一種添加有纖維素酶生長豬專用酶及其製備方法

2023-11-06 07:13:42

一種添加有纖維素酶生長豬專用酶及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種生長豬專用酶及其製備方法，屬於飼料酶製劑領域。所述生長豬專用酶由以下重量份數的組分組成：中草藥粉0.5-2份，木聚糖酶20-40份，蛋白酶5-8份，果膠酶2-5份，纖維素酶8-16份，β-葡聚糖酶10-20份，中溫α-澱粉酶2-6份。其中纖維素酶的生產菌種為裡氏木黴(Trichoderma?reesei)601-17，保藏編號為CCTCC?M2013540，製備方法如下：斜面菌株培養獲得液體種子；發酵階段採用低溫、逐級接種相結合的方法；發酵液經離心，收集、濃縮、過濾、乾燥獲得纖維素酶。纖維素酶經過濃縮乾燥後其單位活性和活力進一步提高，有效的補充了內源酶的不足，促進營養物質的消化吸收，提高了飼料利用率。
【專利說明】一種添加有纖維素酶生長豬專用酶及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於酶製劑領域，具體涉及一種複合酶及其製造方法。
【背景技術】
[0002]前蘇聯科學家在早期斷奶仔豬日糧中添加澱粉糊精酶，使得日增重提高14.6%，碳水化合物消化率提高77.2%。據美國有關資料報導，Collier在早期斷奶仔豬日糧中補充酶製劑(含蛋白酶、澱粉酶、葡聚糖酶)，結果實驗組比對照組日增重提高了 25%，飼料轉化率提高了 15.5%。西德學者曾多次進行育肥豬添加複合酶製劑的實驗研究，在以大麥為主的日糧中，添加0.1%的複合酶製劑，結果為:實驗組比對照組生長速度提高5.1%，飼料利用率提高
4.1%。可見，澱粉酶能顯著提高畜禽對飼料的消化吸收，促進生長，降低飼料成本，並且作為一種綠色飼料添加劑，它的使用具有安全性，有利於畜牧業生產走上經濟節約型的發展道路。
[0003]名稱為豬用複合酶飼料添加劑，申請號為200910067312.3的專利，本發明是豬用複合酶飼料添加劑，其添加物料及其重量比是脂肪酶10-20%，纖維素酶15-35%，甘露聚糖酶25-35%，木聚糖酶10-35%。每999千克豬全價配合飼料的添加量為I千克。該添加劑可提高豬飼料消化利用率。本發明的特點是:增進食慾、促進飼料消化，提高機體免疫功能，改善肉質，是一種無毒副作用、無藥物殘留的安全飼料添加劑。
[0004]目前，市場上針對飼料的複合酶多種多樣，但是有的酶配比不合理，達不到應有的效果，導致畜禽生長緩慢，生產力低下；有的酶活性低，添加量大，導致飼養成本成本高。鑑於糧食的短缺是困擾我國飼料工業發展的主要因素，因此，要選擇有利於節約糧食資源的畜牧業發展道路，提高飼料利用率，充分利用有限的糧食資源獲得儘可能多的畜產品。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於針對上述缺陷提供一種配比合理，活性高的單一酶種復配的生長豬專用酶及其製備方法。
[0006]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0007]—種生長豬專用酶，由以下重量份數的組分組成:中草藥粉0.5-2份，木聚糖酶20-40份，蛋白酶5-8份，果膠酶2-5份，纖維素酶8_16份，β -葡聚糖酶及其培養物10-20份，中溫α-澱粉酶2-6份。
[0008]所述木聚糖酶、蛋白酶、果膠酶和中溫α -澱粉酶均為湖南鴻鷹翔生物工程股份有限公司產品；
[0009]所述中草藥為黃芪、黨參或柴胡中至少一種，使用時將其粉碎即可；
[0010] 所述纖維素酶製備方法如下:
[0011]所述纖維素酶的生產菌種為裡氏木黴(Trichoderma reesei) 601-17,保藏編號為CCTCC NO:M2013540，裡氏木黴菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養製備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種於發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即裡氏木黴發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、乾燥獲得纖維素酶。
[0012]優選的，一種生長豬專用酶按如下重量份數組成:由以下重量份數的組分組成:黃芪粉1份，木聚糖酶30份，蛋白酶6份，果膠酶4份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，中溫α -澱粉酶5份。
[0013]一種生長豬專用酶的生產方法，將中草藥粉，木聚糖酶，蛋白酶，果膠酶，纖維素酶，葡聚糖酶及其培養物，中溫α-澱粉酶按照比例混合後包裝或造粒後包裝；所述纖維素酶製備方法如下:所述纖維素酶的生產菌種為裡氏木黴(Trichodermareesei) 601-17，保藏編號為CCTCC NO:M2013540，裡氏木黴菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養製備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種於發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即裡氏木黴發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600Orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、乾燥獲得纖維素酶。 [0014]所述β -葡聚糖酶及其培養物製備方法如下:
