一種檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用的模型和方法與流程
2023-12-07 07:55:41 1
本發明涉及腫瘤的細胞免疫治療領域，尤其涉及一種檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用的模型和方法。
背景技術：
肝癌是亞洲死亡率最高的癌症之一。目前，肝癌有效的治療方法是部分肝臟切除、肝臟移植、化療、動脈化療栓塞。儘管在肝癌診斷和治療上都有許多的新發現，然而，肝癌的五年生存率仍然只有10％。目前，許多新的潛在免疫治療手段都開展了臨床試驗，如CAR T細胞免疫治療、免疫抑制檢查點抗體。鑑於低生存率，嚴謹而有效模擬人體的臨床前評估模型是目前肝癌治療研發平臺的緊急需求。
然而對於實體瘤而言，嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T細胞的臨床前試驗結果與臨床試驗結果存在著巨大的差異，導致目前通過臨床審批、成為上市藥物的實體瘤CAR T細胞治療寥寥可數。而CAR T細胞的臨床前和臨床治療結果差異巨大的原因還未知，但可能是多因素影響的。
通過對比血液腫瘤和實體瘤之間的差異，推測實體瘤體內微環境中可能存在的CAR T細胞阻礙：1)突破實體瘤組織物理屏障，腫瘤組織存在妨礙CAR T細胞浸潤至腫瘤部位的物理屏障；2)腫瘤代謝微環境中相對酸性、缺乏氧和營養物質，阻礙CAR T細胞生存、增殖和殺傷作用；3)腫瘤抑制性分泌因子和細胞因子的免疫抑制作用；4)免疫抑制細胞，如調節性T細胞(Regulatory T cells，Tregs)、髓系來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)和嗜中性粒細胞(Neutrophils，TANs)。而以上列舉的條件是常規實體瘤細胞系構建的異種移植小鼠模型無法重現的，導致實體瘤CAR T細胞療效的臨床前評估不準確，臨床前和臨床治療結果差異懸殊。
現有技術中存在的都是將肝癌細胞系體外識別殺傷評估和肝癌細胞系體內識別殺傷評估，而肝癌細胞系的體內識別殺傷評估是現有的CAR T細胞臨床前療效評估方法。然而該方法無法有效模擬CAR T細胞對肝癌異質性、腫瘤組織物理屏障和代謝屏障、免疫抑制微環境等效應的療效。對於CAR T細胞，原代腫瘤細胞異質性將可能是CAR T細胞治療耐藥的重要原因之一，而腫瘤細胞系構建的療效評估模型卻無法重現的腫瘤異質性對CAR T細胞的耐藥作用。由此可見，實體瘤CAR T細胞的臨床前評估方法並未成熟，亟需發現新的方法。
此外，肝癌又是實體瘤中的一個特殊例子。因為而肝臟組織是一個特殊的器官，參與人體造血過程。肝臟亦被稱為免疫倖免器官，即肝臟移植髮生移植物排斥宿主疾病的概率遠遠低於其它器官移植，但具體的作用機制並未見報導。但由此可推知，肝臟組織存在某種緩解免疫效應的作用機制。
CN 102178568 A公開了一種用於研究肝細胞肝癌上皮間質樣變動態過程的動物模型的方法，取實驗動物，在超聲設備引導下肝臟原位接種腫瘤細胞，動態觀察上皮間質樣變相關指標變化以及肺轉移情況。但其無法用來評估CAR T細胞在體內的療效。CAR T細胞對人體肝癌的臨床治療則可能受到更強烈的免疫抑制作用，靶向肝癌的CAR T細胞對肝癌臨床前評估模型的要求更高。
技術實現要素：
針對目前靶向肝癌CAR T細胞臨床前評估手段無法有效模擬和評估肝癌CAR T細胞的體內療效，本發明提供一種檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用的模型和方法，通過在高度免疫缺陷小鼠體內移植肝癌病人來源的腫瘤組織塊，並將肝癌CAR T細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，構建原代肝癌異種移植模型，並利用該模型評估靶向肝癌CAR T細胞的臨床前療效。
為達此目的，本發明採用以下技術方案：
一方面，本發明提供一種檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用的模型，所述模型為通過將所述原代肝癌組織移植到模型生物體內，再將嵌合抗原受體T細胞移植到模型生物體內而獲得。
