抗菌肽Protegrin-1在防治豬藍耳病中的應用的製作方法
2023-12-04 19:19:26 1
抗菌肽Protegrin-1在防治豬藍耳病中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於醫藥【技術領域】，具體公開了抗菌肽Protegrin-1在製備抗豬藍耳病藥物中的應用。本發明首先根據已報導的Protegrin-1的胺基酸序列，化學合成抗菌肽Protegrin-1，然後通過抗大腸桿菌DH5α實驗驗證其抗菌活性，並利用Marc-145細胞，通過qRT-PCR、Western-Blot、細胞上清TCID50檢測及IFA等方法研究其對HP-PRRSV的抗病毒作用，進一步在病毒吸附和進入細胞兩個過程闡述其抗病毒機制。結果發現Protegrin-1對HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，有望成為一種新型的防治豬藍耳病的藥物。
【專利說明】抗菌肽Protegr in-1在防治豬藍耳病中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】，具體涉及抗菌肽Protegrin-1在防治豬藍耳病中的應用。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸症候群(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸症候群病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse, PRRSV)引起。該病最早於1987年在美國爆發，隨後蔓延到歐洲，我國於1996年分離到該病毒。目前，根據基因組序列和抗原性差異，將PRRSV分為兩種基因型，一種以Lelystad Virus (LV)毒株為代表的歐洲型，另一種以ATCC VR-2332毒株為代表的美洲型。在我國，PRRSV主要以美洲型為主，但據報導也分離到歐洲型毒株。2006年，我國爆發了豬高熱病，對養豬業造成嚴重的經濟損失，後來將此毒株定義為高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSV )。PRRS主要引起妊娠母豬流產、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年齡階段豬特別是仔豬呼吸道症狀，特徵性病變為間質性肺炎，死亡率極高，是一種高度接觸性的全球性的重要傳染病。
[0003]PRRSV屬於尼多病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，電鏡下觀察病毒粒子呈球形或橢圓形，有囊膜。病毒基因組為一條單股正鏈RNA，全長約為15Kb，含有5'和3'非編碼區，中間為10個開放閱讀框(openreading frame, ORF),其 中 0RF2-7 分別翻譯病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它們不僅是病毒粒子的主要組成部分，而且在病毒粒子的包裝、成熟、免疫逃避及抗體誘導中產生重要的作用。
[0004]PRRSV的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRSV難於防控主要表現在以下幾方面:(1)嗜巨噬細胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs) , PAMs是免疫細胞,破壞PAMs,從而破壞機體免疫系統,從而引起免疫抑制；(2)抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個原因，疫苗沒有交叉保護力；(3)抗體依賴性增強，PRRSV的感染會刺激機體產生抗體，但低效價的抗體不但不能中和病毒，反而對病毒的增殖有促進作用；(4)病毒持續性感染，PRRSV感染後，能夠長時間在豬體內檢測到病毒血症。(5)混合感染，目前臨床上混合感染特別是圓環病毒、副豬嗜血桿菌等與PRRSV的混合感染使PRRSV防控難上加難。
[0005]目前PRRSV防控主要有滅活疫苗和弱毒疫苗，臨床上用的較多的是弱毒疫苗。其中滅活疫苗有如下缺點:(1)需要大劑量接種或應用濃縮抗原，免疫期短，常需強化接種；
(2)不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱；(3)產生完全免疫力需要2-3周，不利於緊急預防接種與降低疫苗費用；(4)存在滅活不徹底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返強、重組及潛在感染的危險。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越來越多的問題。
