化妝品組合物的製作方法
2023-12-04 12:30:01 2
本申請為申請日是2013年1月23日、申請號是201380001136.8、發明創造名稱是「化妝品」的發明專利申請的分案申請。
相關申請的交叉引用
本申請是非臨時申請，要求2012年1月23日遞交的第61/589,592號美國臨時申請的優先權，該臨時申請的內容通過引用的方式併入本申請。
本發明總的來說涉及化妝品及其組分，且尤其涉及包含了有利於提高皮膚質量(膚質)的卵孵化蛋白質提取物(egghatchingproteinaceousextracts)及其配方的化妝品。
背景技術：
傳統的化妝品配方包含了在皮膚上形成保護性覆蓋層以緩解天氣造成的影響的油類物質和多種親脂性物質。化妝品中含有的防曬霜也能減輕對皮膚造成的與老化和自由基的產生有關的紫外線損傷。化妝品組合物的其他常規成分是可以運送可觀數量的水至皮膚的潤膚劑(emollients)，這些水與油的組合影響從皮膚釋放或保留的水分量以掩蓋皺紋。遺憾的是，這些傳統化妝品的配方不能為膚質提供長期的，化學方面的改善。
魚苗孵化場的工人的手有特別好的膚質，即使長時間接觸冷水，這一觀察是分離與魚卵相關的一類新蛋白質的起因。例如在專利u.s.6,346,245，u.s.6,592,866，u.s.2011/0280882，wo2011/06434和u.s.2009/0274770中對這類蛋白質進行了詳細說明。這類分離的蛋白質包括魚卵的內蛋白酵素(zonase)，白細胞凝集素(leukolectin)，極酸的酸性蛋白(vaps)和某種細胞溶解酶(choroelysins)，這些蛋白中至少一些在治療自身免疫性疾病和炎症性疾病方面與治療損傷性皮膚一樣有效，都有最小的副作用。雖然這種蛋白改善了與風化作用和多種環境壓力因素相關的受損的皮膚功能，諸如暴露於空調或空氣汙染物，這些蛋白質似乎對受損的和老化的皮膚相關的其他屬性影響很小或沒有影響。另外，雖然人們曾預想過在化妝品中添加這種魚卵分離蛋白(fishspawnisolateproteins)，但是能夠在化妝品配方中保持蛋白活性和給予貯存穩定性是一項技術挑戰。
因此，現在需要一種可解決多種皮膚老化問題的儲存穩定的化妝品，該化妝品整合了卵且特別是魚卵衍生蛋白的抗炎特性。進一步的，還需要這樣的化妝品，其基本上不含對皮膚有意想不到毒害作用和有生物體內積累問題的合成化妝品成分。
技術實現要素：
本發明提供了一種組合物，其包含了對哺乳動物皮膚有抗炎作用的魚卵蛋白分離物(fishspawnproteinisolate)。其中也存在含有不飽和脂肪酸和甾醇類物質(sterols)的天然產物提取物，該天然產物提取物(naturalproductextract)具有抗氧化活性。本發明提供了乳化劑或增溶劑，或它們的組合以形成分離物和提取物的混合物。本發明還提供了一種組合物，其包含了具有對哺乳動物皮膚的抗炎作用的卵孵化蛋白分離物(egghatchingproteinisolate)。其中存在至少一種抗微生物劑(biocide)，其保護卵孵化蛋白分離物的活性在達3個月儲存期，雖然當所述卵孵化蛋白分離物儲存後應用於受試者皮膚時，該活性保持在未經配製的和新鮮的分離蛋白的80％以內。乳化劑與卵孵化蛋白分離物形成混合物，該混合物具有一被緩衝至ph值5.6到7.9之間的水相。本發明提供了包含上述組合物的化妝品套盒，該套盒採用非消毒的多用途包裝，隨附了其應用於皮膚以促進皮膚更新的說明書。
一種生產含有對哺乳動物皮膚有活性的卵孵化蛋白分離物的化妝品的方法，該方法包括形成至少一水相和至少一疏水相。乳化劑和該至少一種抗微生物劑存在於該至少一水相和該至少一疏水相中的至少一相中。該至少一水相和該至少一疏水相組合以形成一乳液。該乳液或該至少一水相被緩衝至ph值在5.5到7.9之間，在將該卵孵化蛋白分離物添加到該乳液之前。
本發明提供了一種改善皮膚外觀的方法，包括將該組合物用於哺乳動物的皮膚，使用量水平為每平方釐米皮膚1×10-6mg到0.1mg的分離物和2×10-7mg到0.02mg的不飽和脂肪酸，每周使用至少三次，以實現皮膚外觀的改善。
具體實施方式
本發明作為具有皮膚修復特性的化妝品具有實用性。在一個實施例中，一發明的化妝品被配製成能提供多種組分之間的協同作用。在另一個實施例中，一發明的化妝品組合物被配製成不含有合成組分。所有實施例中的發明的化妝品保持蛋白質組分的活性，同時具有在室溫下的貯存穩定性，並且應對因非消毒處理和受到使用造成的微生物汙染所帶來的微生物挑戰。本發明提供了配方的生產方法，該方法生產了一種具有在化妝品的使用和儲存條件下保持蛋白質的活性和貯存穩定性的這些特性的化妝品配方。
根據本發明，卵孵化活性蛋白,特別是對活的哺乳動物皮膚有抗炎作用的魚卵分離蛋白(fishspawnisolatedprotein)，其與含有不飽和脂肪酸和至少一種甾醇的天然產物提取物相組合。該提取物同時具有抗氧化活性和膠原酶抑制活性，並且其與能夠使含有蛋白分離物和提取物的混合物穩定的乳化劑相組合。可以理解地，本發明中可使用多個提取物以達到成分和活性方面的要求。驚奇地發現，卵孵化蛋白的活性，以及特別是魚卵蛋白和天然產物提取物協同作用，在一些本發明的實施例中以實現更好的皮膚外觀以及在一些實施例中實現皮膚的更新，與對照實施例中單獨使用任一成分相比。在其它實施例中，本發明的化妝品在條件下具有至少3個月的儲存穩定性，然而當化妝品儲存後用於受試者皮膚時，該蛋白質組分的活性仍保持在未經配製的和新鮮的分離蛋白的80％以內。
魚卵蛋白分離物，例如，包括魚卵的內蛋白酵素(zonase)、白細胞凝集素(leukolectin)或它們的組合，其所具有的性質在美國專利u.s.6346245，第4欄第15行-第5欄第8行；美國專利u.s.2009/0274770a1中[0321]-[0326]段以及美國專利u.s.2011/0280882中[0157]-[0194]段有詳細說明；含有這種蛋白的粗提物；以及它們的組合。適合於蛋白分離的魚卵的典型來源包括鱘魚(sturgeon)，鮭魚(salmon)，白鮭魚(whitefish)，白鱒魚(vendace)，鱈魚(cod)，毛鱗魚(capelin)和淡水鱈魚(burbot)的魚卵。可以理解的是，本發明中可以使用的卵蛋白的其他來源包括兩棲類動物的卵鞘(amphibianeggcases)，諸如蝌蚪(tadpoles)和蠑螈(salamanders)的卵鞘，爬行類動物的卵鞘(reptilianeggcases)和禽類動物的卵鞘(fowleggcases)。通常情況下，一個卵或特別是含有至少一些上述的蛋白質的魚卵蛋白分離物佔本發明的一個化妝品配方的總重量的0.0001％到10％，如果該粗提物的0.01％～10％是活性蛋白。可以理解的是，在本發明的一個化妝品中存在的蛋白質的量取決於例如包括與另一個化妝品的其它組分的混溶性和皮膚損傷的程度在內的因素。
應當理解的是，在提供了數值範圍實例中，該數值範圍應當不僅包含該範圍的端點值，而且包含範圍的中間數值，具體來說是被包含在該範圍內的和隨著該範圍的最後有效數值(lastsignificantfigure)變化的中間數值。例如，所述的從1至4的數值範圍應當包括1-2，1-3，2-4，3-4和1-4。
