新生相似。隨時誘導並檢測新血管的形成，監測新生血管區域和HSK疾病評分是評估小核酸的抗眼睛前部的血管新生的活性最有效的方法。本發明用這一方法檢測幹擾RNA，並收集RNAi治療CpG誘導的基質角膜炎(SK)的數據，提供定量數據，製造與人體HSV感染引起的SK相似的環境。
將CpG-ODN植入小鼠得到單純皰疹性基質角膜炎模型，這是與臨床角膜血管增生相似的模型，具有典型的炎症誘導的血管新生和淋巴管新生的特徵。為了在CpG-ODN誘導的角膜炎症模型中評估HKP納米顆粒導入小核酸的效果，通過結膜下注射(SCJ)FITC (異硫氰酸螢光素)標記的小核酸，給藥24小時後觀察角膜切片的血管新生情況。觀察處理各組的組織切片，HKP-FITC標記的小核酸主要聚集在角膜組織，而同樣給藥的不含HKP的處理組信號十分微弱(圖7)。這些結果是HKP有利於通過結膜下給藥促進小核酸導入角膜的直接證據，大量的HKP-小核酸停留在注射位點，HKP-小核酸導入其它類型的組織也觀察到了同樣的現象。
具體實施例8 :小核酸雞尾酒顯示較強的抗新生血管活性將CpG-ODN植入小鼠和HSV感染得到單純皰疹性基質角膜炎的方法如前所述，這是與臨床角膜血管增生相似的模型，具有典型的炎症誘導的血管新生和淋巴管新生的特徵。測定新生血管區域面積和HSK疾病評分是評估小核酸的抗眼睛前部的血管新生的活性最有效的方法。我們發現，分別敲低VEGF、VEGFRl和VEGFR2具有類似的抗血管新生作用，而將三種小核酸聯合起來同時敲低三個基因具有更強的抗血管新生活性。我們的研究發現，在 CpG誘導的血管新生模型中HKP-小核酸雞尾酒比裸露的小核酸雞尾酒更有效果(圖8)。
具體實施例9 :玻璃體內注射HKP-小核酸劑型導入兔子眼部大耳白兔模型這一模型用於小核酸玻璃體內注射後的組織分布研究。給藥前，肌肉注射氯胺酮(ketamine)和賽拉嗪(xylazine)的混合鎮靜劑。接著用O. 9%的注射用氯化鈉(美國藥典，Baxter)配製的1:10000的苯扎氯銨溶液/殺藻胺50% NF (Spectrum Lab Products, Inc.，New Brunswick, NJ)溶液(相當於0.1 mg/mL)衝洗結膜。對每隻眼睛進行局部麻醉(Alcain，0. 5%)，每次注射都用新的胰島素注射器(含預裝好的針頭)。兩隻眼睛每次給藥的溶液體積是50 μ I/眼，用雙目間接檢眼鏡確認針頭位置。分離左眼收集房水、 虹膜、玻璃體液、視網膜和鞏膜(包括脈絡膜)。
3標記的小核酸用於兔子(大耳白兔)的給藥，O. 5 mg的H3標記的小核酸以50 μ I 體積注射每隻眼睛，雙目間接檢眼鏡確認注射位置。治療後眼科醫師迅速檢測眼睛(間接檢眼鏡和裂隙燈檢查)，記錄任何可能有劑量流程引起的異常情況。檢查後，用硫酸慶大黴素滴眼液處理每隻眼睛，如果眼科醫師認為需要，則進一步用眼部潤滑劑淚然點眼液(Tears Naturale , Alcon，Fort Worth, TX)處理。在預定的時間節點(注射後24小時和72小時) 通過注身寸 Euthanyl (Bimeda-MTC Animal Health Inc. , Cambridge, Ontario, Canada,劑量約為200 mg/kg)對動物實施安樂死,每個時間節點處死四隻動物,收集組織樣品,完整摘除八隻眼睛。解剖左眼收集房水、虹膜、玻璃體液、視網膜和鞏膜(包括脈絡膜)。所有樣品儲存於-80 °C。
放射性活性檢測記錄所有八個組織樣品，將樣品溶於四乙基氫氧化銨(TEAH) 中，溶解的樣品，或者取其中 一半，與液相閃爍溶液混合後，採用液體閃爍波譜分析檢測放射活性。每份樣品檢測5分鐘,任一樣品都首先觀察到了 0. 1%的偏差(two-sigma error)。 通過基於外部標準的自動淬滅校正，將所有計數轉化為絕對的放射性活性(dpm)。將放射性活性小於或等於2倍背景值的樣品定義為零，所有放射性檢測都輸入標準的電腦資料庫程序(Debra Version 5. 2),計算放射性物質的濃度(dpm/g和質量單位eq/g)和每個樣品中放射性活性。放射性樣品活性首先表示為dpm/g，接著根據測定的給藥溶液中放射標記物的特定活性(dpm/mg或合適的質量單位)將其轉化為質量eq/g (假定小核酸保持完整)。