優選地，所述原代肝癌組織移植的體積為1-5mm3，例如可以是1mm3、2mm3、3mm3、4mm3、5mm3，優選為2-3mm3。
優選地，所述原代肝癌組織移植的數量為1-5塊，例如可以是1塊、2塊、3塊、4塊、5塊，優選為2-3塊。
優選地，所述嵌合抗原受體T細胞移植的數量為(1-4)×10-6，例如可以是1×10-6、2×10-6、3×10-6、4×10-6，優選為2×10-6。
本發明中，所述模型用於非治療目的的檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用，通過將肝癌病人來源的腫瘤組織移植入免疫缺陷小鼠體內，並將肝癌CAR T細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，構建可有效模擬肝癌病人體內病理微環境的人源化小鼠模型，並在該模型中模擬臨床治療模型多次移植CAR T細胞，確保CAR T細胞的穩定供給，CAR T細胞激活將高表達PD-1、CTLA-4、TIM3等免疫抑制檢查點受體，擬靶向殺傷的肝癌細胞的免疫抑制檢查點配體的表達與否，及其輔助免疫抑制微環境形成的因素，將極大程度決定CAR T細胞的體內腫瘤殺傷能力，並通過腫瘤監控評估CAR T細胞對肝癌的治療作用。
根據本發明，所述原代肝癌組織為邊緣淡黃色組織和/或中間白色組織，優選為邊緣淡黃色組織，所述邊緣淡黃色組織能夠更好的與模型生物相容。
根據本發明，所述將所述原代肝癌組織移植到模型生物體內的移植方式為皮下移植、腎囊膜下移植或肝臟原位移植中的一種或至少兩種的組合，優選為肝臟原位移植，所述肝臟原位移植通過肝臟微環境可有效促進肝癌細胞及肝癌相關細胞如MDSC、Treg、TAM、TAN等的生存，則可有效模擬肝癌相關細胞對肝癌腫瘤起始、擴增、遷移、耐藥等的作用，更真實地模擬嵌合抗原受體T細胞在人體肝癌微環境中的細胞效應和抑制作用。
所述的皮下移植具體步驟如下：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成直徑為3mm的腫瘤組織小塊，每隻受體小鼠移植2-3小塊，將肝癌腫瘤組織小塊用基質凝膠(Matrix Gel)包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側剪開小口，用鑷子將Matrix Gel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；腫瘤監控：通過遊標卡尺定時量取腫瘤體積監控腫瘤生長和對藥物的反應；或通過螢光素酶-活體成像技術檢測；或通過流式細胞技術和免疫組化技檢測。
所述的腎囊膜下移植具體步驟如下：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm3的腫瘤組織小塊備用，每隻受體小鼠移植2-3小塊；將小鼠麻醉，選取小鼠一側腎臟，在腎包囊上開小口(開口大小與移植管口相當)，用青黴素-生理鹽水溼潤腎包囊，以移植管吸取帶一隻的聚合卵巢並移植茹受體小鼠腎囊膜下(遠離手術開口)，將腎臟放回體腔中，並向體腔中注入適量青黴素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，於傷口塗抹碘酒消毒；腫瘤監控：通過螢光素酶-活體成像技術檢測，或通過流式細胞技術和免疫組化技術檢測。
所述的肝臟原位移植具體步驟如下：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm3的腫瘤組織小塊備用，每隻受體小鼠移植2-3小塊；麻醉小鼠，沿腹中線剪開小鼠皮膚和腹膜，暴露肝葉，擠出肝臟左外葉，用眼科沙眼鏟在肝左外葉中部戳一個3-5mm長孔，棉籤局部止血後，用鑷子將腫瘤組織塊夾入小孔內，用雷射筆閉合傷口並止血，用青黴素-生理鹽水塗抹傷口，縫合腹膜和皮膚，用碘酒消毒傷口；腫瘤監控：通過螢光素酶-活體成像技術檢測，或通過流式細胞技術和免疫組化技術檢測。