[0006]抗菌肽Protegrin-1 (PG-1)是從豬白細胞中分離得到的由18個胺基酸殘基組成的豬源抗菌肽，二級結構為β -摺疊，4個半胱氨酸形成2個二硫鍵對其二級結構的維持及抗微生物學活性起著非常重要的作用，據報導，這2個二硫鍵的去除能夠顯著性地降低PG-1的抗微生物學活性。目前已證明PG-1對革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌、真菌以及少數囊膜病毒有抗微生物學活性，其中包括HIV、登革熱病毒。PG-1是目前被證明為最具潛力成為抗生素的替代物之一。
[0007]豬藍耳病對養豬業造成嚴重的經濟損失，傳染性極強。抗菌肽PG-1對PRRSV病毒是否具有抗病毒作用，至今還未有報導。故本發明使用PG-1研究其對PRRSV的抗病毒作用，以期尋找一種很好的抗PRRSV藥物。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在於提供抗菌肽Protegrin-1在製備抗PRRSV病毒藥物中的應用。
[0009]本發明的另一目的在於提供抗菌肽Protegrin-1在製備防治豬藍耳病藥物中的應用。
[0010]本發明上述目的通過以下技術方案予以實現:
本發明通過實驗發現抗菌肽Protegrin-1能夠明顯抑制豬繁殖與呼吸症候群病毒吸附細胞，為通過藥物治療增強對豬繁殖與呼吸症候群病毒的防控提供有力支持。因此，本發明提供一種抗菌肽Pr otegrin-1在製備抗豬繁殖與呼吸症候群病毒藥物中的應用，同時本發明提供一種抗菌肽Protegrin-1在製備防治豬藍耳病藥物中的應用。
[0011]一種抗豬繁殖與呼吸症候群病毒的藥物製劑，包括有效量的抗菌肽Protegrin-1和藥學上可接受的輔料。優選地，所述藥物製劑為注射製劑或口服製劑。更優選地，所述注射製劑為凍乾粉針劑；所述口服製劑為散片劑、膠囊劑或顆粒劑。
[0012]本發明首先化學合成生物活性分子抗菌肽Protegrin-Ι,其胺基酸序列為SEQ IDN0.1所示，胺基酸序列第6位和第15位Cys、第8位和第13位Cys形成2對二硫鍵，C端醯胺化修飾。然後驗證其抗菌活性，進一步利用Marc-145細胞研究其對HP-PRRSV的抗病毒活性並通過病毒吸附細胞和進入細胞兩個過程研究PG-1的抗HP-PRRSV機制。具體實驗設計如下:
1、首先化學合成PG-1，然後測定其抗大腸桿菌活性，並篩選出PG-1活性最高的溶劑。
[0013]2、PG-1細胞毒性試驗。AlamarBlue (購自Invitrogen公司)作為活細胞代謝指示劑，在線粒體酶促還原反應下會產生可測量的螢光代謝產物，通過測定其螢光強度可監測細胞活性。使用多功能酶標儀分別讀取540nm激發光和590nm發射光螢光值，製作PG-1細胞毒性圖。
[0014]3、PG-1抗病毒試驗。用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養Marc-145細胞至匯合度為60-70%，棄去培養液，PBS洗3次，將含HP-PRRSV MOI=0.1 (空斑形成單位PFU=0.7 X TCID50,感染複數MOI=病毒數/細胞數)的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C繼續培養5h，PBS洗3遍，將含不同濃度的PG-1的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，收集上清做TCID5tl檢測，另外進行qRT-PCR及Western-Blot檢測。
[0015]4、PG-1 抗病毒間接免疫突光試驗(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA)。抗病毒試驗方法同上，收集細胞，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS洗lOmin，10%Triton_100穿孔15min，PBS洗lOmin，然後用PBS稀釋1%BSA封閉30min，加入抗PRRSV病毒N蛋白的一抗，室溫反應Ih,再加入抗鼠二抗作用lh, Hoechst染核5min, PBS洗IOmin,然後在突光顯微鏡下觀察PG-1抗病毒效果。
[0016]5、PG-1抗病毒機制研究。(I) PG-1是否通過影響HP-PRRSV吸附Marc-145細胞從而達到抗HP-PRRSV的目的。首先，在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然後以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，並加入濃度梯度的PG_1，4°C孵育2h，孵育完後，用PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然後在5%C02、37°C培養箱中培養24h，收集細胞對N基因做qRT-PCR和Western-Blot檢測。(2)PG_1是否通過抑制HP-PRRSV進入Marc-145細胞來達到抗HP-PRRSV的目的。首先，在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然後以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，孵育完後，用PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然後加入濃度梯度的PG-1的營養液在5%C02、37°C培養箱中培養6h，PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，收集細胞Western-Blot檢測，。