根據組織的總重量計算總組織含量。用SAS Version 8.1統計軟體估測非房室藥代動力學參數等眼部數據，包括濃度時間曲線下面積(AUC)、終末半衰期(tl/2el)、終末速度常數(kel)、 血藥峰濃度(Cmax)和達峰時間(Tmax)。其中Cmax根據檢驗數據獲得,用梯形法計算AUC， 在濃度時間曲線末期選擇時間點進行線性回歸分析計算kel。終末半衰期(tl/2el)的計算為tl/2el=ln2/kel。對於偏離超過10%的時間偏差，以實際的時間點來計算參數。圖9顯示了每個樣品在小核酸給藥後24小時和72小時的放射性活性。很明顯，儘管裸露小核酸注射量(2mg/眼)顯著高於HKP-小核酸(250μ8/眼)，給藥後72小時，HKP-小核酸組的小核酸回收量顯著高於裸露小核酸組。
具體實施例10 :HKP-小核酸納米顆粒增強小核酸的視網膜導入從H3標記的小核酸兔眼部樣品發現，HKP-小核酸納米顆粒比裸露的小核酸更穩定，不但HKP-小核酸的總回收率遠遠高於裸露的小核酸，H3標記的HKP-小核酸在視網膜中的絕對數量也明顯高於H3標記的裸露的小核酸。這些結果表明玻璃體內注射HKP-小核酸能夠提高小核酸的穩定性，使小核酸停留在視網膜組織中並富集(圖10)。注射後的第一天和第三天，小核酸在眼內的組織分布顯著不同注射第I天小核酸主要集中於玻璃體內，第3天轉移到水晶體和視網膜內。而用HKP包裹小核酸後，轉移到水晶體和視網膜內的小核酸更明顯。因此，我們推斷HKP-小核酸納米顆粒通過一種暫時未知的作用機制靶向進入視網膜，非常有利於眼部疾病的治療。
具體實施例11 :在缺氧i秀導的視網膜病變模型中觀察治療效果缺氧誘導的視網膜病變(OIR)模型這一模型具有典型的病理性缺血和退行性的視網膜NV特性，如增生性糖尿病視網膜病變和老年黃斑變性。通過螢光標記的葡聚糖的心肌血流灌注檢測血管新生區域，接著採用視網膜分離，凍幹切片，檢測mRNA和蛋白表達水平等來評估抗眼睛後部的血管新生活性。
缺氧誘導的視網膜病變(OIR) C57BL/6小鼠模型購自廣州中醫藥大學廣州醫學院實驗動物中心。簡單地說，出生後第7天到第12天，高氧環境下(75% + 2氧氣)飼養新生小動物，然後轉入室內空氣(正常氧氣濃度)，然後用通過不同途徑導入的HKP-小核酸納米顆粒處理。通過螢光素灌注/視網膜分離、組織切片染色評估OIR眼部血管增生模型，通過 RT-PCR分析mRNA水平，ELISA檢測蛋白含量。所有實驗遵循中國的實驗動物資源保護委員會、生命科學委員會和國家研究委員會的指導原則。
由於缺氧誘導的血管新生模型代表了一種缺血性和退行性脈絡膜血管增生(CNV) 症狀，我 們用這一模型同時檢測局部(玻璃體內注射)和系統(腹腔注射)給藥HKP-小核酸納米顆粒劑型的情況，以探索對早產兒視網膜病和老年黃斑變性的治療效果。結膜下和玻璃體內注射作為HKP-小核酸雞尾酒劑型的局部給藥途徑，而因為幼小動物尾靜脈注射的劑量受到限制，故系統給藥途徑則從靜脈注射調整為腹腔注射。所有三種給藥途徑都以兩種方案給藥方案A :在出生後第12天和第13天分別給藥兩次；方案B :在第12天、第14天和第16天分別給藥三次。在第17天收集樣品，接著用螢光素標記的葡聚糖進行心肌血流灌注。比較分離的視網膜，發現方案A和方案B的玻璃體內注射和腹腔注射給藥效果均很好，能減少50%的血管新生(圖11)。
具體實施例12 :通過HIR樽型的超薄組織切片樣品觀察療效上述缺氧誘導的視網膜病變(HIR) C57BL/6小鼠，在第17天摘除眼球並冷凍於合適溫度的包埋化合物(Miles Diagnostics, PA，USA)中用於組織切片分析，眼部冰凍切片(10 Mm)用生物素化的牛血清白蛋白(BSA)進行組織化學染色。將切片放入乙醇/雙氧水在 4°C放置10分鐘，用O. 05 M、pH為7. 6的Tris鹽緩衝液(TBS)清洗，接著在10%的正常牛血清中孵育30分鐘。切片孵育在生物素標記的BSA中，接著加入親和素(Avidin)標記的鹼性磷酸酶(Vector Laboratories)和3，3』- 二氨基聯苯胺(DAB),然後用伊紅復染,並用 Cytoseal封片。為了進行定量評估，用顯微鏡觀察15份BSA染色組織切片，並用數位相機拍照。用 Image-Pro Plus 軟體(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)描繪視網膜表面的BSA染色的細胞，並測定區域面積。局部導入實驗中，每隻眼的檢測作為單一實驗值；系統導入中，兩隻眼睛檢測的平均值作為單一實驗值。
