用於降解s-三嗪和二嗪的酶及方法

2023-11-06 21:50:17 1

專利名稱：用於降解s-三嗪和二嗪的酶及方法
技術領域：
本發明涉及降解S-三嗪如莠去津(atrazine)以及二嗪的多肽。還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。本發明還涉及這些多核苷酸與多肽在S-三嗪和二嗪的生物整治中的用途。
背景技術：
有效的化學蟲害防治劑如三嗪除草劑的使用促進了目前集約耕作(intensive farming)的實踐。例如，莠去津(6-氯-N2-乙基-N4-異丙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)是高效的出芽前和出芽後三嗪除草劑，自從1958年首次引入以來其廣泛用於控制闊葉雜草物種 CTomlin，2006)。環境相關濃度的莠去津與脊椎動物物種的內分泌功能失調(例如非洲爪蟾 (Xenopus laevis)的雄性徵消失(demasculination))有因果聯繫(Hayes et al.，2002， 2003和2006)，並且據認為莠去津可能是致癌的(Huff, 2002 ；Huff and Sass，2007)。此外， 由於它們的廣泛特異性，莠去津及相關三嗪除草劑具有通過其對非靶標光合物種的毒性作用而引起環境破壞的潛力。莠去津在環境中是移動且持久的。莠去津的環境半衰期估計為4-57周之間 (Belluck et al.，1991)，並且在幾個國家的地表水和地下水中均檢測到莠去津(Thurman and Meyer, 1996 ；van der Meer, 2006 ；Gavrilescu,2005)。原核生物中進化了幾個允許分解代謝三嗪殺蟲劑作為碳源和氮源的基因/ 酶系統。這些途徑中經最徹底表徵的是由源自最初從假單胞菌(Pseudomonas sp.) ADP (Mandelbaum et al.，1995 ；de Souza et al.，1995)分離的可傳遞 pADPl 質粒 (Martinez et al. ,2001)的atzABCDEF基因所編碼的。莠去津和西瑪津(6-氯-N2，N4-二乙基-1，3，5-三嗪-2，4_ 二胺)(de Souza et al.，1996)接連被 atzA、atzB 及 atzC編碼的醯胺水解酶家族的酶脫氯和脫烷基而產生氰尿酸(de Souza et al. , 1996 ；Boundy-Mills et al.，1997 ；Sadowsky et al. , 1998)，其然後被該途徑中剩餘的由 atzD、atzE 禾口 atzF 編碼的水解酶礦化為氨和二氧化碳(Fruchey et al. ,2003 ；Cheng et al. ,2005 ；Shapir et al. ,2005a)。AtzAB⑶EF莠去津降解分解代謝途徑的AtzA酶經常由TrzN三嗪降解酶 (Sajjaphan et al.，2004)取代，其與 AtzA 具有重疊的活性(Shapir et al.，2005b)，儘管僅有25.4%的同一性。TrzN是鋅依賴性醯胺水解酶家族酶(Siapir et al. ,2006), 負責來自三嗪化合物的氯化物、氟化物、S-甲基、S(O)-甲基和氰基基團的水解置換 (displacement) (Shapir et al·，2005b)。這意味著 TrzN 廣泛地靴向 s_ 三嗪，而 AtzA 僅可以用於將滷化S-三嗪解毒。TrzN靶向氯-S-三嗪(例如莠去津、撲滅津和西瑪津)、甲氧基-S-三嗪(例如莠去通、西瑪通(simeton)和撲滅通)和甲硫基_s_三嗪(例如莠滅淨(ametryn)、撲草淨和西草淨)除草劑。TrzN也被報導具有與AtzA可比的催化常數2. lsec—1，相較於AtzA的SsecT1)，但具有低得多的對莠去津的Km (20 μ M相較於AtzA的100 μ M) (Shapir et al. , 2006) 因此AtzA具有3. 3xl04的對莠去津的K。at/Km，而TrzN具有IxlO5的對莠去津的K。at/Km為，證明 TrzN是比AtzA催化效率更高的酶。然而，與AtzA不同，TrzN已被證實難以在異源宿主如大腸桿菌中大量表達。當 TrzN與分子伴侶GroEL共表達時從大腸桿菌獲得的最高產量低於IOmg. mL—1 (Siapir et al.，2006)，在沒有分子伴侶時最高產量僅 560 μ g. ml/1 (Shapir et al.，2005b)。生物整治是改善潛在損害性殺蟲劑殘留的環境影響的新興方法(Alcalde et al.，2007)。一種成功的生物整治策略是酶生物整治，其中使用分離的或半純化的酶以極大地降低其毒性的方式來分解或修飾毒性殺蟲劑(Parales et al. ,2002 ；Sutherland et al.，2004)。酶生物整治比使用活微生物具有很多優勢；存在GM生物體或完整DNA向環境的釋放，所用的酶通常快速(僅需要數小時的應用時間)並在應用後具有有限的、可預期的持久性(Alcalde et al. ,2007) 然而，對生物整治所用的酶的要求有些嚴格，其要求高催化活性、低Km、不依賴於擴散性輔因子、以及對環境條件(PH、溫度、鹽濃度等)的範圍而言通常是強健的蛋白。酶還必須在通常的發酵生物體如大腸桿菌中以高可溶性活性蛋白的形式表達，對於這一點， TrzN不合格。