大洋臀紋粉蚧的實時螢光pcr引物、探針及檢測方法
2023-11-06 17:07:07
專利名稱：大洋臀紋粉蚧的實時螢光pcr引物、探針及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR引物、探針及檢測方法。
背景技術：
大蔣臀級輪喻Planococcus minor (Maskell)是「中華人民共和國進出境植物檢疫性有害生物名錄」中的有害生物，同時也是歐洲、美洲等許多國家或地區十分關注的檢疫性有害生物。該蟲在亞洲、非洲、美洲的許多國家或地區廣泛分布，已記錄寄主植物多達60 餘個科共250餘種，為害多種水果、林木和觀賞植物。主要寄主植物有榴槤、甘橘、葡萄、芒果、香蕉、人心果、西瓜、甜瓜、咖啡、可可、大豆、玉米、馬鈴薯、觀賞花卉植物等。大洋臀紋粉蚧極易隨上述寄主植物傳入我國，對我國的農業生產構成潛在威脅，因此，需要在口岸檢疫部門嚴格加強檢疫工作，防止該蟲傳入我國。在蚧蟲鑑定中，只有成熟、完整的雌成蟲才能進行準確的形態鑑定，若口岸截獲到若蟲，必須花費較長時間將其飼養為成蟲；若截獲到不完整的死蟲，根本無法鑑定其種類。 蚧蟲鑑定前，需先將其製作成玻片標本。玻片標本製作的技術性較強，製作人員需經專門培訓，才能製作出合格的標本。蚧蟲鑑定十分困難，需要經驗豐富的蚧蟲專家才能準確鑑定其種類。本發明彌補了蚧蟲形態學鑑定的不足，可以更為快捷、準確地鑑定出口岸截獲的蚧蟲是否為大洋臀紋粉蚧。
發明內容
本發明的目的在於提供大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR引物、探針及檢測方法，旨在解決蚧蟲形態鑑定耗時長、鑑定困難的問題。本發明的技術方案如下
一種用於檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO. 1 和 SEQ NO. 2 所示。一種用於檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR的MGB探針，其中，所述MGB探針是一段兩端分別用不同的染料標記的寡核苷酸，在5』端標記一個報告螢光基團，3』端標記一個淬滅基團和一個MGB基團，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO. 3所示。所述的用於檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR的MGB探針，其中，所述報告螢光基團為螢光染料FAM，所述淬滅基團為非螢光淬滅基團。一種檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR方法，其中，包括以下步驟
1)先對大洋臀紋粉蚧及其近似種轉錄間隔區進行序列測定及比較分析，分別找出大洋臀紋粉蚧不同於其它近似種的獨有的鹼基位點，然後設計用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR 檢測的上遊引物、下遊引物和MGB探針；
2)提取待測樣品DNA;
3)設置實時螢光PCR 的反應體系5 μ 1 2XTaqMan Gene Expression Master Mix,IOpM的上遊引物和下遊引物各0. 25 μ 1，IOpM的MGB探針0. 2 μ 1，待測樣品DNA 1 μ 1，加水補足總體積10μ 1 ；同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照；
4)進行實時螢光PCR反應，並檢測螢光信號反應條件為50°C，2min；95IOmin ； 950C，IOs ；600C，Imin ；40 個循環；
5)根據螢光信號的檢測結果，判斷是否為大洋臀紋粉蚧。所述的檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR方法，其中，所述陽性對照為大洋臀紋粉蚧DNA，陰性對照為南洋臀紋粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠蘿灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、氣生根粉蚧DNA、雙條拂粉蚧DNA，空白對照為去離子水。本發明的有益效果設計了適用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR快速檢測的引物和寡核苷酸探針，克服了現有形態學鑑定方法檢測周期長、需要製作玻片標本和需要豐富經驗的缺點，也克服了現有的分子檢測方法操作複雜或檢測靈敏度不高、特異性不強、重複性不好等缺點；由於本發明檢測快速、特異性強，特別適用於口岸檢疫等時效性要求較強的場合使用。