經組織切片分析，檢測內界膜(ILM)前部的BSA陽性細胞，從組織學上評估視網膜血管增生情況。兩種給藥方案中，玻璃體內注射和腹腔注射給藥的樣品都取得了明顯的減少血管新生的效果(圖12)。這一有趣的現象從另一方面證實了腹腔注射HKP-小核酸雞尾酒，確實能夠通過血液循環到達視網膜，而結膜下注射導入HKP-小核酸雞尾酒不能有效穿過血視網膜屏障(BRB)而不能有效到達脈絡膜血管新生部位。
具體實施例13 :在mRNA水平證明RNAi作用機制有報導稱，有些小核酸會通過TLR3途徑引起序列和靶標非依賴性的血管新生抑制， 然而我們在小鼠血管新生模型中，使用納米顆粒增強的小核酸導入，用mRNA特異性PCR (RS-PCR)和逆轉錄PCR (RT-PCR)檢測，並未觀察到這類現象。用RNAwiz (Ambion, #9736) 抽提細胞中的總RNA,在第14天和17天處死的小鼠用TRIzo試劑(Invitrogen, USA)提取總RNA。細胞質RNA樣品用前述的mRNA特異性PCR (RS-PCR)檢測。每種mRNA的引物包含一個47個核苷酸的用於逆轉錄反應(RTP)的引物、一個5』端基因特異性引物(GP)和一個3 』端通用引物(5 』 -GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA-3 』 )。每個基因擴增所用引物如下 mVEGF : (RTP) 5』 -GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg-3』，(GP)5』 -GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG-3,mVEGFR2 : (RTP) 5，-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATaggtcactgacagaggcg-3，，(GP)5』 -GGCGCTGCTAGCTGT CGCTCTGTG GTTCTG-3』，字母小寫代表的序列為逆轉錄靶標特異性的序列。同時，通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)和β -肌動蛋白(β -actin)來定量mRNA樣品的含量，所有PCR產物用凝膠電泳進行定量分析。
小鼠眼部血管增生模型切實地表明，通過局部或系統給藥，HKP-小核酸雞尾酒具有顯著的抗血管新生效果，接著我們也探討這一抗血管新生效果是否為小核酸介導的基因沉默引起。首先是查看是否有mRNA水平的序列和靶標依賴性的基因沉默。用Q-RT-PCR分析HIR模型眼部組織的mRNA樣品，發現VEGF和VEGFR2的mRNA表達水平顯著降低(圖13)， 這是序列和靶標依賴性的，與局部或系統給藥無關。另一有趣發現時HIR眼睛中VEGF表達量非常高，而VEGFR2表達量正常。而且，內源性的VEGFR2的表達能夠通過納米顆粒-小核酸雞尾酒的作用在mRNA水平被抑制。
具體實施例14 :在蛋白水平證明RNAi作用機制我們也同時通過ELISA分析VEGF和VEGFR2在蛋白水平被敲低的程度。第14天和第17天處死小鼠收集視網膜，在細胞裂解液(哺乳動物細胞裂解試劑盒，Biotechnology Department Bio Basid Inc. , Canada)中勻眾化,上清經BCA試劑盒(申能博彩生物科技有限公司，中國)定量後進行ELISA分析。分別用針對VEGF和VEGFR2的鼠科Quantikine M 免疫試劑盒(R&D Systems Inc. , Minneapolis, MN)確定 VEGF 和 VEGFR2 的水平，每一組每個時間點分析6-12份樣品。