儘管莠去津潛在的大量環境痕跡令人憂慮，但是其在農業中的持續使用仍然是期望的。因此，需要用於消除或減少莠去津和其他S-三嗪以及二嗪對環境的潛在破壞的其他方法。發明概述本發明人已鑑定出編碼具有增強性質的TrZN或其變體的多核苷酸。在第一個方面，本發明提供了編碼水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的分離和/或外源多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽具有至少40% 的同一性，並且i)當在細菌細胞中表達時，比在相同條件下培養的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞產生更多的多肽，和/或ii)所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大於包含SEQ ID NO=I所提供的胺基酸序列的多肽。在優選實施方案中，比在相同條件下培養的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4 所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞產生更多的可溶性生物學活性形式的多肽。在另外的特別優選的實施方案中，所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽在對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。在另一實施方案中，所述多核苷酸還編碼包含以下的多肽i)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號38的位置處的天冬醯胺； 和ii)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號131的位置處的脯氨酸、天冬醯胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸。在優選實施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所提供的核苷酸序列，並具有一個或多個以下核苷酸取代或者對應於其核苷酸位置處的取代T5C、 C39A、C76A、C84A、T87C、C101A、T108A、T108A、G112A、A127G、C135T、A157T、C165T、G168A、 C180T、C189T、A200T、C207T、G210A、G225T、A228G、C229T、T240C、A250C、C268A、G270A、Α271Τ、Τ273Α、C279T、A296G,A302G、A303G、A314G、C315A、T317C、T320C、A326C、A333G、T336C、C346T、G357A,A367G、C372T、C375A、C381T、T384C、C391A、C391G、C391T、T392C、Τ392Α、T392G、G393C、T399C、C410T、C411A、C411T、A414G、A418C、T423C,Τ426Α,Α432Τ、C438T、C449G、C454T、T466C,T468C,T471C,C474T、G475A、C476T、A481G、C483T、G489A、G489T、T498C,Τ531Α、A537G、A540G,A545G,T546G,G548A,T555C、T555C、C564T、G567A、G567A、G568A、G569A、G573C、T579C、Α584Τ、G589A、A600G、T618C、T618C、T627C、C628G、G630A、C633T、G637A、T639C、T639C、A654G、G660A、G660T、T663C、C675A、G681T、C686T、C690A、C696T、G705A、A723G、C727G、T728C、T728G、G729C、G736A、G737C、G737A、G737T、T738G、T738C、T738C、G745A、G753C、G768A、Τ774Α、C807A、Τ840Α、A843G、Α852Τ、A855G、C867T、T879C、G880A、G880T、G880C、C881T、G882T、C885T、G897A、T900C、Τ906Α、A928G、
A938T、T941C、C957A、T959A、C972T、T978A、C981T、C993T、C999T、C1003A、C1003T、T1011C、 G1048A、G1048T、G1048C、A1049T、A1049G、G1053A、A1059G、A1086G、G1094A、T1101C、T1101G、 C1128T、A1152G、G1176T、C1186A、C1186T、T1196C、C1203T、G1221A、C1223T、C1236T、G1248T、 G1270A、C1278T、T1286A、T1305C、G1309A、C1321T、A1326G、C1329T、C1329T、C1332T、C1344A、 C1351A 和 G1353T。