優選地，所述嵌合抗原受體T細胞在所述原代肝癌組織移植到模型生物體內的5-10天後進行移植，例如可以是5天、6天、7天、8天、9天或10天，優選為6-8天進行移植，進一步優選為7天。
優選地，所述嵌合抗原受體T細胞進行多次移植，優選為進行2-4次移植，例如可以是2次、3次或4次，進一步優選為進行2次移植。
優選地，所述嵌合抗原受體T細胞進行多次移植，其中相鄰兩次移植的間隔時間為5-10天，例如可以是5天、6天、7天、8天、9天或10天，優選為6-8天，進一步優選為7天。
根據本發明，所述模型生物體為本領域常規的模型生物，本發明中選用兔、鼠、貓、狗或猴中的任意一種或至少兩種組合的模型，優選為免疫缺陷型小鼠模型，進一步優選為NOD/SCID、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1/-IL2rg-/-、NOD/SCID IL2rg-/-小鼠模型，最優選為NOD/SCID IL2rg-/-小鼠模型。
根據本發明，所述嵌合抗原受體T細胞為特異性識別肝癌細胞的嵌合抗原受體T細胞。
所述嵌合抗原受體主要包括信號肽、抗原識別區、鉸鏈區、跨膜區和胞內區串聯構成，其中，所述胞內區主要包括人4-1BB胞內區。
本發明中，通過在GPC3 CAR分子中引入人4-1BB胞內信號域，構建成的GPC3 CAR T細胞，發現其分泌偏向於Th1類型，對肝癌細胞具有強烈的細胞殺傷效應，且高表達Th1細胞因子，極大程度刺激非CAR T細胞引起的腫瘤殺傷效應，可有效防止GPC3-肝癌細胞的逃逸和潛在復發威脅。
根據本發明，過表達特異性靶向GPC3的嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T細胞，可特異性識別GPC3+腫瘤抗原，殺傷腫瘤細胞，具有顯著的體內外擴增和腫瘤殺傷作用，所述抗原識別區為抗GPC3抗體、CD133、MUC1(Mucin 1,cell surface associated)或CEA(Carcinoembryonic Antigen)中的任意一種或至少兩種的組合，優選為抗GPC3抗體。
根據本發明，所述信號肽為能夠指導嵌合抗原受體跨膜轉移的信號肽都是可行的，本領域技術人員可以根據需要選擇本領域常規的信號肽，所述信號肽為人IgM信號肽和/或人CD8α信號肽，優選為人IgM信號肽；
優選地，所述的跨膜區為人CD28跨膜區和/或人CD8跨膜區，優選為人CD28跨膜區。
根據本發明，所述胞內區除了含有人4-1BB胞內區以外，還包括人CD28胞內區、人CD3ζ胞內區或人4-1BB胞內區中的任意一種或至少兩種的組合，所述組合例如可以是人CD28胞內區、人CD3ζ胞內區，人CD28胞內區、人4-1BB胞內區，人CD3ζ胞內區、人4-1BB胞內區或人CD28胞內區、人CD3ζ胞內區和人4-1BB胞內區，優選為人CD28胞內區和人CD3ζ胞內區的組合，在本發明中，所述完整的胞內區為人CD28胞內區、人4-1BB胞內區和人CD3ζ胞內區串聯構成。
作為優選技術方案，所述嵌合抗原受體由人IgM信號肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區和胞內區、人4-1BB胞內區和人CD3ζ胞內區串聯構成，即IgM-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ(CAR GPC3)。
發明人發現，所述嵌合抗原受體由人IgM信號肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區和胞內區、人4-1BB胞內區和人CD3ζ胞內區串聯構成，其對腫瘤的識別殺傷效果最好，可靶向GPC3-腫瘤細胞，有效抑制肝癌生長。
優選地，所述嵌合抗原受體的胺基酸序列為SEQ ID NO.1，核酸序列為SEQ ID NO.2。
所述嵌合抗原受體基因合成序列IgM-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ的胺基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.