本發明的組合物還含有一種天然產物提取物。該天然產物提取物包含不飽和脂肪酸和甾醇，其量達到足以提供超出對照10％的抗氧化劑活性和膠原酶抑制活性，這些活性的檢測分別採用氧自由基吸收能力(orac)測試和在含有1％的天然產物提取物的培養基中的脂質過氧化示蹤劑和採用紫外線b輻射，輻射量為每平方釐米150毫焦耳。r.l.prior,etal.等。血漿及其他生物和食品樣品的親水和親脂性的抗氧化能力(氧自由基吸收能力(oracfl))測定(j.agric.foodchem.)(2003)51:3273-3279。可以理解的是，天然提取物通常含有混合物，其為不飽和脂肪酸，一種或多種甾醇和其他的有不同皮膚病學活性(dermatologicalactivity)成分的混合物。在一個本發明的組合物中使用的產物提取物也能抑制膠原酶活性，在一些實施例中抑制達5％以上，該數值是通過與對照組的比較檢測獲得，對照組中含有0.1％重量百分比的提取物，該檢測採用抗膠原酶的目測操作規程，對與在37℃下培養了3個小時的低溫皮膚切片的活組織檢查進行檢測，該低溫皮膚切片與和不與提取物一同培養，隨後不與(陰性對照)或與每毫升15微升膠原酶一同在37℃下的培養三個小時，之後是活組織檢查樣本的漂洗，之後對毛狀體染色(trichomeofmasson)的目測進行染色和顯微鏡檢查。在一些實施例中，本發明的組合物所使用的天然產物提取物包括ω-3，ω-6和ω-9脂肪酸中的至少一種。在其它實施例中，不飽和脂肪酸在天然產物提取物中存在的量為每100克提取物中至少20毫克。本發明的天然產物提取物還包括至少一種類型的甾醇，例如該甾醇包括膽固醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，及其羥基化的形式和它們的組合。在一些實施例中，至少一種甾醇存在於天然產物的提取物中的量為每100克提取物中大於50毫克。通常，本發明的組合物中天然產物提取物的重量為組合物總重量的0.01～10％，在一些實施例中為總重量的0.1～3％。決定選擇天然產物提取物的量方面的因素，例如包括化妝品的卵孵化蛋白和糖苷在卵孵化蛋白存在下的穩定性，皮膚損害的程度和化妝品的保質期。
根據本發明的天然產物提取物很容易通過常規技術來製備，所述的常規技術例如通過親水性或疏水性的第一溶劑提取諸如葉、莖、芽、根、果實、或它們的組合的植物的一部分和經與該溶劑接觸1-48小時後過濾該混合物，該溶劑的量相對於植物原料通常在1-20的體積比。在降低親水性的有機溶劑中進行萃取和通過常規技術進行洗脫以獲得本發明的天然產物提取物。代表性的脂肪酸/甾醇的提取技術請參見j.s.o』brienanda.a.benson,j.lipidres.,5,1964,pp.432-436.。該有機溶劑，例如包括醚類ethers，呋喃類furans，石油餾分petroleumdistillates，烷烴(alkanes)，滷代烷烴(halogenatedalkanes)，醇類(alcohols)，醋酸纖維素(acetates)，以及它們的組合。各相之間充分相互作用通常20分鐘到48小時後，將有機相分離以獲得根據本發明的提取物。提取物的合適來源包括在本文中都統稱為「海藻」的紅藻，綠藻，褐藻和成簇狀的藍藻細菌(tuft-formingcyanobacteria)，以及植物或它們的具有紫色，紅色，黑色或橙色的果實或葉的著色的組成部分，葉著色在葉綠素的存在或不存在的條件下進行測量。海藻類代表本發明的具有高含量的不飽和脂肪酸和甾醇類物質的天然產物提取物的共同來源。可以理解地是，不飽和脂肪酸和甾醇類物質的合成和/或動物來源很容易地用於本發明的組合物中。
除了卵孵化蛋白分離物和天然產物提取物，一些實施例中的本發明組合物包含了常用於化妝品中的一個或多個其他成分，前提條件是這些成分維持卵孵化蛋白分離物和天然產物提取物的性質。很容易地配製到本發明的化妝品中的有代表性的傳統化妝品成分，例如包括可以構成本發明化妝品的大部分重量的去離子水；諸如石油(petroleum)、羊毛脂(lanolin)、地蠟(ceresin)、微晶蠟(microcrystallinewax)、巴西棕櫚蠟(carnubawax)、c10-c30脂肪酸、c10-c30醇類物質的固體和蠟類物質(solidsandwaxes)；諸如橄欖油(oliveoil)、霍霍巴油(jojobaoil)、蓖麻油(castoroil)、葵花油(sunfloweroil)、榛子油hazelnutoil、乳木果油(sheabutter)和紅花油(saffloweroil)的油類物質；諸如瓜爾豆膠(guargum)、黃原膠(xanthangum)、角叉菜膠(carrageenan)、羥乙基纖維素(hydroxyethylcellulose)、菌類植物膠(sclerotiumgum)，卡波姆膠(carbomers)，聚丙烯酸酯(polyacrylates)和丙烯酸酯-c10-c30烷基丙烯酸酯共聚物(acrylate-c10-c30alkylacrylatecopolymers)的粘度調節劑/穩定劑；諸如甘油(glycerin)，丙二醇(propanediol)，乳酸鈉(sodiumlactate)，pca鈉(sodiumpca)的親水性保溼劑；諸如二辛基醚(dicaprylylether)、肉豆蔻酸肉豆蔻酯(myristylmyristate)、c10-c30的癸酸鹽(c10-c30caprates)、含有辛酸和/或癸酸的c10-c30的甘油三酯和c10-c30的甘油酯的潤膚劑；諸如十六烷醇(cetylalcohol)、十八烷醇(stearylalcohol)、硬脂酸甘油酯glycerylsterate、硬脂酸(stearicacid)、乙二醇甘油酯(glycolsterate)、雙硬脂酸甘油酯(glyceryldistearate)的助乳化劑；諸如非離子型表面活性劑和陰離子表面活性劑的乳化劑，所述的陰離子表面活性劑例如含有月桂醯乳酸(lauroyllactylate)的鹽、己醯乳酸(caproyllactylate)的鹽、椰油醯乳酸(cocoyllactylate)的鹽、硬脂醯乳酸(stearoyllactylate)的鹽、橄欖油鯨蠟醇酯(cetearylolivate)的鹽、橄欖油山梨糖醇(sorbitanolivate)的鹽或甘油油酸酯檸檬酸酯(glyceryloleatecitrate)的鹽，這些鹽的典型的陽離子包括鈉離子、鉀離子、銨離子、鈣離子和鎂離子；矽油類物質；諸如無機輔配物(inorganicaccompaniments)和無機染料的著色劑；金屬皂化處理或矽處理的無機或有機顏料和有機染料；非離子型表面活性劑；聚矽氧烷(polysiloxanes)；水防腐劑(waterpreservatives)；ph調節劑；諸如維生素e、維生素k或b族維生素複合物的維生素和維生素代謝物；精油(essentialoils)；吸收紫外光的化合物(ultravioletlightabsorbingcompounds)；芳香劑(fragrances)；溼潤劑(humectants)；血流增強劑(bloodflowenhancingagents)；誘導冷感的物質(agentsinducingacoldsensation)；止汗劑(antiperspirants)；活性物質(actives)和抗微生物劑。