在一實施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽，並具有一個或多個以下胺基酸取代或者對應於其胺基酸位置處的取代I2T、F13L、 L26M、D28E、A34D、D38N、S43G、M53L、Y67F、S84R、L90M、T91S、D99G、K101R、D105E、D105G、 V106A、Ι107Τ、Ε109Α、I123V、L131P、L131N、L131T、L131D、L131V、L131G、L131C、L131S、 L131Q、L131H、L131Y、L131I、Τ137Ι、S140R、T150S、F156L、Α159Τ、A159V、S161G、Μ163Ι、 F177L、D182E、D182G、R183H、G190D、G190S、Y195F、Ε197Κ、Ρ210Α、V213I、Μ227Ι、Μ227Ι、 A229V、D230E、L243P、L243G、G246A、G246S、G246D、G246E、G246K、G246V、D249N、Α294Τ、 A294S、A294L、I310V、Y313F、L314P、V320E、L335M、D350N、D350Y、D350F、D350R、D350H、 R365H、L396M、V399A、A408V、V424I、V429D、V437I 和 L451M。在另一實施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽，並具有一個或多個以下胺基酸處的取代或者對應於其胺基酸位置處的取代Μ82、 W85、L86、Μ92、L131、Μ163、L172、C211、Υ215、Η238、Ε241、L243、Μ247、Η274、Ρ299、D300、 M303、W305、T325和 S329。在另一特別優選的實施方案中，所述多核苷酸在對應於SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的核苷酸編號468的位置處包含胞嘧啶。在另一優選實施方案中，所述核苷酸編碼多肽，其包含i)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號67的位置處的苯丙氨酸；和/或ii)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號91的位置處的絲氨酸，和/或iii)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號131的位置處的脯氨酸、天冬醯胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；和 /或iv)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號159的位置處的蘇氨酸或纈氨酸；和/或ν)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號161的位置處的甘氨酸；和/或vi)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號210的位置處的丙氨酸；和/或
vii)對應於SEQ ID NO :1的胺基酸編號243的位置處的脯氨酸或甘氨酸；和/或viii)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號M6的位置處的天冬氨酸、絲氨酸、穀氨酸、賴氨酸、纈氨酸或丙氨酸；和/或ix)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號四4的位置處的蘇氨酸、絲氨酸或亮氨酸； 和/或χ)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號335的位置處的甲硫氨酸；和/或xi)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號350的位置處的酪氨酸、天冬醯胺、苯丙氨酸、精氨酸或組氨酸；和/或xii) i)至xi)的任一種的生物學活性片段。在另一實施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽，並具有以下胺基酸取代或取代組之一，或者對應於其胺基酸位置處的一或多個取代i)Y313Fii)Y67Fiii)A159Viv)A159V、L243Pν) D350Yvi)G190D、M227Ivii)A159Tviii)A408Vix)L26M、S161Gx)F13L、A34D、G246A、D350Yxi)T137I、S140Rxii)L335Mxiii)P210Axiv)A294Txv) 1123Vxvi)Y67F、V437Ixvii)M163I、D249Nxviii)T137Ixix) G246Sxx) L90Mxxi)A159V、L243P、L451Mxxii) T150S、A159V、A229V、D230E、L243Pxxiii)Y67F、L335Mxxiv)Y67F、K101R、A294Txxv) L335Mxxvi) V106A、S161G、F177L、L335Mxxvii)S43G、I107T、A159V、D350Y