在小鼠眼部血管增生模型中觀察到局部或系統給藥的納米顆粒-simVmix (VEGF 小核酸和VEGFR2小核酸的混合)劑型的顯著的抗血管新生效果，接著我們也探討這一抗血管新生效果是否為小核酸介導的基因沉默引起。除了評估mRNA，我們也檢測蛋白水平的序列和靶標特異性基因沉默情況。通過對HIR小鼠模型的眼部組織蛋白樣品進行ELISA分析，發現靶標基因的蛋白表達水平顯著降低(圖14)，這是序列和靶標依賴性的，與局部給藥或系統給藥無關。兩種給藥方案中，在第14天和第17天兩個時間點分別檢測，表明HKP包裹的小核酸雞尾酒能有效抑制VEGF和VEGFR2的表達。在CpG誘導和單純皰疹病毒感染引起的小鼠血管增生模型中也觀察到了序列和靶標依賴性的基因沉默。在我們整個研究過程中，無論是靶向單個基因還是多個基因，是局部局部給藥還是系統給藥，是視網膜血管增生模型還是角膜血管新生模型，都沒有觀察到其它報導中所說的序列非依賴性的抗血管新生活性。
具體實施例15 :小鼠模型中TGF-β I小核酸導致的傷口無疤痕癒合使用Avastin或Lucentis拮抗劑藥物進行抗血管增生治療的缺點是視網膜組織會形成疤痕，這將嚴重影響藥物治療的效果，並導致視覺損害。為了在抗血管增生治療後的癒合過程中儘量減少疤痕形成，我們開發了用TGF-β I小核酸抑制促炎症因子的方法。我們已經證明，將TGF-β I小核酸用於小鼠表皮切割傷口模型治療時，能有效促進傷口癒合並減少疤痕形成。靶向TGF-βΙ的HKP-小核酸，以甲基纖維素為輔料用於皮膚切割傷口的治療，與HKP-對照小核酸治療組和不含小核酸的HKP對照組相比，能明顯快速促進傷口癒合(圖15)。取治療組和非治療組的皮膚樣品進行三色染色 (Trichrome staining)和組織學分析,進一步證實了促進傷口癒合的作用(圖16)。與非治療組相比，HKP-TGF-β I小核酸治療後的組織結構更接近正常皮膚組織。基於大量文獻報導和上述的實驗證據，我們提出聯合靶向血管新生信號途徑的VEGF和VEGFR2 及TGF-β I信號途徑的多個小核酸來治療，這是一種全新的治療眼部血管增生疾病的方式。我們期望這樣的治療方式還包括HKP包裹的VEGF-TGF-β I小核酸組合VEGF 特異性小核酸 hmVEGFc :5』 -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3』(正義鏈)與 hmTF25f 5』 -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3』(正義鏈)聯合的雙靶標小核酸作為活性藥物中間體 (API )，這不但能減少新生血管發生，還能使疤痕最小化，進而保護和促進病人視力。
具體實施例16 :用於眼部小核酸治療的第一代納米顆粒在核酸藥物開發過程中，有多種不同的多肽、聚合物、脂質體和其它材料可用作小核酸的導入載體。我們將能夠與小核酸通過靜電相互作用自動形成納米顆粒的陽離子聚合物或脂質體稱為第一代小核酸導入載體(圖17)。
即為Snano-1，是典型的第一代小核酸導入載體，帶正電荷的分枝狀組氨酸-賴氨酸多肽和帶負電荷的小核酸能夠形成非常均一的納米顆粒，實現高效的體內導入。
聚乙二胺樹枝狀聚合物(PAMAM)，Snano_2，是一種定性清楚的高分枝的合成大分子，具有良好的生物相容性和非免疫原性，成為為各種治療製劑、成像製劑和小核酸這樣的寡聚核苷酸的獨特導入系統。G5 PAMAM樹枝狀聚合物在我們的小核酸的體內外導入中非常有用。
是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其它們的聚合物(PLGA)，因為其生物相容性和生物可降解性而引起極大關注。這類材料已經成為一些如抗癌製劑、抗高血壓藥物、免疫調節劑、激素等藥物和一些如核酸、蛋白、多肽、抗體等大分子的潛在載體。隨著傳統方法的進步，選擇性也更多，一些新的用於裝在藥物的納米顆粒的製備技術也獲得開發和完善。我們已經建立了製備直徑約200 nm的PLGA-小核酸納米顆粒的方法，實現了高效的小核酸體內導入。