所述嵌合抗原受體基因合成序列IgM-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ的核酸序列(SEQ ID NO.2)如下：
5-atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaaatacacatgttcctcctacgttcggatcggggaccaagctggaaataaaaggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcgcaggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctaaaatggattggagctcttgatcctaaaactggtgatactgcctacagtcagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacaagattctactcctatacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc-3.
本發明中，是通過將所述原代肝癌組織的邊緣淡黃色組織移植到模型生物體內，再通過多次將SEQ ID NO.2所示的核酸序列轉染的T細胞移植到模型生物體內而獲得，通過檢測模型生物體內皮下肝癌腫瘤組織塊來判斷嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用。
優選地，所述檢測的方式為量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量、螢光素酶-活體成像技術或流式細胞儀和免疫組化技術中的任意一種或至少兩種的組合，
根據本發明，所述量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量的方式為本領域常規的量取方法，本領域技術人員可以根據實際需要進行選擇，在此不做特殊限定，本發明採用遊標卡尺進行。
根據本發明，螢光素酶-活體成像技術的方式為本領域常規的量取方法，本領域技術人員可以根據實際需要進行選擇，在此不做特殊限定。
根據本發明，流式細胞儀和免疫組化技術具體為：原代肝癌組織移植後60天，CO2處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細胞技術和免疫組化技術，檢測肝癌細胞的比例和分布。
優選地，所述腫瘤組織塊的檢測時間為多次移植完嵌合抗原受體T細胞後進行，每2-5天，例如可以是2天、3天、4天或5天，優選3天量取一次。
第二方面，本發明提供一種檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用的方法，包括如下步驟：通過檢測權利要求1-7中任一項所述的模型生物體內皮下肝癌腫瘤組織塊來判斷嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用。
優選地，所述檢測的方式為量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量、螢光素酶-活體成像技術或流式細胞儀和免疫組化技術中的任意一種或至少兩種的組合，
根據本發明，所述量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量、的方式為本領域常規的量取方法，本領域技術人員可以根據實際需要進行選擇，在此不做特殊限定，本發明採用遊標卡尺、
根據本發明，螢光素酶-活體成像技術的方式為本領域常規的量取方法，本領域技術人員可以根據實際需要進行選擇，在此不做特殊限定。
根據本發明，流式細胞儀和免疫組化技術具體為：原代肝癌組織移植後60天，CO2處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細胞技術和免疫組化技術，檢測肝癌細胞的比例和分布。
優選地，所述腫瘤組織塊的檢測時間為多次移植完嵌合抗原受體T細胞後進行，每2-5天，例如可以是2天、3天、4天或5天，優選3天量取一次。
第三方面，本發明提供一種如第一方面所述的模型或如第二方面所述的方法在評估CAR T細胞對肝癌細胞抑制效果中的應用。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明的模型可有效模擬病人的腫瘤惡性程度，評估CAR T細胞對不同惡性程度的肝癌的抑制作用；本發明模型可有效評估原代肝癌細胞中的免疫抑制檢查點分子的表達對CAR T細胞的抑制作用。
附圖說明
圖1為本發明嵌合抗原受體T細胞的感染比例；
圖2為本發明激活後的嵌合抗原受體T細胞的免疫抑制檢查點分子表達；
圖3本發明通過免疫組化對比肝癌病人原代腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織中GPC3和AFP的表達情況；
圖4為本發明CAR-GPC3 T細胞體內抑制肝癌細胞系HepG2細胞生長；
圖5為本發明CAR-GPC3 T細胞抑制1號肝癌病人PDX1模型中腫瘤生長；
圖6為本發明CAR-GPC3 T細胞抑制2號肝癌病人PDX2模型中腫瘤生長；
圖7為本發明CAR-GPC3 T細胞抑制3號肝癌病人PDX3模型中腫瘤生長。
具體實施方式
為更進一步闡述本發明所採取的技術手段及其效果，以下結合附圖並通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案，但本發明並非局限在實施例範圍內。
實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購獲得的常規產品。
實施例1：嵌合抗原受體T細胞的構建