xxviii)M53L、T137I、S140R、D182G、G190S、D350Yxxix) A159V、L335M、D350Yxxx)D28E>A294T>D350Nxxxi)P210A、V424Ixxxii)A159V、G190Dxxxiii)P210A、A294T、R365H、D350Yxxxiv)I123V、S161G、A294Txxxv)Y67F、A159V、D350Yxxxvi)T91S、A159V、A294Txxxvii)Y67F、A159V、L243Pxxxviii)A159V、P210Axxxix)A159V、I310V、L335M、L396M、L243Pxl) I2T、D105E、A159V、E197K、M227I、L243P、L335Mxli)A159V、L335Mxlii)S84R、D105G、A159Vxliii)Y67F、A294Txliv)A159V、D182E、L335M、D350Yxlv)Y67F、A159V、L243Pxlvi)D38N、A159Vxlvii)A159V、M163I、Y195F、D350Yxlviii)F156L、P210A、D350Yxlix)Y67F、D350Y1)A159V、D350Yli) Y67F、D99G、A159V、V213I、L243P、L335Mlii)E109A、A159V、L314P、V320E、V399A、V429Dliii)A159V、L335Mliv) Y67F、A159V、L335M、D350Ylv)D38N、L131P、A159Vlvi) T91S、L131P、A159V、A294T、R365H、L396M、D350Ylvii)R183H、P210A、D350Ylviii)Y67F、A159V、D350Y
lix)A159V、P210A、A294T、D350Nlx)Y67F、A159V、D350Nlxi) A159V、L335M、D350Ylxii)P210A、A294T、D350Ylxiii)T91S、A159V、A294Tlxiv)P210A、A294T、L335M 或lxv)Y67F、L335M。在另一實施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所提供的核苷酸序列，並具有以下核苷酸取代或取代組之一或者對應於其核苷酸位置處的一或多個取
代
i)T468C
ii)T468C、A938T
iii)A200T、G210A、T468C
iv) T468C、C476T、G753C
ν) T468C、C476T、T728C
vi)T468C、1048T
vii) T384C、T468C、G569A、G681T
viii)T468C、G475A
ix) C279T、T468C、C1223T、C1329T
x) C76A、T468C、A481G
xi) C39A、C101A、T468C、T639C、G737C、G1048T
xii) C410T、A418C、T468C、A600G
xiii)T468C、G705A、C1003A
xiv)T468C、G573C
xv) T468C、C474T、C628G、C1278T
xvi) T399C、T468C、G880A、T900C
xvii)T468C、C1236T
xviii)T87C、A367G、T468C
xix) T468C、G1176T
xx)C135T、T468C、C1344A
xxi)T468C,A852T
xxii)T468C、T738C
xxiii)C454T、T468C
xxiv)A200T、T468C、G1309A
xxv)T468C、G489T、G745A
xxvi)C410T、T468C
xxvii)T468C,G736A
xxviii)G225T、C268A、A414G、T468C、T627C、C1321T
xxix) A432T、T468C、T471C、C476T、T728C、G1053A、C1351A
xxx)A303G、C449G、T468C、C476T、C686T、C690A、T728C、C1128T
xxxi) A200T、G210A、C372T、T468C、A654G、C1003A
xxxii) C180T、A200T、A302G、C375A、T399C、C41 IT、T468C、A540G、G880A、T900C
xxxiii) C229T、T468C、G705A、C1003A
xxxiv) T317C、T468C、A481G、T531A、G753C、T906A、T978A、C1003A、A1326G
xxxv) A127G、T320C、T468C、C476T、G753C、G1048T
xxxvi) A157T、C410T、A418C、T468C、A545G、G568A、A600G、C628G、G630A、G1048T、C1332T
xxxvii)T468C、C476T、A723G、C1003A、G1048T、C1329Txxxviii)C84A、T399C、T468C、C483T、G880A、T900C、G1048Axxxix)T468C、T498C、C628G、C885T、A1086G、G1270Axl)T384C、T468C、C476T、G569A、G753C、A1152Gxli) T336C、T468C、C476T、A537G、C564Txlii) A228G、T240C、T468C、C628G、G880A、G1048T、G1094Axliii) T273A、A367G、C381T、T399C、T468C、A481G、G880A、T900Cxliv)A200T、C207T、G210A、T468C、C476T、G1048T、A1059Gxlv)A271T、A333G、T399C、T468C、C476T、A843G、G880A、T900C、C1236Txlvi)A200T、G210A、C346T、T468C、C476T、T579C、T728C、C1278Txlvii) C438T、T468C、C476T、A855Gxlviii)G168A、T426A、T468C、C476T、C628G、C1203T、T1305Cxlix) T468C、C476T、T663C、C1236T1) T384C、T468C、C476T、T728C、A928G、C1003A、Cl 