(3)當PRRSV進入細胞4h後，PG-1是否還有抗病毒作用。首先，在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然後以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培養箱中培養4h，PBS洗3次，分別將含濃度為20、30、40mg/L的PG-1的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養6h，PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液(不含PG-1)繼續培養24h，棄去營養液，PBS洗3遍，收集細胞Western-Blot 檢測。
[0017]6、統計學分析。以上所有試驗至少3次獨立重複，結果採用平均值和標準誤表示，使用泣t 來分析。所有統計分析均採用以八％ 作為具有顯著統計學差異的檢驗標準，分析軟體為SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
[0018]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
本發明最大的創新性在於首次使用PG-1來研究其對HP-PRRSV的抗病毒作用，並通過多種方法證明了 PG-1在Marc-145細胞水平對HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，為研製抗豬藍耳病的新型藥物奠定了基礎。
[0019]為了進一步研究PG-1的抗病毒作用，本發明還對PG-1抗HP-PRRSV的機制進行了研究。結果表明，PG-1的抗病毒作用是發生在HP-PRRSV吸附細胞過程中的。
[0020]為了增強PG-1的生物學活性，本發明在化學合成PG-1過程中對其C端進行了醯胺化修飾。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為PG-1抗大腸桿菌DH5 α活性圖；圖中ddH20 =PG-1溶解於0.01%冰乙酸的ddH20 中；PBS:PG-1 溶解於 0.01% 冰乙酸的 PBS 中；0.2M tris-Hcl 6.8:PG_1 溶解於 0.2Mtris-Hcl PH=6.8 緩衝液中；0.2M tris-Hcl 6.8/PBS:PG_1 溶解於 0.2M tris-Hcl PH=6.8PBS 緩衝液中；Contro1:100 μ L 濃度為 100mg/L Amp。
[0022]圖2為AlamarBlue檢測PG-1細胞毒性圖。
[0023]圖3為分別經不同濃度PG-1處理後的HP-PRRSV感染的Marc-145細胞上清中的病毒滴度圖。
[0024]圖4為分別經不同濃度PG-1作用36h後，N基因相對於內參基因HPRTl的表達水平圖。[0025]圖5為分別經20、30mg/L PG-1處理36h後，N蛋白表達水平圖。
[0026]圖6為分別經20、30、40mg/L PG-1處理36h後，對N蛋白的間接免疫螢光試驗圖；綠色為抗PRRSV N蛋白顏色，藍色為Hoechst染細胞核顏色。
[0027]圖7為PG-1抗病毒機制一病毒吸附細胞過程中，N基因相對於內參GAPDH的表達水平圖。
[0028]圖8為PG-1抗病毒機制一病毒吸附細胞過程中，N蛋白Western-Blot檢測圖。[0029]圖9為PG-1抗病毒機制一病毒進入細胞過程中，N蛋白Western-Blot檢測圖。
[0030]圖10為PG-1抗病毒機制一病毒進入細胞4h後，N蛋白Western-Blot檢測圖。
【具體實施方式】
[0031]以下結合說明書附圖和實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。
[0032]本發明實施例中所用的病毒株為HP-PRRSV (高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒)，該毒株由華南農業大學獸醫學院動物傳染病實驗室獲得，HP-PRRSV是致病性比較高的豬繁殖與呼吸症候群病毒的簡稱，對本發明不做任何限定。
[0033]實施例1 PG-1化學合成及抗大腸桿菌活性實驗
1、首先通過抗菌妝資料庫(APD)The Antimicrobial Peptide Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)查找豬源抗菌肽PG-1的胺基酸序列，如SEQ ID N0.1所示,將胺基酸序列發送至上海吉爾生化有限公司(http://glbetter.cn.1688.com/)進行合成，由於PG-1的β -摺疊結構對其生物學活性至關重要，而β -摺疊結構的形成依賴於PG-1中的2對二硫鍵，故在合成PG-1時一定要確保二硫鍵合成成功並準確定位。2對二硫鍵分別是第6位和第15位Cys、第8位和第13位Cys，並且為了增強PG-1的生物學活性，對其C端醯胺化修飾。HPLC 95%純度，合成30mg。合成後0.01%冰乙酸滅菌水稀釋成100mg/L，0.22 μ m過濾除菌，分裝_80°C保存。