[0015](I)種子培養
[0016]將地衣芽孢桿菌斜面菌種經三級搖瓶發酵劑一級種子罐發酵；
[0017]所述種子培養的培養基為:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白腖0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，海藻糖1-3%，硫酸鈣Ig,氯化鎂2g，檸檬酸鈉l_3g，不足部分純淨水補足，pH4.5-7.0,121-123°C滅菌30_40min。
[0018](2)發酵罐發酵
[0019]將一級種子罐發酵液以3%接種量接入含有3L發酵培養基的發酵罐中，培養溫度35-45°C，攪拌速度200-300r/min，通風量(V/V) 1:1-3,培養時間10_15h ;然後將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發酵培養基補入發酵罐，待溫度升至35_45°C時恆溫培養15-20h ;此時，將一級種子罐發酵液以2%接種量追加接入發酵罐，恆溫培養10-15h ;繼續將IL經過121°C滅菌20min，溫度為10°C的發酵培養基補入發酵罐，待溫度升至35_45°C時恆溫培養10-15h ;
[0020]所述發酵培養基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純淨水1000mL, pH值4.5-7.0,121°C滅菌20min ；
[0021]所述發酵培養基的調配方法為:按比例準確稱取原料，將原料中的純淨水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH值3-7，加入中溫澱粉酶(3u/g玉米粉)與高溫澱粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然後緩慢升溫至90°C保溫15-30min進行液化，最後加入其它原料，攪拌均勻，調初始PH3-7，121_123°C滅菌30_40min備用。
[0022]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15-30% ；
[0023]PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在3-7 ；
[0024]補料控制:當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0025]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。[0026](3)發酵液經離心分離、濃縮、精濾、乾燥得β -葡聚糖酶，離心所獲得地衣芽孢桿菌菌體經清洗後冷凍乾燥獲得地衣芽孢桿菌菌體，將β-葡聚糖酶和地衣芽孢桿菌菌體混合獲得葡聚糖酶及其培養物。
[0027]所述地衣芽孢桿菌具體為地衣芽孢桿菌(B acillus licheniformis) β-10-25。該菌株已於2013年11月3日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學，郵編430072)，保藏號為CCTCC NO:Μ2013538，分類命名為地衣芽孢桿菌 β-10-25 Bacillus licheniformisβ-10-25。
[0028]該菌株由一株本公司實驗室保藏的產葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) β -10原始出發菌種一試管活化一紫外線(UV)-氯化鋰(LiCl)-硫酸二乙酯(DES)複合誘變一平板初篩(聞廣)一搖瓶復篩(聞廣)一熱穩定性測定一傳代穩定性試驗等步驟篩選獲得，特點如下:
[0029]所述菌株在固體平板上菌落為白色，邊緣不整齊，表面乾燥不透明，鏡檢為革蘭氏陽性細菌，細胞形態呈短杆狀，芽孢中生，橢圓形，不膨大。
[0030]所述菌株生理生化特徵:V-P試驗( + )，澱粉水解( + )，酪素水解( + )，明膠水解( + )，硝酸鹽還原( + )，吲哚試驗(_)，利用檸檬酸鹽( + )，硝酸還原( + )，甘露醇( + )，木糖(+ )。
[0031]所述生長豬專用酶適用於飼料加工廠和養殖場自配飼料，使用時應與飼料中的其它原料混合均勻。建議每噸全價料添加量為80-200g (飼料中小麥用量低於30%，添加量為100g/t，小麥用量超過30%，添加量為120-150g/t)。
[0032]有益效果:
[0033]本發明中添加了具有良好生物性能的纖維素酶，特別適合動物體內環境，經過濃縮乾燥後其單位活性和活力進一步提高。混合後的酶製劑對於分解利用飼料原料具有良好的作用效果。本發明中添加了中草藥`粉劑，其具有天然抗菌和增強免疫力的作用，可以有效的提高畜禽動物的抗應激能力、免疫功能以及抗病防禦機能。另外，中草藥粉劑中添加了具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，使得本發明產品具有更好的穩定性和保存活性，較沒有添加中草藥粉劑的產品在長時間高溫條件下的保存活性提高了 15%。發明產品中β_葡聚糖酶及其培養物含有益生菌地衣芽孢桿菌對於維護動物腸道健康具有良好作用；本發明配比合理，有效的補充了內源酶的不足，促進營養物質的消化吸收，提高了飼料利用率，節約了飼養成本。