(1)通過全基因合成人IgM信號肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區和胞內區、人4-1BB胞內區和人CD3ζ胞內區，即CAR-GPC3-CD28-4-1BB-CD3ξ(CAR-GPC3)，其序列如SEQ ID NO.4所示，再全基因合成CAR-CD19-CD28-4-1BB-CD3ξ(CAR CD19)核酸序列作為陰性對照，合成的基因C端含限制性內切酶Pme1酶切位點及其保護鹼基和N端含限制性內切酶Spe1酶切位點及其保護鹼基；
(2)通過酶切連接將合成基因連接入pWPXLd-EGFP慢病毒載體，分別獲得CAR質粒轉化載體pWPXLd-CAR-GPC3-2A-EGFP和pWPXLd-CAR-CD19-2A-EGFP；
(3)慢病毒包裝：pWPXLd-CAR-GPC3-2A-EGFP、pWPXLd-CAR-CD19-2A-EGFP分別與慢病毒包裝輔助質粒pMD2.G、psPAX2共同轉導入293T細胞(處於生長高峰期，150mm培養皿豐度為80-90％)，加入試劑及劑量如下：
(4)分別於轉化後24、48和72小時，收集培養基上清，並加入新鮮培養基：DMEM高糖培養基+1％FBS+1％雙抗，病毒溶解後，收集病毒溶液分裝於PCR管，凍存於-80℃待用；
(5)人體T細胞的分離純化：通過Ficoll密度梯度法分離出人體血液中的單個核細胞，經紅細胞裂解液裂解去除紅細胞後，再通過MACS Pan-T磁珠分選出T細胞；
(6)通過包被CD2、CD3、CD28抗體的磁珠刺激分選後的T細胞；
(7)在刺激後的T細胞中，分別加入表達CAR-GPC3、CAR-CD19慢病毒、8μg/mL的polybrene和300IU/mL IL-2；
(8)置於37℃，5％CO2培養箱培養24h後，300g離心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鮮培養基重懸，即得CAR-GPC3 T細胞和CAR–CD19T細胞；
(9)通過流式細胞技術檢測CAR-GPC3、CAR-CD19 T細胞的慢病毒感染效率(GFP陽性細胞比例)，結果如圖1所示；
(10)通過流式細胞技術CAR-GPC3 T細胞(以新鮮人體T細胞為陰性對照)中免疫抑制檢查點分子PD-1、CTLA-4、TIM3的表達水平，結果如圖2所示。
從圖1和圖2的結果可以看出，CAR GPC3和CAR CD19病毒感染人體T細胞分別約達到60％、50％；而腫瘤GPC3抗原激活後的CAR GPC3 T細胞高表達免疫抑制檢查點分子PD-1、CTLA4、TIM3，顯示CAR GPC3 T細胞的免疫殺傷作用會受到腫瘤微環境中高表達免疫抑制檢查點分子配體的細胞抑制，表明可重建腫瘤相關細胞及其免疫抑制作用對嵌合抗原受體T細胞臨床前評估的必要性。
實施例2：通過皮下移植肝癌PDX模型的構建
(1)原代肝癌樣本處理：原代肝癌腫瘤組織樣本來源於三甲醫院的腫瘤組織樣本庫，肝癌樣本需浸泡於RPMI 1640培養基並保存於冰上運輸。獲取腫瘤樣本後，選擇邊緣淡黃色/肉色部分腫瘤組織肝癌樣本，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用於腫瘤移植備用；
(2)肝癌組織移植與監控：採用皮下移植的方式，具體包括：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成直徑為3mm的腫瘤組織小塊,每隻受體小鼠移植2-3小塊，將肝癌腫瘤組織小塊用Matrix Gel包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側剪開小口，用鑷子將Matrix Gel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；
(3)肝癌PDX小鼠模型傳代：將肝癌PDX小鼠通過CO2處死小鼠，取小鼠腫瘤組織，剪取腫瘤組織外層淡黃色細胞，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用於腫瘤移植；
(4)經過3次傳代移植後，獲取PDX模型腫瘤組織進行組織切片和(GPC3、AFP)免疫組化染色(以相對應的病人原代肝癌組織為對照)，對比PDX模型對病人腫瘤樣本組織結構、腫瘤標誌物表達情況的模擬。
(5)腫瘤監控：於腫瘤移植後60天，CO2處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細胞技術和免疫組化技術，檢測肝癌病人原代腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織中GPC3和AFP的表達情況，結果如圖3所示。
從圖3可以看出，多次傳代後的PDX模型仍可有效保留和模擬原代肝癌腫瘤組織結構特徵和腫瘤標誌物(GPC3和AFP)的表達，是抗原特異性靶向的嵌合抗原受體T細胞的療效評估的必要前提條件。
實施例3：通過肝臟原位移植肝癌PDX模型的構建
(1)原代肝癌樣本處理：原代肝癌腫瘤組織樣本來源於三甲醫院的腫瘤組織樣本庫，肝癌樣本需浸泡於RPMI 1640培養基並保存於冰上運輸。獲取腫瘤樣本後，選擇邊緣淡黃色/肉色部分腫瘤組織肝癌樣本，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用於腫瘤移植備用；
(2)肝癌組織移植與監控：採用肝臟原位移植的方式，具體包括：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm3的腫瘤組織小塊備用,每隻受體小鼠移植2-3小塊；麻醉小鼠，沿腹中線剪開小鼠皮膚和腹膜，暴露肝葉，擠出肝臟左外葉，用眼科沙眼鏟在肝左外葉中部戳一個3-5mm長孔，棉籤局部止血後，用鑷子將腫瘤組織塊夾入小孔內，用雷射筆閉合傷口並止血，用青黴素-生理鹽水塗抹傷口，縫合腹膜和皮膚，用碘酒消毒傷口；