這裡使用的活性物質被定義為應用於人皮膚來清潔、美容、提高吸引力或改善外觀的有機化合物，該有機化合物具有改善皮膚特性的效力，無論該化合物的性質是極性或非極性的。這裡使用的該術語，特別地排除卵孵化蛋白、卵孵化蛋白的混合物和天然產物提取物。這裡可以使用的活性有機物質，例如包含額外的提取物，例如下列物質的提取物：桑景蘑菇(mushroommposongyi)，金合歡(acaciafarnesiana)，巴西莓(euterpeoleracea)，亮葉金虎尾(malpighiaglabra)，臙脂樹(bixaorellana)，甜杏仁(prunusdulcis)，蘆薈(aloevera)，高山玫瑰杜鵑花(rhododendronferrugineum)，尾穗莧(amaranthuscaudatus)，白芷根(angelicaarchangelica)，茴芹(pimpinellaanisum)，蘋果(malusdomestica)，蘋果薄荷(menthasuaveolens)，燕麥(oatavenanthramide)，大扁杏(prunusarmeniaca)，蒙大拿山金車(arnikamontana)，菜薊(cynarascolymus)，蘆筍(asparagusofficinalis)，鱷梨(perseaamericana)，倒地鈴(cardiospermumhalicacabum)，蜜蜂花(cardiospermumhalicacabum)，龍頭竹(bambusavulgaris)，粉芭蕉(musaparadisiaca)，猴麵包樹(adansoniadigitata)，刺檗(berberisvulgaris)，羅勒(ocimumbasilicum)，月桂(laurusnobilis)，柳蘭(epilobiumangustifolium)，熊蔥(alliumursinum)，歐亞路邊青(geumurbanum)，歐洲樺(betulapubescens)，蘇林南苦木(quassiaamara)，黑種草(nigellasativa)，黑加侖(ribesnigrum)，黑桑(morusnigra)，蘿蔔(raphanussativus)，野茶樹(camelliasinensis)，歐洲黑莓(rubusfruticosus)，變色鳶尾(irisversicolor)，歐洲越橘(vacciniummyrtillus)，琉璃苣(boragoofficinalis)，蠶豆(viciafaba)，睡菜(menyanthestrifoliata)，蕎麥(fagopyrumesculentum)，牛蒡(arctiumlappa)，假葉樹(ruscusaculeatus)，可可(theobromacacao)，菖蒲(acoruscalamus)，葛縷子(carumcarvi)，小豆蔻(elattariacardamomum)，胡蘿蔔(daucuscarotasativus)，卡圖巴古柯(erythroxylumcatuaba)，百金花(centauriumerythraea)，洋甘菊(matricariachamomilla)，櫻桃(prunuscerasus)，鷹嘴豆(cicerarietinum)，小球藻(chlorellavulgaris)，黑果腺肋花楸(aroniamelanocarpa)，金雞納樹(cinchonapubescens)，錫蘭肉桂(cinnamomumverum)，丁香(syzygiumaromaticum)，椰子(cocosnucifera)，小果咖啡(coffeaarabica)，毛喉鞘蕊花(plectranthusbarbatus)，款冬(tussilagofarfara)，聚合草(symphytumofficinale)，大車前草(plantagomajor)，芫荽(coriandrumsativum)，玉米(zeamays)，虞美人(papaverrhoeas)，矢車菊(centaureacyanus)，草棉(gossypiumherbaceum)，越桔(vacciniumvitis-idaea)，黃花九輪草(primulaveris)，蔓越莓(vacciniummacrocarpon)，黃瓜(cucumissativus)，薑黃(curcumalonga)，雛菊(bellisperennis)，大馬士革玫瑰(rosadamascena)，特納草(turneradiffusa)，西洋蒲公英(taraxacumofficinale)，海棗(phoenixdactylifera)，野芝麻(lamiumalbum)，狗薔薇(rosacanina)，火龍果(hylocereusundatus)，麒麟竭(daemonoropsdraco)，狹葉松果菊(echinaceaangustifolia)，高山火絨草(leontopodiumalpinum)，西洋接骨木(sambucusnigra)，刺五加(acanthopanaxsenticosus)，餘甘子(phyllanthusemblica)，藍桉(eucalyptusglobulus)，月見草(oentherabiennis)，沙生蠟菊(helichrysumarenarium)，小米草(euphrasiarostkoviana)，胡蘆巴(trigonellafoenum-graecum)，無花果(ficuscarica)，亞麻(linumusitatissimum)，雞蛋花(plumeriaalba)，球果紫菫(fumariaofficinalis)，酸模(rumexacetosa)，梔子花(gardeniayessminoides)，黃龍膽(gentianalutea)，生薑(zingiberofficinale)，銀杏(ginkgobiloba)，人參(panaxginseng)，毛果一枝黃花(solidagovirgaurea)，葡萄(vitisvinifera)，葡萄柚(citrusparadisi)，野茶樹(camelliasinensis)，巴西香可可(paulliniacupana)，乾草花(graminisflos)，歐洲榛子(corylusavellana)，指甲花(lawsoniainermis)，玫瑰茄(hibiscussabdariffa)，金銀花(lonicerajaponica)，啤酒花(humuluslupulus)，歐洲七葉樹(aesculushippocastanum)，問荊(equisetumarvense)，長生花(sempervivumtectorum)，神香草(hyssopusofficinalis)，冰島地衣(cetrariaislandica)，贗靛(baptisiatinctoria)，角叉菜(chondruscrispus)，常春藤(hederahelix)，素芳花(jasminumofficinale)，霍霍巴(simmondsiachinensis)，歐刺柏(juniperuscommunis)，療傷絨毛花(anthyllisvulneraria)，非洲吊燈樹(kigeliaafricana)，獼猴桃(actinidiachinensis)，葛根(puerarialobata)，羽衣草(alchemillavulgaris)，薰衣草(lavandulaangustifolia)，檸檬(citruslimon)，香茅(cymbopogoncytratus)，光果甘草(glycyrrhizaglabra)，聖母百合(liliumcandidum)，來檬(citrusaurantifolia)，小葉椴(tiliacordata)，荷花(nelumbonucifera)