【具體實施方式】
[0034]所述纖維素酶的生產菌種為裡氏木黴(Trichodema reesei) 601-17,該菌株於2013年11月3日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013540，分類命名為裡氏木黴601_17Trichodema reesei601_17,保藏地址:中國.武漢.武漢大學，郵編 430072。
[0035]所述菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0036]所述菌株生理生化特徵:
[0037]該菌株在PDA固體培養基上生長，形成的菌落特徵為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.1-0.75mm,菌落邊緣白色，整齊；生長速度快，48h菌落直徑達1.0-8.5mm, 72h達30-50mm ;菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2-5?πι。分生孢子梗從菌絲的短側枝發生，側枝上對生。分生孢子梗呈瓶狀，直立，無色，孢子呈球形，綠色，直徑
20-100伽。
[0038]該菌株可在麥麩上生長，主要代謝產物為纖維素酶(內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶)。根據((An Introduction industrial mycology)) (George Smithl954)、《真菌鑑定手冊》(魏景超1982)、《常見與常用真菌》(中科院微生物研究所1973)，鑑定該菌株為:裡氏木黴。
[0039]利用裡氏木黴菌株，通過紫外誘變、培養、發酵生產纖維素酶的方法如下。 [0040]菌種初篩:原始菌株裡氏木黴HYX01採自津市市保河堤食用菌培植基地中的土樣篩選分離出。裡氏木黴菌株接種到斜面活化培養基上，活化菌種；培養活化後的菌種，挑取單菌落製備孢子懸浮液，並用紫外照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；適當稀釋將孢子濃度調節為103個/mL，取最後稀釋度的菌液0.2mL，稀釋塗布於纖維素-剛果紅平板篩選培養基上。在30°C培養3天後挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。
[0041]復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙籤接種於斜面培養基，30°C培養至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種於裝有50mL復篩培養基的250mL三角瓶中進行發酵，接種量10%( v/v)，30°C、100r/min培養96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復篩培養基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0042]復篩選出菌株為裡氏木黴(Trichoderma reesei) 601-17,保藏編號為CCTCC NO:M2013540。
[0043]培養特徵:該菌株產纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0044]遺傳穩定性試驗:將該菌株在斜面上連續十次傳代，並用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代後的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。
[0045]放大試驗
[0046]種子培養:將纖維素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，種子培養基裝量100 毫升，300C、150rpm 搖床培養 72_96h。
[0047]種子罐培養:將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發酵培養基的10L發酵罐中，控制pH值恆定為5.0 ± 0.2，培養溫度27 ± 0.1°C，攪拌速度300rpm，通風量(v/v )1:0.8-1.2,培養時間104h，溶解氧20-30%。所述發酵培養基製備方法為:纖維素粉10%、硫酸銨0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其餘為水，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0048]發酵結束後，取發酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測，經測定，外切β -葡聚糖酶、內切β -葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