圖1是本發明實施例中實時螢光PCR檢測大洋臀紋粉蚧的螢光信號結果圖。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚、明確，以下參照附圖並舉實施例對本發明進一步詳細說明。TaqMan MGB探針實時螢光PCR是在反應體系中加入一條螢光。TaqMan MGB探針是一段兩端分別用不同的染料標記的寡核苷酸，即在5』端標記一個報告螢光基團，3』端標記一個非螢光淬滅基團和一個MGB基團。當探針完整時，報告螢光基團發射的螢光信號被非螢光淬滅基團吸收。在PCR擴增時，加入一對引物的同時加入一條這種特異性的螢光雙標記探針，TaqMan MGB探針同PCR產物雜交，在延伸階段，Taq酶的5』端到3』端的外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和非螢光淬滅基團分離，報告螢光基團染料發出的螢光不再轉換給非螢光淬滅基團，導致螢光量的增加，螢光監測系統接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。如果以每一個循環結束時所測得的螢光值為縱坐標，以PCR循環數為橫坐標作圖，可得到一條連接每一個循環後螢光值的曲線，即擴增曲線。當樣品中含有所要檢測的靶核酸序列時，所得到的曲線呈「S」形；而當樣品中不含靶核酸序列時，則沒有發生PCR擴增，探針不被水解，也就檢測不到螢光信號，擴增曲線為一水平線。利用上述TaqMan MGB探針，本發明提供的大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR的檢測方法，包括如下步驟
(1)先對大洋臀紋粉蚧及其近似種轉錄間隔區(ITS)進行序列測定及比較分析，分別找出大洋臀紋粉蚧不同於其它近似種的獨有的鹼基位點；
(2)設計大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR檢測的引物和寡核苷酸探針；
(3)對所設計的探針進行篩選及反應體系和反應條件的優化，篩選出優化的引物和探針，並優化出合適的反應體系和反應條件；(4)加入上述的引物、探針進行大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR反應；
(5)根據實時螢光PCR結果，判斷檢測樣品是否為大洋臀紋粉蚧。用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR檢測的引物，其序列(SEQ ID NO. 1-2)如下 COI- PM-F :5』 -TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3』 ；
COI- PM-R 5' -GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3，。用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR檢測的寡核苷酸探針，其包括特異性檢測大洋臀紋粉蚧的iTaqMan MGB探針和特異結合的寡核苷酸序列，其序列(SEQ ID NO. 3)如下
COI-PM-MGB FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。其中，MGB探針的5』端用螢光染料FAM作為報告螢光基團，3』端的MGB探針的淬滅基團採用非螢光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不產生螢光，可以大大降低本底信號的強度，同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團。採用上述檢測方法的結果判定標準是1)若定量PCR儀檢測到以大洋臀紋粉蚧 DNA為模板的陽性對照報告螢光有明顯信號增長，陰性對照和空白對照的報告螢光沒有螢光信號增長，而樣品的檢測結果是報告螢光信號有明顯增長，則表示所檢測的蚧蟲是大洋臀紋粉蚧；2)若定量PCR儀檢測到以大洋臀紋粉蚧DNA為模板的陽性對照報告螢光有明顯信號增長，陰性對照和空白對照的報告螢光沒有螢光信號增長，而樣品的檢測結果報告螢光也沒有螢光信號增長，則表示所檢測的蚧蟲不是大洋臀紋粉蚧。實施例1引物和探針的準備
對大洋臀紋粉蚧及其近似種轉錄間隔區(ITS)進行序列測定及比較分析，設計用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR檢測的引物序列如下
COI- PM-F :5』 -TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3』 ； COI- PM-R 5' -GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3，。用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR檢測的MGB探針的序列如下 COI-PM-MGB :FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。其中，MGB探針的5』端用螢光染料FAM為報告螢光基團，3』端的淬滅基團採用非螢光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不產生螢光，可以大大降低本底信號的強度，同時探針的3』端上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團。實施例2
利用大洋臀紋粉蚧iTaqMan MGB探針實時螢光PCR檢測方法對進口泰國榴槤Durio zibethinus Murray中截獲粉蚧進行鑑定。所用弓丨物和MGB探針是實施例1中的引物和MGB探針。利用大洋臀紋粉蚧TaqMan MGB探針實時螢光PCR檢測的過程如下
1、提取待測樣品DNA:將從進口泰國榴槤中發現的粉蚧，按照常規的DNA提取方法進行 DNA提取。2、實時螢光PCR反應，並進行螢光檢測