186Ali)T5C、C315A、T468C、C476T、G589A、G681T、T728C、G897A、C1003Alii) C279T、T468C、C476T、C1003Aliii) A250C、A314G、T468C、C476Tliv) A200T、G210A、T468C、T555C、G880A、T900Clv)T468C、C476T、T546G、C696T、C1003A、G1048Tlvi)A200T、G210A、T468C、C476T、T728C、TllOlGlvii)G112A、C165T、T468C、C476T、T618C、G753C、C999T、TllOlC
lviii)T423C、T468C、C476T、G489A、A584T、G753C、G1048Tlix)T466C、T468C、C474T、C628G、G1048Tlx)T108A、A200T、G210A、G357A、T468C、G1048T、A1059G、C1278Tlxi) T468C、C476T、G567A、G753C、G1048Tlxii) A200T、G210A、A296G、T468C、C476T、G637A、T728C、C1003Alxiii)C189T、A326C、T468C、C476T、T941C、T959A、A1059G、C1186T、T1196C、 G1248T、T1286Alxiv)T468C、C476T、C1003Alxv)A200T、G210A、C279T、T468C、C476T、T879C、C1003A、G1048Tlxvi)G112A、C165T、T392C、T468C、C476T、T618C、G660A、C675A、G753C、C807A、 C993T、C999T、T1101C、T1305Clxvii)A271T、T392C、T468C、C476T、G753C、G880A、G1048T、G1094A、C1186A、G1221Alxviii)A228G、T240C、T468C、G548A、C628G、G1048T、C1332Tlxix)T108A、A200T、G210A、T423C、T468C、C476T、G567A、G1048Tlxx)T384C、T468C、C476T、C628G、C867T、G880A、T900C、C981T、G1048A、A1326Glxxi)A200T、C207T、G210A、T468C、C476T、T840A、T900C、G1048Alxxii)T468C、C476T、C633T、G660T、A723G、C1003A、G1048T、C1329Tlxxiii)A228G、T240C、G270A、T468C、C628G、880A、G1048T
lxxiv)A271T、A333G、T399C、T468C、C476T、A843G、G880A、T900C、C1003T、C1236Tlxxv)A228G、T240C、T468C、C628G、G880A、C957A、C1003A 或lxxvi) A200T、G210A、C411A、T468C、T555C、T639C、A654G、G768A、T774A、C972T、 C1003A、T1011C、G1353T。在實施方案中，當在細菌細胞中表達時，比在相同條件下培養的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞所產生的，產生至少2倍、優選至少5倍的量的多肽。在另一實施方案中，當在細菌細胞中表達時，比在相同條件下培養的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞所產生的，產生至少2倍、優選至少5倍的量的可溶性生物學活性多肽。在另外的實施方案中，當在大腸桿菌菌株BL21XDE3中表達並在補加了 200 μ g. mL—1氨苄青黴素、ΙμΜ IPTG並用lmg. mL—1莠去津(90%莠去津w/w)浸漬的LB瓊脂平板上培養時，菌落附近培養基的澄清可以在培養約8天內、更優選在約6天內、更優選在約2天內檢測到。這樣的條件下多核苷酸的表達更詳細地描述於實施例部分。在優選實施方案中，所述多肽具有比包含SEQ ID NO 1所提供的胺基酸序列的多肽高至少2倍、更優選高至少5倍、更優選高7倍的莠去津水解活性。在優選實施方案中，所述多肽具有比包含SEQ ID NO 1所提供的胺基酸序列的多肽高至少2倍、更優選高至少5倍的西瑪津水解活性。可以被本發明的多核苷酸編碼的多肽水解的S-三嗪的實例包括但不限於莠去津、莠滅淨、撲滅津、撲草淨、西瑪津、西草淨、抑草津、草達津或氰草津(cyanozine)。所述細菌細胞可以是能夠產生本發明多核苷酸編碼的多肽的任何細胞。在優選實施方案中，所述細菌細胞是大腸桿菌。大腸桿菌的合適菌株的實例包括但不限於 BL21 λ DE3 (ATCC 登錄號 ΡΤΑ-2657)、JM109 和 DHlO β。