是聚乙二醇-聚乙醯亞胺(PEG-PEI)共聚物納米顆粒，已經被用於體內運輸核苷酸和寡聚多肽。小分子量的PEI帶有正電荷，這是能與帶負電的小核酸形成納米顆粒的關鍵，小核酸中和了納米顆粒的正電荷，有利於降低毒性，因為體內導入後過量的正電荷會導致凝集和非特異性吸附。聚乙二醇化後能進一步提升PEG-PEI納米顆粒在血液中的循環時間。
使用DOTAP鏡像異構體(enantiomer)來導入包括小核酸在內的核酸具有不同的效果，我們發現用S-DOTAP (兩種DOTAP鏡像異構體的一種)，更有利於小核酸在體外的轉染和在體內(呼吸道追蹤)的導入。因此，我們設計用S-DOTAP作為Snano-5來將小核酸導入眼部。
我們在多種細胞和小鼠組織中測試了精胺和亞精胺為基礎的材料的體內外導入效果，其中一種基於精胺的系統非常有利於小核酸轉染人A549細胞和呼吸道導入小核酸， 我們將其命名為Snano-6。
具體實施例17 :用於眼部治療的小核酸的化學修飾單鏈的核苷酸在血清或細胞內將被快速降解，雙鏈核苷酸，包括小核酸，比對應的單鏈核苷酸更穩定，但是依然會被酶解，因此在藥物必須接觸血液的情況下，需要保護藥物免遭核酸酶的酶解作用。這些保護措施可以來自於外部的合適的導入載體(如我們在實施例16 中描述的，包含納米顆粒或脂質體膠囊的複合物)，或者是來自於內部的對核苷酸自身進行抗核酸酶降解的修飾。最簡單的方法是直接修飾核苷酸間的磷酸連接增加穩定性，採用硫 (PS)、硼(硼燒，boranophosphate)、氮(氨基磷酸酯，phosphoramidate)或甲基(甲基膦酸酯，methyIphosphonate)代替非橋鍵氧已經用於穩定反義的單鏈寡聚核苷酸。
圖18顯示了可提高小核酸核酸酶穩定性的各種修飾方法，氨基磷酸酯和甲基膦酸酯的衍生物廣泛 用於反義核苷酸，可以顯著改變核苷酸與細胞內酶如RNase H的相互作用。還沒有系統的研究將這些應用拓展到RNAi領域。硼烷修飾的DNA或RNA有利於抵抗核酸酶的降解，硼修飾也不影響小核酸的功能，但是硼烷的化學合成相對困難。PS修飾更容易因此獲得廣泛應用，可以提升反義單鏈核苷酸和小核酸的核酸酶穩定性。
硫磷醯(Phosphorothioate)修飾的核酸是具有「粘性」的硫酸聚陰離子，能非特異性地與大量細胞內蛋白結合，可能引起有害的副作用。儘管如此，這一修飾依然可安全用於小核酸的修飾。只在寡聚核苷酸的末端用最小程度的PS修飾，這有利於減少有害的副作用。鑑於反義核苷酸已經有很長的使用PS修飾的歷史，對這一修飾的潛在毒性有很好的理解，PS修飾化合物的安全性也在可控範圍內。
在核酸2號位上修飾能間接提升核苷酸間的磷酸鍵對核酸酶的抗性，同時能增加雙鏈的穩定性(Tm)，甚至有利於避免遭受激活的免疫系統的攻擊。2-0-甲基化RNA(2-0Me) 是在哺乳動物核糖體RNA (rRNA)和轉運RNA (tRNA)中發現的天然RNA變體，這種結構沒有毒性，可用於修飾小核酸中的正義鏈或反義鏈。
氟修飾(2-F)不影響小核酸的功能，有利於雙鏈穩定抵抗核酸酶的降解，在嘧啶上連接2-F能維持小核酸在體內外的活性。甚至可以在Ago-2 (Argonaute,將長的雙鏈RNA 切割成小核酸的蛋白)切割的位點進行2-F修飾。2-F修飾嘧啶和2-OMe修飾嘌呤同時使用將極大提高RNA雙鏈在血清中的穩定性，提高在體內的作用效果。
核酸鎖(LNA)包含一個亞甲基橋，將2-0與核糖的4_C連接起來，亞甲基橋「鎖住」3』內向構象中的糖，可顯著提高Tm和對核酸酶的抗性。大量的LNA修飾會導致小核酸活性下降(甚至比2-OMe修飾下降更多)，然而，少量的LNA修飾能保持小核酸的功能，並且明顯增強對核酸酶的穩定性。
是天然發生的RNA變體，用在合成的小核酸中不會有明顯毒性，而其他種類的 2_修飾是非天然的，它們的毒副作用需要進一步探討。已有大量研究將2-F修飾作為合成寡聚核苷酸的安全組分。
上述的修飾策略能夠保持21個鹼基對小核酸雙鏈與RISC (RNA誘導的沉默複合物)結合的能力，維持Ago2引導鏈的功能。我們用於治療眼部疾病的小核酸是25個鹼基對的平末端小核酸，我們將聯合採用納米顆粒載體和一定程度上的化學修飾這兩種策略，以提升治療效果，儘量降低毒性及後期產品製備階段的複雜性。