，澳洲堅果(macadamiaternifolia)，望春玉蘭(magnoliabiondii)，冬青葉小檗(berberisaquifolium)，錦葵(malvasylvestris)，芒果(mangiferaindica)，金盞花(calendulaofficinalis)，歐洲慄(castaneasativa)，藥蜀葵(althaeaofficinalis)，旋果蚊子草(filipendulaulmaria)，香瓜(cucumismelo)，水飛薊(silybummarianum)，黍(panicummiliaceum)，可樂豆(colophospermummopane)，花楸樹(sorbusaucuparia)，毛蕊花(verbascumthapsus)，榆葉梧桐(guazumaulmifolia)，香桃木(myrtuscommunis)，旱金蓮(tropaeolummajus)，印度苦楝樹(azadirachtaindica)，大蕁麻(urticadioica)，泡葉藻(ascophyllumnodosum)，肉豆蔻(myristicafragrans)，夏櫟(quercusrobur)，掌狀海帶(laminariadigitata)，燕麥(avenasativa)，須松蘿(usneabarbata)，油橄欖(oleaeuropaea)，洋蔥(alliumcepa)，甜橙(citrussinensis)，檸檬薄荷(menthacitrata)，牛至(origanumvulgare)，三色堇(violatricolor)，番木瓜(caricapapaya)，辣椒(caricapapaya)，香芹(petroselinumcrispum)，西番蓮(passifloraincarnata)，碧桃(prunuspersica)，西洋梨(pyruscommunis)，積雪草(centellaasiatica)，芍藥(paeoniaofficinalis)，胡椒(pipernigrum)，歐薄荷(menthapiperita)，菠蘿(ananascomosus)，櫻桃，歐洲李(prunusdomestica)，石榴(punicagranatum)，療肺草(pulmonariaofficinalis)，西葫蘆(cucurbitapepo)，榲桲(cydoniaoblonga)，覆盆子(rubusidaeus)，紅車軸草(trifoliumpratense)，水稻(oryzasativa)，線狀阿司巴拉妥(aspalathuslinearis)，洋薔薇(rosacentifolia)，迷迭香(rosmarinusofficinalis)，黑麥(secalecereale)，鼠尾草(salviaofficinalis)，五味子(schisandrachinensis)，沙棘(hippophaerhamnoides)，芝麻(sesamumindicum)，薺菜(capsellabursapastoris)，合歡花(albiziajulibrissin)，鹼蒿(artemisiaabrotanum)，留蘭香(menthaspicata)，小麥(triticumaestivum)，鈍頂螺旋藻(spirulinaplatensis)，挪威雲杉(piceaabies)，貫葉連翹(hypericumperforatum)，楊桃(averrhoacarambola)，甜葉菊(steviarebaudiana)，草莓(fragariaananassa)，向日葵(helianthusannuus)，草木樨(melilotusofficinalis)，除蟲菊(tanacetumcinerariifolium)，柑橘(citrusreticulata)，百裡香(thymusvulgaris)，山柑藤(salvadorapersica)，纈草(valerianaofficinalis)，香草(vanillaplanifolia)，馬鞭草(verbenaofficinalis)，香堇菜(violaodorata)，核桃(juglansregia)，豆瓣菜(nasturtiumofficinale)，西瓜(citrulluslanatus)，小麥(triticumaestivum)，野茶樹(camelliasinensis)，山楂(crataegusrhipidophylla)，紅花百裡香(thymusserpyllum)，白柳(salixalba)，維吉尼亞州金縷梅(hamamelisvirginia)，板藍根(isatistinctoria)，寧夏枸杞(lyciumbarbarum)，苦艾(artemisiaabsinthium)，歐番草(achilleamillefolium)，南美紅檀(hymenaeacourbaril)，依蘭香(canangaodorata)，鬆口蘑(tricholomamatsutake)，或它們的組合。可以理解，這些提取物也具有一定程度的抗菌活性，在某些實施例中增強抗微生物劑的功效。活性的有機化合物通常被用於本發明的配方中，佔本發明的配方總重量的0到1％，在一些實施例中高達總重量的5％。雖然這些活性物質往往是更能耐受傳統的化妝品加工條件，且在許多情況下，與卵孵化蛋白和天然產物提取物不同，其適合被包含於水相或親脂相中，可以理解的是，在一些實施例中的這些活性有機化合物，通過一個c相或其他，在乳液形成之後，被單獨地加入到乳液中。
本發明的化妝品易於配製成水性化妝品(water-basedcosmetic)，例如包括爽膚水(toner)，噴霧(spraymist)，精華液(serum)，面霜(cream)，面膜(mask)，防曬霜(sunscreen)，清面乳(cleanser)，保溼霜(moisturizer)，浴用配置品(bathpreparation)，粉底液(liquidfoundation)，收斂劑(astringent)，剃鬚用品(shavingpreparation)，護髮產品(haircareproduct)，和其他護膚品，或者外用藥劑，例如包括消炎藥。在本發明的特定實施方式中，提供了一種化妝品，其包含諸如乳酸酯的植物性乳化劑(plantbasedemulsifier)，該植物性乳化劑，基本上不含矽樹脂(silicone-free)，浴用配置品不含礦物油，不含石蠟油(petrolatum)，且不含合成的對羥基苯甲酸酯類防腐劑(parabens)。乳化劑「基本上不含」這些化合物在這裡定義為這些化合物總共佔不到10％的乳化劑的重量百分比，本發明的配方很容易應用到人的皮膚，特別是且例如包括整張臉的區域，嘴、眼周圍的區域，前額、兩鬢、面頰或下巴；手；腳；頸部；頭皮；肘部；胸部；前臂；肩膀；腿；以及它們的組合。
本發明的化妝品目前存在難以在配製過程中保持蛋白質的活性的困難。一般來說，可以看出加熱和高剪切混合，這些化妝品配製的常規技術往往使活性蛋白變性。再者，活性蛋白容易出現微生物降解(microbialdegradation)，特別是當本發明的化妝品是在非無菌的條件下加工，並在的室溫下存儲時。本發明的化妝品的配方需要在配製過程中將卵孵化蛋白暴露於有限的範圍內的ph值、剪切混合和加熱的環境，以保持其中存在的卵孵化蛋白的活性。為了保持卵孵化蛋白活性，化妝品配製過程包括將所有化妝品構成相緩衝至ph值在5.6和8之間，在將卵孵化蛋白加入到那個相之前。緩衝在本領域經常使用，且包括添加酸，鹼，酸的鹽，或它們的組合以平衡乳液的水溶液或水相至所期望的ph值。可以理解的是，ph測定是常規技術，定量測定可以通過容量滴定法(volumetrictitration)或諸如可以從賽默飛世爾科技公司(thermofisherscientific)(walthamma，usa)購買的電位電極(potentiometricelectrodes)；定性測量採用石蕊試紙試劑盒。