[0049]實施例2[0050]優選的，一種生長豬專用酶按如下重量份數組成:由以下重量份數的組分組成:黃芪粉1份，木聚糖酶30份，蛋白酶6份，果膠酶4份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，中溫α -澱粉酶5份。
[0051]實施例3:由以下重量份數的組分組成:中草藥粉2份，木聚糖酶40份，蛋白酶5份，果膠酶2份，纖維素酶16份，β -葡聚糖酶及其培養物20份，中溫α -澱粉酶5份。中草藥粉所述中草藥由黃芪和黨參組成，黃芪和黨參的質量比例為1:1，使用時將其粉碎即可。
[0052]實施例4效果對比實驗
[0053]選取120頭生長豬，按體重、血統及性別無差異分為實驗組和對照組，每組3個重複，每個重複20頭豬。實驗期為28天，實驗組和對照組每噸飼料均添加複合酶製劑120g，實驗組所用複合酶製劑為實施例3所述複合酶製劑，對照組所用複合酶製劑為市售同類
複合酶。
[0054]相對對照組，實驗組日採食量提高顯著，比對照組增加了 40g/d，日增重達到218.89g，比對照組提高了 45g，料重比增加為1.36，對照組為1.48 ;腹瀉率也極大減少，實驗組為7次，對照組為12次，五分制皮膚和毛色評分(5分為最高)，實驗組達到4.2分，而對照組為3.4分，以上數據結果表明本發明飼料產品具有良好飼餵價值。可以有效提高飼餵效果和效益。
[0055]實施例5中草藥粉劑對酶保存活性的影響
[0056]以實施例3中所述的製備方法獲得的生長豬專用酶為樣品1，以去除實施例3中所有的中草藥粉劑的製備方法獲得的生長豬專用酶為樣品2，比較兩種樣品的保存活性。在45°C下保存上述樣品18h，之 後測定酶活，結果表明:樣品I的殘餘酶活在75%以上，樣品2的殘餘酶活保持在60%左右。
【權利要求】
1.一種生長豬專用酶，由以下重量份數的組分組成:中草藥粉0.5-2份，木聚糖酶20-40份，蛋白酶5-8份，果膠酶2-5份，纖維素酶8_16份，β -葡聚糖酶及其培養物10-20份，中溫ct -澱粉酶2-6份,所述纖維素酶由裡氏木黴(Trichoderma reesei) 601-17,保藏編號為CCTCC NO:M2013540經發酵培養製備。
2.根據權利要求1所述生長豬專用酶，所述中草藥為黃芪、黨參或柴胡中至少一種。
3.根據權利要求1所述生長豬專用酶，所述纖維素酶製備方法如下: 所述纖維素酶的生產菌種為裡氏木黴(Trichoderma reesei)601-17,保藏編號為CCTCC NO:M2013540，裡氏木黴菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養製備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種於發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即裡氏木黴發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、乾燥獲得纖維素酶。
4.根據權利要求1-3所述生長豬專用酶，所述生長豬專用酶按如下重量份數組成:由以下重量份數的組分組成:黃芪粉1份，木聚糖酶30份，蛋白酶6份，果膠酶4份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，中溫α -澱粉酶5份。
5.根據權利要求1-3所述生長豬專用酶，由以下重量份數的組分組成:黃芪粉1份，木聚糖酶30份，蛋白酶6份，果膠酶4份，纖維素酶10份，β -葡聚糖酶及其培養物15份，中溫α -澱粉酶5份。
6.根據權利要求1-3所述生長豬專用酶，由以下重量份數的組分組成:中草藥粉2份，木聚糖酶40份，蛋白酶5份，果膠酶2份，纖維素酶16份，β -葡聚糖酶及其培養物10份，中溫α-澱粉酶5份。
7.根據權利要求1-6所述生長豬專用酶的製備方法，將中草藥粉，木聚糖酶，蛋白酶，果膠酶，纖維素酶，葡聚糖酶及其培養物，中溫α-澱粉酶按照比例混合後包裝；所述纖維素酶製備方法如下:生產菌種為裡氏木黴(Trichoderma reesei)601_17,保藏編號為CCTCC NO:M2013540，裡氏木黴菌株接種到斜面活化培養基上，逐級擴大培養製備種子液，培養時間為72-96小時；種子液按發酵液體積5-10%的接種量接種於發酵培養基中，20-35°C培養96-144小時，即裡氏木黴發酵生產纖維素酶結束；將發酵液在4000-600orpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進行超濃縮過濾、乾燥獲得纖維素酶。
8.根據權利要求7所述生長豬專用酶的製備方法，所述β-葡聚糖酶及其培養物製備方法如下: 地衣芽孢桿菌培養獲得發酵液經離心分離、濃縮、精濾、乾燥得β -葡聚糖酶，離心所獲得地衣芽孢桿菌冷凍乾燥獲得地衣芽孢桿菌菌體，將β-葡聚糖酶和地衣芽孢桿菌菌體混合獲得β -葡聚糖酶及其培養物；地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)保藏號為CCTCC NO:M2013538o
【文檔編號】C12N9/42GK103740681SQ201310717468
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】李洪兵, 朱永明, 易繼雲, 劉文明, 向左東 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司