在另外的優選實施方案中，所述多核苷酸與能夠指引該多核苷酸在細胞中表達的啟動子可操作地連接。在另一實施方案中，所述多核苷酸編碼還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。所述至少一種其他多肽可以是例如增強本發明多肽穩定性的多肽，促進融合蛋白從諸如細菌細胞或酵母細胞的細胞分泌的多肽、或者有助於融合蛋白純化的多肽。在另一方面，本發明提供了包含本發明的多核苷酸的載體。還提供了包含本發明的多核苷酸和/或本發明的載體的宿主細胞。在實施方案中，所述宿主細胞還包含編碼分子伴侶的外源多核苷酸。本發明的宿主細胞的實例包括但不限於細菌細胞、酵母細胞或植物細胞。在另一方面，本發明提供了包含至少一種本發明的細胞的轉基因植物。在另一方面，本發明提供了包含至少一種本發明的細胞的轉基因非人動物。在另一方面，本發明提供了水解S-三嗪和/或二嗪的基本上純化的和/或重組的多肽，其中所述多肽與包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽具有至少40%的同一性，並且其中i)當在細菌細胞中表達時，比在相同條件下培養的包含編碼SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞產生更多的多肽，和/或
ii)所述多肽具有大於包含SEQ ID NO=I所提供的胺基酸序列的多肽的s_三嗪和/或二嗪水解活性。在優選實施方案中，比在相同條件下培養的包含編碼SEQ ID NO 1所提供的胺基酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞產生更多的可溶性生物學活性形式的多肽。在另外的特別優選的實施方案中，所述多肽在對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號 159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。在另一實施方案中，所述多肽還額外包含i)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號38的位置處的天冬醯胺；和ii)對應於SEQ ID NO=I的胺基酸編號 131的位置處的脯氨酸、天冬醯胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸。可以被本發明的多肽所水解的S-三嗪的實例包括但不限於莠去津、莠滅淨、撲滅津、撲草淨、西瑪津、西草淨、抑草津、草達津或氰草津。 在實施方案中，所述多肽是融合蛋白還包含至少一種其他多肽序列。該至少一種其他多肽可以是例如增強本發明多肽穩定性的多肽、促進融合蛋白從諸如細菌細胞或酵母細胞的細胞分泌的多肽、或者有助於融合蛋白純化的多肽在另一實施方案中，所述多肽固定於固體支持物上。在另一方面，本發明提供了本發明宿主細胞、本發明植物和/或本發明動物的提取物，其中該提取物包含本發明的多肽。在另外的方面，本發明提供了組合物，其包含本發明的多核苷酸、本發明的載體、 本發明的宿主細胞、本發明的多肽和/或本發明的提取物、以及一種或多種可接受的載體。在另外的方面，本發明提供了水解S-三嗪或二嗪的方法，所述方法包括使S-三嗪或二嗪與本發明的多核苷酸、本發明的載體、本發明的宿主細胞、本發明的多肽、本發明的提取物和/或本發明的組合物接觸。在實施方案中，樣品選自由以下組成的組土壤、水、生物材料或其組合。在另一方面，本發明提供了處理對象中的S-三嗪或二嗪所引起的毒性的方法，所述方法包括給所述對象施用本發明的多核苷酸、本發明的載體、本發明的宿主細胞、本發明的多肽、本發明的提取物和/或本發明的組合物。在另一方面，本發明提供了本發明多核苷酸、本發明載體、本發明宿主細胞、本發明多肽、本發明提取物和/或本發明組合物在製備用於處理對象中的S-三嗪或二嗪所引起的毒性的藥物中的用途。在另一方面，本發明提供了產生能夠水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的方法，所述方法包括在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達的條件下培養編碼所述多肽的本發明的宿主細胞或編碼所述多肽的本發明的載體，以及回收表達的多肽。在另外的方面，本發明提供了檢測宿主細胞的方法，所述方法包括i)使細胞或細胞群在允許所述細胞攝取本發明多核苷酸的條件下與所述多核苷酸接觸，和ii)通過將步驟i)的細胞或其後代細胞暴露於S-三嗪或二嗪來選擇宿主細胞。在實施方案中，所述多核苷酸編碼本發明的多肽。在實施方案中，所述多核苷酸包含第一可讀框，其包含本發明的多核苷酸；以及第二可讀框，其不包含本發明的多核苷酸。