雖然，為了保持蛋白的活性，將本發明的化妝品的ph值調整到5.6和7.9之間，部分抑制卵孵化蛋白的微生物降解，但抗微生物劑存在於本發明化妝品配方中以保持蛋白質的活性，針對配製過程中帶來的微生物並且針對在使用多劑量容器過程中，經受試者局部的和呼吸的接觸本發明的化妝品，各種微生物連續不斷地在化妝品中接種的情況。因此，本發明的多用途化妝品配方和儲存穩定的配方，包含廣譜抗微生物劑或抗微生物劑的組合。此處的廣譜的抗微生物劑被定義為，其具有抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌，以及與健康人體相關的真菌的活性。此處有效的抗微生物劑，例如包括苯甲酸(benzoicacid)，對羥基苯甲酸酯類(parabens)，水楊酸(salicylicacid)，石炭酸(carbolicacid)，山梨酸(sorbicacid)，烷基p-對羥基苯甲酸酯(alkylp-hydroxybenzoates)，對氯代間甲酚(p-chlorometacresol)，六氯酚(hexachlorophene)，氯化苯甲烴銨(benzalkoniumchloride)，氯化氯己啶(chlorohexidinechloride)，三氯對稱二苯脲(trichlorocarbanilide)，苯氧基乙醇(phenoxyethanol)，醯基肌氨酸(acylsarcosines)，穀胱甘肽(glutathione)，蘋果酸(malicacid)，酒石酸(tartaricacid)，抗壞血酸(ascorbicacid)，抗壞血酸鹽(ascorbates)，必需的植物油，變鏈素蛋白(mutacinproteins)，以及它們的組合。在本發明的一些實施例中，只存在天然來源的抗微生物劑。天然來源的抗微生物劑，例如包括，諸如乳桿菌(lactobacillus)、變形鏈球菌(streptococcusmutans)和明串珠菌(leuconostoc)的發酵濾液；沒藥醇(bisabolol)；桉油精(eucalyptol)；百裡香酚(thymol)；肌醇(inositol)；皂甙；和諸如日本金銀花(japanesehoneysuckle，lonicerajaponica)、羊蹄(yangti(rumexjaponicus))、苦參(kushen(sophoraflavescens))、睡蓮(candock)、野生牛至(wildoregano)、橙(orange)、鼠尾草(sage)、曼尼佛(manifoil)、錦葵(commonmallow)、川芎(chuanxiong(cnidiiofficinalemakino))、日本綠龍膽根(japanesegreengentian(swertiajaponicamakino))，沒藥醇(bisabolol)，百裡香(thyme)，當歸(danguii(angelicasinensis))，橙皮(orangepeel)，樺樹(birch)，問荊(fieldhorsetail)，絲瓜(dishclothgourd)，七葉樹(horsechestnuttree)，虎耳草(creepingsaxifrage(saxifragestolonifera))，山金車(arnica)，百合(lily)，艾蒿(mugwort)，牡丹(peony)，蘆薈(aloe)，梔子花(gardenia)和那些在文獻m.m.cowan,clinicalmicrobiologyreviews,12(4)oct.1999,p.564–582中詳述的植物的天然提取物，或者它們的組合。這些提取物通過臨床微生物學評論(clinicalmicrobiologyreviews,12(4)oct.1999,pages.573–574)中詳述的步驟來製得且通常採用一種諸如c1-c8的醇(c1-c8alcohol)、多羥基醇(polyhydricalcohols)、水和含水酒精(aqueousalcohols)的親水性有機溶劑。在一個特定的本發明實施例中，採用日本金銀花(japanesehoneysuckle)，根皮素(phloretin)(蘋果)，高良姜素(蠟菊(helichrysumaureonitens))作為天然來源的抗微生物劑，各自單獨或組合使用。可以理解地是，除了殺菌性能，天然提取物常常賦予本發明的化妝品一種香味。抗微生物劑在本發明的化妝品的多功能包裝中，在特定的實施例中，為總重量的0.1％～5％(重量)，可以理解地是，超過總重量的5％的抗微生物劑的量可以很容易地按照要求被列入。
本發明的化妝品在某些實施例中，ph緩至5.6到7.9之間的任一數值，且在另一些實施例中，緩衝至在6.5到6.8之間，然而在其他實施例中，緩衝至6.8到7.3之間。沒有打算要限定到一特定的理論，例如ph值促進諸如魚卵分離物的卵提取物和天然產物的提取物成分的穩定化和貯存穩定性。通過預先配製至少兩個組分，與可選的附加相一同促進本發明化妝品的配方的形成，所述的至少兩個組分包括水包油型乳液和油包水型或有機矽乳液的第二相，所述的附加相，例如含有諸如魚產卵分離物的活性卵提取物和/或天然產物提取物的第三相。或者，可以理解，卵孵化分離物或天然產物提取物其中一種或兩者很容易地分散在水包油型乳液、油包水型乳液、矽氧烷包水型乳液或血清製劑中。令人驚訝地發現，在添加活性卵蛋白提取物之前，各種相ph的緩衝對於保證最終的本發明的化妝品的貯存穩定性和蛋白在受試者皮膚上的活性是至關重要的。
水包油型乳液的小部分的相組分，例如包括油、蠟、酯、醚、黃油、甘油酯，或它們的組合物，如上文詳述。水包油型乳液的大部分的相組分，例如包括水、水溶性鹽(aqueoussalts)、潤溼劑和各種水溶性物質，如上文詳述。用於該系統的乳化劑包括離子型表面活性劑，非離子表面活性劑，如上文詳述，並且還包括卵磷脂，脂質體和油質體(oleosomes)。其他非必要的添加劑按照上文詳述可以很容易地給出，其包括粘度調節劑，乳化穩定劑，香料，諸如此類。在具體的實施例中，水包油型乳狀液的ph值為5.6至7.9之間。在某些實施例中，水包油型乳液的ph值為6.5和6.8。
油包水型乳液或有機矽包水型乳液的小部分和大部分的相組分的相對量可以變化，並且優選的，依賴於非離子型表面活性劑和有機矽衍生物作為乳化劑。粘度調節劑和/或乳化穩定劑，例如包括水溶性鹽，樹膠，蠟，以及它們的組合物，如上文詳述。在特定的實施例中，內相的ph調節為5.6至7.9之間。在某些實施例中，內相的ph值調節在6.5到6.8之間。可以理解，各種維生素，如維生素e，維生素k，諸如抗壞血酸葡糖苷的抗壞血酸衍生物，可以很容易地加入到上述的乳化相中的一個或兩個，或作為一個獨立的第三相。
本發明的化妝品可以很容易地通過如上文詳述的預混相的組合來形成，或者可選的，所有這些成分按照本領域的常規順序依次混合形成一個均一的混合物。本發明提供了一種改善皮膚外觀的方法，包括將本發明的組合物用於哺乳動物的皮膚，用量為每平方釐米皮膚1x10-6mg到0.1mg的所述分離物和2x10-7mg到0.02mg的所述不飽和脂肪酸，每周至少三次，以達到皮膚外觀的改善。