[0034]2、PG-1抗大腸桿菌活性實驗。由於PG-1在弱酸性環境下才有活性且溶解性最高，為了使PG-1抗微生物學活性最高，將化學合成的PG-1粉末分別溶解於含0.01%冰乙酸的滅菌水、PBS及0.2M Tris-Hcl的滅菌水和PBS中，然後再研究其對大腸桿菌DH5 α的抗菌活性，篩選出PG-1活性最高的溶劑。
[0035]PG-1抗大腸桿菌活性實驗方法採用標準瓊脂孔穴擴散法。將疋coli DH5 a IOyL與55°C的LB固體培養基30mL混勻後塗布平板，待其凝固後，用直徑為3mm的滅菌的打孔器打孔，並加入100 μ L PG-1，同時加入等體積的溶解PG-1溶劑作為陰性對照，Amp (IOOmg/mL)2l.! L作為陽性對照。37°C培養箱中培養12h，當能看到明顯的抑菌圈時拿出並測量抑菌
圈直徑。
[0036]每孔加入200 μ L上述稀釋好的PG-1，同時設立氨苄青黴素陽性對照和0.01%冰乙酸的陰性對照，見附圖1。由圖1可知，當PG-1在0.01%冰乙酸的滅菌水中溶解時，抑菌圈最大，在0.01%冰乙酸的PBS中抑菌圈稍小，但在0.2Μ Tris-Hcl的滅菌水中溶解時幾乎沒有抑菌圈，故由圖1說明，為了使PG-1對大腸桿菌DH5a抑菌效果最好，須將PG_1溶解在
0.01%冰乙酸的滅菌水中。
[0037]3、篩選出使PG-1活性最高的溶劑後，將PG-1粉末稀釋成終濃度為100mg/L，0.22 μ m過濾除菌，分裝，並於-80°c保存。
[0038]實施例2 PG-1細胞毒性試驗
AlamarBlue (購自Invitrogen公司)作為活細胞代謝指示劑,在線粒體酶促還原反應下會產生可測量的螢光代謝產物，通過測定其螢光強度可監測細胞活性。用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養Marc-145細胞至60_70%，棄去培養液，加入含PG-1倍比稀釋的營養液作用36h，設定PBS對照組，然後加入10% (V/V)比例AlamarBlue繼續培養3h，使用多功能酶標儀分別讀取540nm激發光和590nm發射光螢光值，製作PG-1細胞毒性圖(見附圖2)。以PBS對照組細胞活性作為100%，倍比稀釋的PG-1處理的細胞的螢光值比上PBS對照組螢光值即為不同濃度下PG-1相對細胞活性，由圖2可知，當PG-1濃度為40mg/L時，其對Marc-145細胞沒有毒性，細胞活性100%，此濃度即為後面試驗的最大濃度。
[0039]實施例3 PG-1抗病毒試驗
1、在含10%胎牛血清的DMEM培養基的6孔板中培養Marc-145細胞至細胞匯合度70%時，棄去培養液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培養液中37 °C繼續培養5h。
[0040]2,PBS洗3遍，分別將濃度為20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，並設PBS對照組，PBS洗3遍，收集上清做TCID5tl檢測，見附圖3，由圖3可知，PG-1可顯著性地減少細胞上清中的病毒產量，抑制病毒釋放到細胞上清中；另外每孔加400 μ L Trizol，提RNA，做qRT-PCR檢測，見附圖4，由圖4可知，在轉錄水平上，PG-1可顯著性地降低N基因表達水平。
[0041]3、同上以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培養液中37°C繼續培養5h，PBS洗3遍，分別將濃度為20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，並設PBS對照組，收集ImL上清做TCID5tl檢測，棄去剩餘培養液，PBS洗3遍，
0.25%胰酶消化，裂解細胞，測蛋白濃度`，Western-Blot檢測，見附圖5，由圖5可知，在蛋白翻譯水平上，PG-1可明顯的降低N蛋白表達水平。故本實驗從多方面證明PG-1有很好的抗HP-PRRSV效果。
[0042]4、PG-1 抗病毒間接免疫突光試驗(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA)。在含10%胎牛血清的DMEM培養基的12孔板中培養Marc-145細胞至細胞匯合度70%時，棄去培養液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培養液中37°C繼續培養5h，PBS洗3遍，分別將濃度為20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，並設PBS對照組，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗lOmin，10%Triton-100 穿孔 15min，PBS 洗 lOmin，然後用 PBS 稀釋 1%BSA 封閉 30min，抗 PRRSV N 蛋白一抗室溫Ih,抗鼠二抗作用lh, Hoechst染核5min, PBS洗lOmin,進行IFA檢測,在突光顯微鏡下觀察PG-1抗病毒效果，見附圖6，由圖6可知，PG-1濃度為20、30、40mg/L時，抗PRRSV N蛋白螢光值明顯低於PBS對照組，表明PRRSV N蛋白幾乎沒有在細胞中表達，即說明PG-1抗病毒效果明顯,且當PG-1濃度為40mg/L時,抗病毒效果最明顯。