具體實施例18 :小核酸治療與其它治療方法的聯合使用已經有若干個治療藥物用於臨床，包括單克隆抗體藥物(Avastin和Lucentis)、可溶性受體製劑(VEGF trap)和其他藥物。由於我們的小核酸藥物採用不同的作用機理，即是通過抑制VEGF和VEGFR2蛋白的產生而不是等蛋白生成之後再阻斷其功能，因此理論上兩種不同作用機理的藥物聯合會有更好的效果。我們嘗試在同一給藥方案中將小核酸與單克隆抗體聯合使用，觀察到療效顯著提升。因此，在我們用小核酸治療眼部血管增生時，將考慮同時用小核酸和其它抑制劑聯合治療。最新研究發現了許多micro RNA (miRNA)參與血管增生疾病的血管新生過程，例如miR-132能作為抗miR或小核酸抑制劑的靶標，使病理學逆轉。小核酸與抗miR製劑聯合也是治療眼部適應症的新方法。
具體實施例19 =HKP-小核酸藥物的開發過程小核酸治療藥物的開發與小分子和蛋白藥物等其他製劑的開發過程有一定差異，我們已經建立了 HKP-小核酸製劑的生產製備流程(圖19)，進行一系列藥理學和毒理學研究，以符合監管機構對藥品註冊審批的要求。
權利要求
1.包含二種小核酸分子和藥物載體的組合物，所述二種小核酸分子能與兩個靶基因的mRNA分子結合，所說的mRNA至少能編碼一部分多肽或蛋白質，或者為5_』或3_』端的非翻譯序列，所述兩個靶基因選自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF_bl基因中的二種。
2.包含三種小核酸分子和藥物載體的組合物，所述三種小核酸分子能與三個靶基因的mRNA分子結合，所說的mRNA至少能編碼一部分多肽或蛋白質，或者為5_』或3_』端的非翻譯序列，所述三個靶基因分別為VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b I基因。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其中靶向VEGF基因的小核酸分子選自表I中的序列。
4.如權利要求3所述的組合物，其中靶向VEGF基因的小核酸分子為hmVEGFc,正義鏈5』 _r (CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3』。
5.如權利要求1或2所述的組合物，其中靶向VEGFR2基因的小核酸分子選自表2中的序列。
6.如權利要求5所述的組合物，其中靶向VEGFR2基因的小核酸分子為hmVR2h,正義鏈5』 _r (GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA) -3』。
7.如權利要求1或2所述的組合物，其中靶向TGF-bl基因的小核酸分子選自表3中的序列。
8.如權利要求7所述的組合物，其中靶向TGF-bl基因的小核酸分子為hmTF25f，正義鏈5，-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3，。
9.如權利要求1或2所述的組合物，其中小核酸的靶mRNA分子能編碼的基因來自VEGF信號通路，TGF-b信號通路，或者同時來自VEGF和TGF-b兩個信號通路。
10.如權利要求9所述的組合物，其中所述mRNA分子編碼VEGF、VEGFR2、TGF-bl蛋白，或5_』或3_』端的非翻譯序列。
11.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述藥物載體包括聚陽離子結合劑、陽離子脂質體、陽離子膠團、陽離子多肽、接枝狀親水聚合物、非天然陽離子聚合物、陽離子聚縮醛、親水性接枝狀聚縮醛、配體功能化的陽離子聚合物和配體功能化的親水性接枝狀聚合物。
12.如權利要求11所述的組合物，其中所述藥物載體為分枝狀組氨酸-賴氨酸聚合物HKP。
13.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述小核酸分子，包括小幹擾核苷酸(smallinterfering RNA, siRNA)、微核苷酸(microRNA,miRNA)和雙鏈RNA( double stranded RNA,dsRNA)。