本發明化妝品的典型範圍總結如表1-3所示。應該理解的是，如在這裡詳述，其它常規的基礎配方，單獨的或者與含有不飽和脂肪酸和甾醇的天然產物提取物組合，可以很容易地採用本文詳述的方法被調整以穩定卵孵化蛋白。在這裡可使用的用於化妝品的各種常規的基礎配方參見：「化妝品配方」，第二版，2001年第8卷，諾伊斯出版社(isbn0-1855-1454-9)(e.w.flick,「cosmeticandtoiletryformulations」,2nded.,vol.8；2001,noyespublications,norwich,newyork,usa(isbn0-1855-1454-9).)。
表1.本發明的化妝品的水包油型乳液形式的典型範圍，其中百分比是總重量的百分比。在此提供三相或四相的形式。
三相配方
a-1相：
b-1相
c-1相
活性(0.034％的活性的卵孵化蛋白)0.001～10
活性(天然產物提取物)0.001～10
四相配方
a-2a相
a-2b相
b-1相
c-1相
活性(0.034％的活性蛋白質)0.001～10％
活性(天然產物提取物)0.001～10％
*-ph調節也可以繼a相和b相混合之後進行，然而要在加入c-1相之前。
**-需要一些數量的抗微生物劑，通常佔總重量0.1-5％的多用途的非消毒的配方。
表2本發明的化妝品的有機矽包水型乳液形式的典型範圍，其中的百分比為總重量的百分比。
a相
b相
c相
活性(0.034％的活性蛋白質)0.001～10％
活性(天然產物提取物)0.001～10％
表3本發明的化妝品的血清配方的典型範圍，其中的百分比為總重量的百分比。
a相
b相
增溶劑0.1～10％
非極性的活性有機化合物0～1％
c相
活性(0.034％的活性蛋白質)0.001～10％
活性(天然產物提取物)0.001～10％。
實施例1
經配製該三相之後來製備一美容霜(cosmeticcream)。a相經加熱至75-80℃，並充分攪拌以形成均勻的混合物。將b相在室溫下置於一個獨立的容器中進行預混合，並在40°
c或以下的溫度添加到a相。將相c依次添加到所得到的a相和b相的混合物，並充分攪拌直到形成均勻的霜。得到均勻的且穩定的霜。
實施例2
提供了一種美容霜，其中魚卵蛋白分離物和天然產品提取物都是a相的組分，而不是像每一個實施例1中魚卵蛋白分離物和天然產品提取物存在於一個獨立的c相。通過在室溫下形成a相以避免蛋白變性，得到了一種類似的霜。
比較例
製備與實施例1進行比較的組合物(比較例a)，其不含魚卵蛋白分離物。另一種組合物不含天然產物提取物(比較例b)。也製備了既不含魚卵蛋白分離物又不含天然產品提取物的對照配方(比較例c)。40個人的研究組被分成4組，每組人每天使用實施例1的霜或比較例a-c的任意一種達12個星期。測量每一個受試者的皮膚的基礎彈性，並且測得的研究結論基於以比較例c為對照標準，實施例1組合物與比較例a-c相比顯示出優越的緊實度和光滑度。所有的組合物被標準化以達到這樣的水平：每次在每平方釐米皮膚上使用1x10-6毫克的分離物(如有)和2x10-7毫克的不飽和脂肪酸(如有)。
實施例3
新鮮的，未受精的鮭魚(安大略鮭魚(salmosalar))卵，其獲取自處於生殖期(晚秋)的雌性，將其放置於冰上，並且最好是立即製備提取物。在不破壞卵膜的情況下，可以在冷凍保護劑(例如1.5m1,2-丙二醇和0.2m蔗糖)中冷凍乾燥的卵。冷凍方式可以是逐漸地(-1–c./min)至-80℃。在整個提取物製備的過程中，卵應當被解凍並置於冰上。
將卵放在含有蛋白酶抑制劑(10μg/ml)hbss或海水中洗兩次。去除清洗溶液，將卵溶解並在一個預冷凍的杜恩斯玻璃-玻璃勻漿器(dounceglass-glasshomogenator)進行勻漿。將溶解產物轉移到貝克曼超純聚合物離心管(beckmanultraclearpolymercentrifugetubes)(5ml)，同時避免轉入卵殼，然後在採用sw55t1轉子的貝克曼離心機中，4℃以15,000g的轉速離心15min。由此得到3個部分，上層部分脂質，中間部分細胞質和包含了卵殼和核碎片的底層部分。中間部分細胞質是待收集的提取物。該提取物預計將含有最多的胞內的細胞器，包括線粒體、溶酶體和過氧化物酶體，該提取物應當是清澈的和粘稠的，並且有橙色的色彩。添加蛋白酶抑制劑(10μg/ml貯存物)，並且提取物保持在-80–c。收集斑馬魚的胚胎的中囊胚，去除液體，並且冷凍至-20℃。為製備該提取物，將胚胎放置於冰上解凍，將其溶解，並採用杜恩斯玻璃-玻璃勻漿器(dounceglass-glasshomogenator)在少量的hbss或海水(最好小於50％液體v/v)中進行勻漿。該溶解產物經一個無菌的亞麻布過濾，並且在採用了sx4250轉子的貝克曼x-22r離心機中，4℃，以5,000的轉速離心20min。收集該細胞質提取物(上清液)，且添加蛋白酶抑制劑(10μg/ml)。該提取物可以被微孔過濾(0.22微米的milliq除菌過濾器)。該提取物被置於-80℃。該提取物的ph採用石蕊試紙來檢測，其蛋白濃度通過bradford檢測法來測定，滲透度通過滲壓計來測定。
該通用程序適用於製備來源於海膽、蝦、魚蛋/卵或青蛙卵的提取物。簡略地講，妊娠的雌魚剛產下卵不久，通常在黎明(2-4am)，收集它們的卵，該妊娠的雌魚處於產卵程序中，在產卵之前的6-8小時注射hcg激素(1ml/kg)，或者來自妊娠的青蛙。將卵/蛋冷凍乾燥或冷凍至-20℃或新鮮使用。從不同種類的魚收集卵。對於海膽，0.5mkcl注射到嘴巴周邊以引發卵的脫落。通過將蛋/卵破碎(細胞破碎儀或dounce-勻質器)來製備該提取物或在不同的速度離心以分離全部含量的細胞質，帶有/不帶有卵殼(透明帶)，帶有/不帶有核/胞液，帶有/不帶有細胞器，帶有/不帶有脂質。可以進行進一步的分餾來分離一個或多個mrna、蛋白質、小肽、碳水化合物和脂質。卵中的脂肪酸的主要成分是油酸、亞油酸和ω-3脂肪酸。
採用上述的操作程序來獲得鮭魚卵提取物，該鮭魚卵提取物具有非常高的蛋白質含量，該蛋白質含量範圍100-380mg/ml，ph在6.4-6.8之間，並且滲透度大約為350mosm。該提取物應當是清澈的和粘稠的，並且不可過濾的(通過0.45微米的milliq過濾器)。該提取物中的蛋白質，因其高蛋白含量和低ph，其可以通過添加水或具有低緩衝容量的含水的溶液被沉澱下來。提取物可以通過添加鹼性物(每ml提取物種添加1-3μl1mnaoh)來調節ph值至7.0，因此，其在水或含水溶液中稀釋是可以的。斑馬魚提取物的蛋白質濃度範圍23-26mg/ml，ph在6.4-6.8之間，並且滲透度在80-150mosm。該提取物是清澈的和不粘稠的，可過濾的且在水中能容易地以各種稀釋比例被稀釋。
實施例4
凝膠過濾-純化加上親和性-純化得到的鮭魚的魚卵的內蛋白酵素(zonase)通過一個最終的色譜分析程序可以被進一步純化達到序列級的純度。該程序用的是pbe94柱子，tris-醋酸緩衝液(10mm,ph9.0)，隨後的洗脫液是具有鹽梯度(高達1mnacl鹽)的該緩衝液。該步驟增加了魚卵的內蛋白酵素(zonase)的催化活性達高出7.6倍，714倍的整體純化，和起始材料的28％的產率。該純化步驟使得魚卵的內蛋白酵素(zonase)的蛋白特性保持完整，作為一個28kda的半族(moiety)。因此，該步驟不從該魚卵的內蛋白酵素(zonase)製備中去除無關的、主要蛋白汙染物。對於存在於孵化液和「魚卵的內蛋白酵素(zonase)粗產品」中的魚卵的內蛋白酵素(zonase)半族，純化的魚卵的內蛋白酵素(zonase)的分子量與通過westernblotting技術檢測得到的相同。