(3)肝癌PDX小鼠模型傳代：將肝癌PDX小鼠通過CO2處死小鼠，取小鼠腫瘤組織，剪取腫瘤組織外層淡黃色細胞，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用於腫瘤移植；
(4)經過3次傳代移植後，獲取PDX模型腫瘤組織進行組織切片和(GPC3、AFP)免疫組化染色(以相對應的病人原代肝癌組織為對照)，對比PDX模型對病人腫瘤樣本組織結構、腫瘤標誌物表達情況的模擬。
(5)腫瘤監控：於腫瘤移植後60天，CO2處死小鼠，取小鼠外周血、肝臟、脾臟、肺、腎臟，通過流式細胞技術和免疫組化技術，檢測肝癌病人原代腫瘤組織和PDX模型腫瘤組織中GPC3和AFP的表達情況。
其結果與實施例2結果類似，多次傳代後的PDX模型仍可有效保留和模擬原代肝癌腫瘤組織結構特徵和腫瘤標誌物(GPC3和AFP)的表達。
實施例4：對比肝癌細胞系和原代肝癌組織異種移植模型評估CAR T細胞的區別
(1)將細胞數為1×106的HepG2-GL細胞系(GPC3+肝癌細胞系，GL為螢光素酶標記)皮下移植入NOD/SCID IL2rg-/-免疫缺陷小鼠體內，構建肝癌異種移植小鼠模型；
(2)通過遊標卡尺每日量取皮下肝癌腫瘤組織塊的大小，當腫瘤組織達到50-100mm3(腫瘤移植後7天)，則通過尾靜脈注射將2×106的CAR-GPC3 T、CAR-CD19 T細胞分別移植入肝癌小鼠體內；首次CAR T注射後7天(腫瘤移植後14天)再進行第二次同劑量注射；
(3)CAR T細胞移植後，每周兩次通過遊標卡尺量取兩個實驗組小鼠皮下腫瘤組織塊大小(即腫瘤移植後第7、10、13、16、19、21、24、27、30天)，並記錄，繪製腫瘤生長曲線圖，結果如圖4所示；
從圖4可以看出，肝癌細胞系在免疫缺陷小鼠體內的生長速度非常快，於第7天即達可檢測到50-100mm3腫瘤塊，而通過肝癌細胞系小鼠模型評估CAR T細胞的體內療效可初步反映CAR T細胞具有一定的腫瘤抑制作用。
實施例5：對比PD-L1+/-原代肝癌組織異種移植模型評估CAR T細胞的區別
(1)通過實施例2-3的PDX模型構建的方法，分別構建了1、2、3號肝癌病人來源的異種移植模型；其中，#1和#2病人為PD-L1陰性，#3病人為PD-L1陽性；肝癌惡性程度：#3>#2>#1；
(2)移植了原代肝癌組織後，通過遊標卡尺每日量取皮下肝癌腫瘤組織塊的大小，當腫瘤組織達到50-100mm3，則通過尾靜脈注射將2×106的CAR-GPC3 T、CAR-CD19 T細胞(對照組)分別移植入肝癌小鼠體內；首次CAR T注射後7天(腫瘤移植後14天)再進行第二次同劑量注射；
(3)注射了CAR T細胞後，每三天通過遊標卡尺量取並記錄皮下肝癌腫瘤組織塊的大小，作CAR T細胞對腫瘤生長的抑制作用圖，結果如圖5-7所示。
由圖5-7可知，PDX模型的增長速度PDX#3>PDX#2>PDX#1與病人的腫瘤惡性程度有關，即肝癌PDX模型可有效模擬病人的腫瘤惡性程度，並能評估CAR T細胞對不同惡性程度的肝癌的抑制作用；CAR GPC3 T細胞治療在PD-L1陽性的肝癌PDX模型中會受到抑制，即肝癌PDX模型可有效評估原代肝癌細胞中的免疫抑制檢查點分子的表達對CAR T細胞的抑制作用。
綜上所述，本發明的模型可有效模擬病人的腫瘤惡性程度，評估CAR T細胞對不同惡性程度的肝癌的抑制作用；本發明模型可有效評估原代肝癌細胞中的免疫抑制檢查點分子的表達對CAR T細胞的抑制作用。
申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明並不局限於上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
SEQUENCE LISTING
中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
一種檢測嵌合抗原受體T細胞對肝癌細胞抑制作用的模型和方法
2016
2
PatentIn version 3.3
1
528
PRT
人工合成序列
1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
145 150 155 160
Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
165 170 175
Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His
180 185 190
Gly Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala
195 200 205
Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
210 215 220
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr
260 265 270
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
275 280 285
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
290 295 300
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
325 330 335
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
340 345 350
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
355 360 365
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
370 375 380
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
385 390 395 400
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
405 410 415
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
420 425 430
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
435 440 445
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
450 455 460
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
465 470 475 480
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
485 490 495
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
500 505 510
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520 525
2
1584
DNA
人工合成序列
2
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagatg ttgtgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 120
gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 180
cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 240
cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300
aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 360
gttcctccta cgttcggatc ggggaccaag ctggaaataa aaggtggagg cggttcaggc 420
ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgcag gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg 480
gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt cgggctacac atttactgac 540
tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct gtgcatggcc taaaatggat tggagctctt 600
gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcaaggc cacactgact 660
gcagacaaat cctccagcac agcctacatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720
gccgtctatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaagg gactctggtc 780
actgtctctg cagcggccgc aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag 840
aagagcaatg gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 900
cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg ggggagtcct ggcttgctat 960
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 1020
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1080
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa 1140
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1200
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1260
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1320
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1380
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1440
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1500
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1560
cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1584