[0043]實施例4 PG-1抗病毒機制研究一HP-PRRSV吸附抑制試驗
1、在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然後以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，並分別加入濃度為20、30、40mg/L PG_1，4°C孵育2h。
[0044]2,PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然後在5%C02、37°C培養箱中繼續培養24h，棄去培養液，PBS洗3次，收集細胞，每孔加400 μ L Trizol,提RNA，對N基因做qRT-PCR檢測，見附圖7 ;裂解細胞，測蛋白濃度，Western-Blot檢測，見附圖8。結果表明PG-1能夠顯著性地降低N基因和N蛋白表達水平，且隨著PG-1濃度的升高，抑制效果更明顯，當PG-1濃度為20mg/L時，HP-PRRSV N蛋白表達水平檢測不到，說明在HP-PRRSV吸附細胞過程中，PG-1有很好的抗病毒效果。
[0045] 實施例5 PG-1抗病毒機制研究一HP-PRRSV進入抑制試驗
1、在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然後以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h。
[0046]2、PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然後分別加入濃度為20、30、40mg/L PG-1，在 5%C02、37°C培養箱中培養 6h。
[0047]3、PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，棄去營養液，PBS洗3遍，收集細胞Western-Blot檢測，見附圖9，由圖9可知，在HP-PRRSV進入細胞過程中，PG-1抗病毒效果不明顯，只有當PG-1濃度為40mg/L時，N蛋白表達水平有所下降，說明PG-1在HP-PRRSV進入細胞過程中抗病毒作用不明顯。
[0048]實施例6 PG-1抗病毒機制研究一HP-PRRSV進入4h後抑制試驗
1、在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然後以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培養箱中培養4h。
[0049]2、PBS洗3次，分別將濃度為20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養6h。
[0050]3、PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，棄去營養液，PBS洗3遍，收集細胞Western-Blot檢測，見附圖10，結果表明，當HP-PRRSV在37°C進入細胞4h後再用不同濃度PG-1處理，PG-1抗病毒效果不明顯，只有當PG-1濃度為40mg/L時，才有抗病毒效果，說明在病毒進入細胞4h後，PG-1抗病毒效果不明顯。
【權利要求】
1.抗菌肽Protegrin-1在製備抗PRRSV病毒藥物中的應用，其特徵在於，所述Protegrin-1的胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.抗菌肽Protegrin-1在製備防治豬藍耳病藥物中的應用，其特徵在於，所述Protegrin-1的胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求1或2所述應用，其特徵在於,所述的Protegrin-1的二級結構為β -摺疊，其胺基酸序列第6位和第15位Cys、第8位和第13位Cys形成2對二硫鍵，C端醯胺化修飾。
4.根據權利要求1或2所述應用，其特徵在於，所述的抗菌肽Protegrin-1使用劑量範圍為 20 mg/L ~40mg/L。
5.一種抗豬繁殖與呼吸症候群病毒的藥物製劑，其特徵在於，包括有效量的抗菌肽Protegrin-1和藥學上可接受的輔料。
6.根據權利要求5所述藥物製劑，其特徵在於，所述藥物製劑為注射製劑或口服製劑。
7.根據權利要求6所述藥物製劑，其特徵在於，所述注射製劑為凍乾粉針劑。
8.根據權利要求6所述藥物製劑，其特徵在於，所述口服製劑為散片劑、膠囊劑或顆粒劑。
【文檔編號】A61P31/14GK103623391SQ201310469273
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】劉小紅, 郭春和, 莫德林, 陳瑤生, 高進濤 申請人:中山大學