顯然，在第三次和最後的色譜分析程序中發生的是小的、汙染的多肽被去除了。這些多肽似乎是周圍帶有很多殘基的寡肽，最可能來源於卵殼和/或來源於鮭魚胚胎。這些多肽汙染物似乎在魚卵的內蛋白酵素(zonase)的催化中發揮了抑制性作用，因為他們的去除增加了魚卵的內蛋白酵素(zonase)的催化活性。並且，他們的存在幹擾了該魚卵的內蛋白酵素(zonase)產品的edman-測序的第一步。在這第三個純化步驟中，兩種形式的魚卵的內蛋白酵素(zonase)結合到柱子基質上的方式似乎有一些不同。然而，兩種形式在它們的n-末端都有相似的胺基酸序列。
來源於cnbr-產生的多肽的部分胺基酸序列確定了魚卵的內蛋白酵素(zonase)作為獨立的蛋白。從結構分析獲得的啟示：魚卵的內蛋白酵素(zonase)可能具有明顯的催化和底物結合域，這些能解釋它們對鈣-螯合劑的敏感性，當其作用於大分子(生理學的)底物(結合到被抑制的，因此催化被間接地抑制)，也解釋了它們對於絲氨酸蛋白抑制劑的敏感性，當其作用於小的底物(催化被直接抑制)。
實施例5
魚卵的內蛋白酵素(zonase)和白細胞凝集素(leukolectin)都從鮭魚孵化液中純化得到。為了提高孵化液的蛋白濃度，鮭魚卵在孵化之前被轉移到最少量的水中。可以通過提高(室)溫度或者通過脫氧作用(oppen-berntsenetal.1990,aquaculture,86,pp.417-430)來誘導高度同步的孵化，其產生了粗製魚卵的內蛋白酵素(zonase)和相關蛋白高度濃縮的配製品。
魚卵的內蛋白酵素(zonase)的初始純化涉及通過紗布(cheesecloth)過濾孵化的鮭魚卵。該濾液在被解凍和應用於進一步的蛋白純化之前，可以被冷凍數年，且不會有魚卵的內蛋白酵素(zonase)顯著的降解。這一事實大大地簡化了起始材料的生產，該起始材料用於純化鮭魚的魚卵的內蛋白酵素(zonase)和相關蛋白，包括白細胞凝集素(leukolectin)。
下一個、任選的步驟涉及到將蛋白過濾物加入到4m尿素進行調節，以分離鮭魚卵殼的碎片，這使得可以通過低速度離心(15,000g的轉速，兩次，離心15min)將鮭魚卵殼的碎片連同外源的碎片一起去除。該材料沒有顯示出堵塞柱子的現象，這是經與上述的不同的方法製備得到的粗產品的特性。該粗製的蛋白配製品適用於通過傳統的色譜技術來純化。
孵化液體中的白細胞凝集素(leukolectin)可以連同魚卵的內蛋白酵素(zonase)被分離。從被部分純化的魚卵的內蛋白酵素(zonase)配製品(如上述)，白細胞凝集素(leukolectin)可以通過排阻色譜法(exclusionchromatography)被分離出來，因為魚卵的內蛋白酵素(zonase)的天然形式遠大於白細胞凝集素(leukolectin)。第一次分離，使用了superdex16/60柱子，隨後，可以通過親和色譜法過苄脒-瓊脂糖柱子(benzamidine-sepharosecolumns)來去除魚卵的內蛋白酵素(zonase)。
對於大批量的製備，使用超濾也是適用的，因為魚卵的內蛋白酵素(zonase)的天然形式不像白細胞凝集素(leukolectin)基本上不穿過體積排阻為100kda的超濾膜。
使用的緩衝液是毫克分子(millimolar)的tris，其ph大約為中性或弱鹼性(ph7.5-8.5)，其含有5mmnacl。白細胞凝集素(leukolectin)被發現與魚卵的內蛋白酵素(zonase)一同共-純化。該新蛋白質的體積，在天然條件下經過色譜法估算，僅不足30kda。
該凝集素的mw估計在25-30kda左右。類似的鮭魚的凝集素的ph估計大約為6.5。觀察到的pis(riste,未出版)，其在鮭魚的卵周凝集素(salmonperivitellinelectins)的ph值範圍為6.5-6.9，其在鮭魚白細胞的凝集素(salmonleukocyticlectins)(該凝集素通過westernblotting的技術被識別)中的ph值範圍在6.4-6.6。
實施例6
評價採用了上述的配方的日霜和眼霜形式的化妝品的安全性和有效性的研究歷時12個星期。總共挑選了40個女性受試者，年齡範圍在37-60歲。這40個參與者全部完成了該研究。
在該研究的條件下，測試材料以日霜和眼霜的方式被識別，顯示其改善面部細線、皺紋、色素沉著、膚色均勻、皮膚透明度、皮膚鬆弛度和粗糙的觸感，經過12個星期的使用期。另外，該測試材料能很好地被接受，當應用到皮膚上，其沒有顯示出導致明顯真皮刺激的可能性。
每天使用兩次，在隨後的第2、6和12周進行觀測，採用packman和gans計分來測定面部的表面線條在統計上顯著的改善，採用直觀類比標度(visualanalogscale(vas))計分來測定面部色素沉著，膚色均勻，皮膚透明度、皮膚鬆弛度和粗糙的觸感在統計上顯著的改善。
在任何後處理期間，從統計學顯著性來說，沒有觀測到刺激(紅斑、水腫、乾燥、刺痛、燃燒的和緊繃/幹的感覺)的增加。
實施例7
評價抗微生物防腐劑抵抗在採用了上述公開的配方的日霜和眼霜形式的化妝產品中的微生物汙染的有效性的研究，在2個4周的研究周期中進行。研究方法採用了ctfa微生物指南，第20部分，m-3，水溶性個人護理產品的保藏測試方法和usp34，第61部分，中和/去除抗菌活性。試驗菌包括金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，大腸桿菌(escherichiacoli)，綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)，白色念珠菌(candidaalbicans)和黑麴黴(aspergillusniger)。對於第2類產品，該防腐劑被認為在受試樣品中是有效的，如果a)活菌含量在第7天顯示出不低於3.0log級數(99.9％)的降低，相對於初始計數，並且在整段測試期沒有增加，和b)活菌和黴菌的含量在第7天不低於1.0log級數的降低(90％)，相對於初始計數，並且在整段測試期沒有增加。
研究結果顯示，該日霜和眼霜符合第2類別產品的接受標準。
實施例8
進行了一項研究以確定採用上述公開的配方的日霜和眼霜形式的測試材料的導致黑頭粉刺的能力，通過評價該測試材料是否導致黑頭粉刺，經過四周的在閉合的貼劑條件下重複地應用，相對於陰性對照(未塗覆的區域)。為了驗證本研究，乙醯化的羊毛脂醇用作陽性對照。該測試在4周的研究周期過程中進行。總共15個受試者，年齡介於22到45歲之間，被選中參加本研究。15個受試者都完成了本研究。毛囊的活檢標本從測試位置收集的的評價表明，測試材料和對照材料被引出0.5的整體評價分數(1-24％小角質)。測試材料和陰性對照的每個毛囊的微黑頭粉刺的平均比率是1％，陽性對照的是6％。測試材料和陰性對照的毛囊的微黑頭粉刺的比例沒有顯著性差異，然而陽性對照相對於陰性對照顯示出顯著的更高比率。