14.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述小核酸分子，具有粘性末端或平末端，該小核酸分子是未經修飾的小核酸分子或者是經過化學修飾的小核酸分子。
15.如權利要求14所述的組合物，其中所述小核酸分子具有19，或20，或21，或22，或23，或24，或25，或26，或27個核苷酸。
16.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述小核酸分子能抑制特定mRNA的表達，所述mRNA編碼的基因選自促炎症途徑基因、促血管生成基因、促細胞增殖途徑基因、病毒感染性介質基因組RNA或病毒感染性介質基因。
17.如權利要求1或2所述的組合物，在製備成治療眼部疾病的藥物中的應用。
18.如權利要求17所述的組合物，給藥位點為結膜下、玻璃體內或皮下組織，給藥方式為局部給藥或注射給藥。
19.如權利要求17所述的組合物，其中所述眼部疾病，包括但不限於增生性糖尿病視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、單純皰疹病毒性基質角膜炎、老年黃斑變性、葡萄膜炎、虹膜紅變、結膜炎、角膜炎、瞼緣炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑退化和視網膜病。
20.如權利要求1所述的組合物，包括小核酸序列的組合:hmVEGFc，正義鏈5』-r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3，和 hmVR2h,正義鏈5 』 _r (GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA) -3，。
21.如權利要求1所述的組合物，包括小核酸序列的組合:hmVEGFc，正義鏈5』-r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3，和 hmTF25f,正義鏈5 』 _r (GAGGUCACCCGCGUGCUMUGGUGG) -3，。
22.如權利要求2所述的組合物，包括小核酸序列的組合hmVEGFc，正義鏈5』_r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3』，hmVR2h,正義鏈5』 _r (GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA) -3』，和hmTF25f,正義鏈5』 _r (GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG) -3』。
23.如權利要求12所述的組合物，其中所述藥物載體和所述小核酸分子的N:P比例在2:1 3:1，或 2 :1 4 :1，或 2 :1 5 :1，或 2:1 6:1 之間。
全文摘要
本發明公開了雙靶標/多靶標小核酸治療眼部疾病的組合物及應用，該組合物，有包含二種小核酸分子和藥物載體的，該二種小核酸分子靶向的基因選自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因中的二種；也有包含三種小核酸分子和藥物載體的，該三種小核酸分子靶向的基因分別為VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因。該組合物，通過用核酸幹擾(RNAi)介導的抑制基因表達和生化途徑來獲得對眼病有效的治療，能夠製備成治療眼部疾病的藥物。該眼部疾病，包括增生性糖尿病視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、單純皰疹病毒性基質角膜炎、老年黃斑變性、葡萄膜炎等。
文檔編號A61K31/7105GK103007291SQ20111028775
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者陸陽, 徐軍, 路陽, 唐盛高, 龍超峰, 陳小新, 謝稱石 申請人:蘇州聖諾生物醫藥技術有限公司, 廣東眾生藥業股份有限公司