TaqMan MGB探針實時螢光PCR擴增反應在ABI 7700型PCR儀的96孔板上進行，TaqMan MGB 探針螢光 PCR 的反應體系5 μ 1 2 X TaqMan Gene Expression Master Mix，上、下遊引物(IOpM)各0. 25 μ 1，MGB探針(IOpM) 0. 2 μ 1，待測樣品DNA 1 μ 1 (約IOng)，加水補足總體積10μ 1。同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照以大洋臀紋粉蚧DNA為陽性對照、以南洋臀紋粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠蘿灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、氣生根粉蚧 DNA、雙條拂粉蚧DNA為陰性對照，以去離子水為空白對照。PCR 反應條件:50°C,2min ；95°C, IOmin ；95°C, IOs ；60°C, Imin ；40 個循環。根據報告螢光基團的類型，選擇對應的螢光通道，進行螢光PCR擴增，記錄實時螢光PCR檢測結果。3、根據檢測結果，判斷是否為大洋臀紋粉蚧。從進口泰國榴槤中發現的粉蚧，按照上述的方法和條件進行檢測，實時螢光PCR 檢測結果為以大洋臀紋粉蚧DNA為模板的陽性對照報告螢光有明顯信號增長，陰性對照和空白對照報告螢光沒有螢光信號增長，而從進口泰國榴槤果實上截獲的粉蚧DNA模板的檢測結果為陽性，檢測結果如圖1所示，表明所檢測進口泰國榴槤攜帶的粉蚧為大洋臀紋粉蚧。採用本發明的方法檢測大洋臀紋粉蚧比傳統形態學方法更加快速、準確，且易於推廣應用。綜上所述，採用本發明能對實際檢疫和田間調查過程中所發現的粉蚧進行大洋臀紋粉蚧分子生物學鑑定或檢測，其意義重大。應當理解的是，本發明的應用不限於上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種用於檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR引物，其特徵在於，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO. 1和SEQ NO. 2所示。
2.一種用於檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR的MGB探針，其特徵在於，所述MGB探針是一段兩端分別用不同的染料標記的寡核苷酸，在5』端標記一個報告螢光基團，3』端標記一個淬滅基團和一個MGB基團，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO. 3所示。
3.根據權利要求2所述的用於檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR的MGB探針，其特徵在於，所述報告螢光基團為螢光染料FAM，所述淬滅基團為非螢光淬滅基團。
4.一種檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR方法，其特徵在於，包括以下步驟1)先對大洋臀紋粉蚧及其近似種轉錄間隔區進行序列測定及比較分析，分別找出大洋臀紋粉蚧不同於其它近似種的獨有的鹼基位點，然後設計用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR 檢測的上遊引物、下遊引物和MGB探針；2)提取待測樣品DNA；3)設置實時螢光PCR 的反應體系5 μ 1 2XTaqMan Gene Expression Master Mix, IOpM的上遊引物和下遊引物各0. 25 μ 1，IOpM的MGB探針0. 2 μ 1，待測樣品DNA 1 μ 1，加水補足總體積10μ 1 ；同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照；4)進行實時螢光PCR反應，並檢測螢光信號反應條件為50°C，2min；95IOmin ； 950C，IOs ；600C，Imin ；40 個循環；5)根據實時螢光PCR檢測結果，判斷是否為大洋臀紋粉蚧。
5.根據權利要求4所述的檢測大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR方法，其特徵在於，所述陽性對照為大洋臀紋粉蚧DNA，陰性對照為南洋臀紋粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠蘿灰粉蚧 DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、氣生根粉蚧DNA、雙條拂粉蚧DNA，空白對照為去離子水。
全文摘要
本發明公開了大洋臀紋粉蚧的實時螢光PCR引物、探針及檢測方法，本發明設計了適用於大洋臀紋粉蚧實時螢光PCR快速檢測的引物和寡核苷酸探針，克服了現有形態學鑑定方法檢測周期長、需要製作玻片標本和需要豐富經驗的缺點，也克服了現有的分子檢測方法操作複雜或檢測靈敏度不高、特異性不強、重複性不好等缺點；由於本發明檢測快速、特異性強，特別適用於口岸檢疫等時效性要求較強的場合使用。
文檔編號C12N15/11GK102168142SQ20111004992
公開日2011年8月31日 申請日期2011年3月2日 優先權日2011年3月2日
發明者餘道堅, 康林, 徐浪, 焦懿, 陳志粦 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心