該研究表明在研究期間沒有報導負面的體驗。測試材料沒有展示出導致黑頭粉刺的能力。用每一種測試材料處理的位點和未經處理的陰性對照的貼劑所應用的位點，每一個毛囊的微黑頭粉刺的比率沒有統計差異。
實施例9
進行了一項研究以確定採用上述公開的配方的日霜和眼霜形式的測試材料的真皮刺激和敏感的可能性。測試在8周的研究期內進行。該研究啟用了225位受試者。11位受試者沒有完成研究，未完成的原因與測試材料無關。總共215位受試者完成了該研究。
通過將帶有測試材料的貼劑應用到經異丙醇擦拭且被允許進行乾燥的測試區域來進行測試。該測試材料被應用於上背(肩胛骨之間)且使其保持直接的皮膚接觸達24小時。在周一、周三和周五，貼劑被應用於同樣的位點，在誘導期間總9次使用。這個時間安排可以被修改以允許錯過的拜訪或假期。如果受試者不能在指定的測試日期匯報，該測試材料在誘導期間連續兩天使用和/或在誘導期間的最後增加一個化妝日。這些位點的真皮敏感程度受到監督技術人員的打分，在周二和周四受試者去除了貼劑後的24小時，和在周日去除貼劑後48小時，除非如上述的貼劑的時間安排被改變。
根據下述的計分系統對這些位點進行打分：
真皮計分量表
0沒有明顯的皮膚反應
+勉強察覺紅斑
1+溫和的紅斑
2+清晰的紅斑
3+嚴重的紅斑和水腫
4+帶有起泡的紅斑和水腫
如果「2+」反應或更強的發生了，那麼將該測試材料應用於臨近的未使用過的位置。如果在新的位置發生了「2+」反應或更強的，那麼受試者在該誘導期間不會被再次貼塗，但是在該研究的適當時候會被挑戰。貼塗位置的得分低於「2+」可能已經被改變，任憑研究主管處理。
之後約2周的測試期間，挑戰的貼劑被應用於背上的之前未處理的測試位點。24小時後，貼劑被crl技術人員去除且評價測試位點的真皮反應。24小時和48小時，測試位點被重新評價。在該研究的挑戰期間，顯示了反應的受試者可能被召回，觀察96小時。
基於214受試者的測試人群且在該研究的條件下，眼霜測試材料沒有顯示出引發真皮刺激或敏感的能力。
實施例10
進行了一系列的研究以確定採用上述公開的配方且在該配方中添加了額外的防曬指數(spf)成分的日霜和眼霜形式的測試材料的真皮刺激和敏感的能力。spf被定義為在被防護的皮膚上產生最小紅疹所需要的能量數量與在未處理的皮膚上產生最小紅疹所需的能量數量的比例，計算式如下：
i.進行了一項研究以評價組合了採用上述方法配製的日霜的防曬產品的效率，通過採用國際防曬指數(spf)測試方法(2006年5月)在統計學條件下來確定防曬指數(spf)。一個標準的防曬配方與測試材料同時被檢測。標準是二甲胺基苯甲酸戊酯氧/氧苯酮spf標準(padimateo/oxybenzonespfstandard(colipap2))(colipap2)。測試/對照材料應用的位點是在背部，且被隨機設置以使得接受到單獨的測試材料的治療背部區域對於所有受試者來說是不同的。總共10位男性和女性受試者，年齡在25歲到57歲之間且基本上身體健康，被選中參與這項研究。在整個研究期間，沒有不良事件的報導。
ii.進行了一項研究以評價組合了採用上述方法配製的日霜的spf30的防曬產品的效率，根據日本化妝品行業協會(jcia)的uva防護的檢測標準(01/01196)，在統計學條件下，確定紫外線a(uva)防曬因子(pfa)。總共10位成年受試者參與了這項研究。一個疝氣弧多埠陽光模擬器(xenonarcmulti-portsolarsimulator)(150w,model15s,solarlightcompany,philadelphia,pa)，具有uva和uvb波段(290-400nm)的紫外線連續的放射波譜，其被用於紫外線輻射的來源並且被過濾以提供一個基本的像陽光一樣的波譜。採用了下面的過濾器以保證合適的波譜輸出：schottwg33513mmandug1111mm。光輸出(lampoutput)在每一個受試者受到uv強度儀表(uvintensitymeter)(modelpma2100,solarlightcompany,philadelphia,pa)測試之前被及時測量。陽光模擬器的光輸出的波譜分布每年校正一次。
黑化是暴露於uva後在皮膚上觀察到的棕灰色(brown-gray)到棕黑色的反應，是因為光-氧化反應，在該反應中無色黑色素前體被氧化以形成著色的黑色素。最小的持久的黑化(mppd)被定義為在未處理的皮膚上誘發這樣的反應所必須的uva光輻射劑量。在測試階段之前，每個受試者的mppd是通過uv光曝露的漸進的等比數的確定。uva輻射的劑量的增加倍數為1.25.輻射後2到4小時，根據下面的計分系統來評價這些位點的黑化情況。
0陰性，沒有明顯的反應；
±勉強察覺(最小)黑化；
1+明確的(中等的)黑化；
2+顯著的或界限清楚的黑化。
用手術記號筆在受試者肩胛骨和腰圍之間、中線兩側的後背上畫出尺寸為5*10cm的測試位點的輪廓。這些區域被指定為測試材料或防曬標準。鄰近的位點被指定為在未處理的皮膚上同時進行mppd測定。經產品應用後，每個測試區域被再分為大約1平方釐米位點，用於確定連續的uva光曝露。
測試材料或標準的一個0.1ml份被應用於合適的測試位點且使用指套使其平均地延伸到整個位點(相當於2μl/cm2)。使用後，15分鐘到30分鐘之間開始對位點進行輻射。基於之前確定的未受保護的皮膚的測定的mppd和測試材料或標準的預期pfa，為每一個處理位點選擇曝露時間。在曝光後2到4小時對所有的測試位點進行評價以測定最小的持久黑化反應。
uva的保護因子(pfa)被定義為在受防護的皮膚上產生一個mppd所需要的時間量除以在未處理的皮膚上產生一個mppd所需要的時間量的比率，計算式如下：
標準誤差需要在測試值的10％以內。
被輻射處理的位點的pfa值的整數值確定了uva的防護級別。由於所有pfa值都大於或等於2，採用下面的分類方法來確定保護級別：
遞交的測試材料spf30的日霜在10個受試者中表現出的平均uva防護值為pfa6.5。
iii.進行了一項研究以評價採用上述配方配製而成的含有廣譜防曬功能的防曬活性物日霜測試材料，通過按照fda(聯邦公報/vol76,no117/星期五,6月17日，2011年/規則和規定)給出的方法測定其關鍵的波長。
防曬產品的吸光度是從290nm開始跨越整個uv波長的總和，直到總和數達到90％的該防曬產品在紫外波長範圍(290-400nm)的總吸光度。吸光度的總和達到總吸光度的90％時的波長被定義為關鍵波長(criticalwavelength)並且被認為是防曬保護的寬幅的度量衡。當關鍵波長大於370nm時，具有它們在uva中的吸光度的一個重要部分的防曬產品被歸類為廣譜(broadspectrum)的防曬產品。
測定每一個波長在整個uv光譜區(290-400納米)的光譜透射率(spectraltransmittance)。每間隔1nm測量一次透射率的值。
測試材料帶有spf的日霜的關鍵的波長是371.00nm，該波長滿足了「廣譜」標籤所要求的最低370nm的關鍵波長標準。
進行了一項相似的測試研究以評價採用上述配方配製而成的含有廣譜防曬功能的防曬活性物日霜測試材料，通過按照colipa的2011年的指南來測定其體外uva防護因子(uva-pf)、spf/uva-pf比率和該日霜的關鍵波長。
本說明書中提及的任何發明文獻或出版物都在此通過引用的方式併入，併入的程度如同任何一個單獨的出版物被特定地和單獨地說明以通過引用的方式被併入。
上述的說明書是本發明特定實施方式的舉例說明，它不應當成為實施本發明的限制。