在一個實施方案中，所述第二可讀框編碼多肽。在另一個實施方案中，所述第二可讀框編碼不翻譯的多核苷酸。在這兩種情況下，所述第二可讀框均優選可操作地連接至合適的啟動子。優選地，所述不翻譯的多核苷酸編碼催化性核酸、dsRNA分子或反義分子。在優選實施方案中，所述細胞為植物細胞。在另外的方面，本發明提供了用於水解S-三嗪或二嗪的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的多核苷酸、本發明的載體、本發明的宿主細胞、本發明的多肽、本發明的提取物和/ 或本發明的組合物。在另外的方面，本發明的提供了本發明多肽的晶體。在另一方面，本發明提供了設計多肽的方法，所述多肽具有大於包含SEQ ID NO 1 所提供的胺基酸序列的多肽的S-三嗪和/或二嗪水解活性，所述方法包括使用本發明晶體的原子坐標來從計算上評價S-三嗪或二嗪與候選多肽結合的能力，並選擇具有大於包含 SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽的S-三嗪和/或二嗪水解活性的多肽。 顯然，本發明一個方面的優選特性和特徵適用於本發明的許多其他方面。在整個本說明書中，詞語「包含(comprise)，，或其變體如「包含(comprises)，，或 「包含(comprising) 」應當被理解為表示包括指定的元件、整體或者步驟，或者元件、整體或步驟的組，但並不排除任何其他元件、整體或步驟，或者元件、整體或步驟的組。通過以下非限制性實施例並參照附圖來描述本發明。


圖1.被本發明的酶降解的各種S-三嗪的結構。圖 2. pETcc2: :egfp 的圖示。圖3.野生型TrzN、TrzN cc3. 2以及中間突變體形式的部分純化。野生型TrzN的值取自Siapir et al. (2005)，從5升產生2. 8mg。包括了分子量標記(泳道M)，並標明了它們的分子量(kDa)。TrzN及其變體的位置用箭頭標出。從TrzN及其變體的相同純化物添加等體積(5 μ 1)至至每個泳道。圖4. TrzN結構的示意圖及卡通圖(cartoon)。TrzN形成99. 6kDa的同源二聚體。 每個單體分成兩個結構域β夾層結構域和β /CI8桶結構域。β /CI8桶在上表面具有若干環插入，其用於修飾活性位點入口(entrace)，或另外形成二聚體界面。圖5.圖示構成TrzNcc3.2底物結合袋的殘基。莠去津、Si2+中心和氫氧根離子 (0H_)顯示在中心。組成底物結合袋的胺基酸的名稱和序列被標出。圖6. Apo-TrzNcc3. 2用Zn2+飽和。以2. 6 μ M ZnCl2恢復一半的最大活性。圖7.活性位點胺基酸殘基和金屬配位(coordinating)胺基酸殘基的圖示。莠去津、Zn2+和氫氧根離子(0H_)顯示在中心，並表示出相關殘基的名稱和序列。圖8.描述TrzN的推測的反應機理的圖示。圖9. TrzN與莠滅淨的速率常數(k。at)和反應緩衝液pH之間的關係。圖10. TrzNcc3. 2的田野實驗結果。添加TrzNcc3. 2後10. 5小時，1. 5ML蓄水壩 (holding dam)中莠去津耗盡。通過QHFSS (方框)和CSIRO Entomology (圓圈)分析樣品。
序列表說明SEQ ID NO 野生型TrzN的胺基酸序列SEQ ID NO :2_編碼iTrzN(TrzNco)的密碼子優化的可讀框SEQ ID NO :3_編碼TrzN的密碼子優化的可讀框，且第156位密碼子從TTT變為 TTC (Trz Li)SEQ ID NO :4_編碼野生型TrzN的可讀框SEQ ID NO 5至30-寡核苷酸引物發明詳述一般技術和定義除非另外具體定義，本文所用的所有技術和科學術語與本領域技術人員的通常理解的具有相同的含義(如，在細胞培養、生物整治、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學和生物化學中)。除非另外指出，本發明所用的重組蛋白、細胞培養和免疫學技術是本領域技術人員已知的標準方法。這樣的技術在諸如以下文獻中有描述和解釋J.Pertal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology :A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning :A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至目前所有的更新)， Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J. E. Coligan et al. (editors)Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons (包括至目前所有的更新)。本文所用的術語「水解(hydrolyses) 」、「水解(hydrolysing) 」、「水解活性」及其變體指本發明的多肽催化化學鍵水解的能力。在優選實施方案中，本發明的酶是一種或多種如下酶脫滷素酶(如氯水解酶、氟水解酶、滷素水解酶、水解脫氯酶、水解脫氟酶和/或水解脫滷素酶)、甲氧基水解酶和甲硫基水解酶。在優選實施方案中，多肽「降解」 S-三嗪或二嗪從而使酶活性的產物比S-三嗪或二嗪底物對例如哺乳動物和/或魚的毒性較低和 /或穩定性較差。本文所用的術語「較高的S-三嗪和/或二嗪水解活性」指本發明的多肽比包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽對S-三嗪或二嗪具有更高的比活性、催化常數(k。at)、 底物特異性(Km)和/或次級速率常數(k。at/Km)，或較高的穩定性。所述比活性可以如實施例所述來確定。本文所用的短語「在對應於胺基酸的位置處」和「對應於胺基酸編號...的位置處」指與周圍胺基酸相比的胺基酸相對位置。例如，在某些實施方案中，本發明的多肽可以具有缺失或取代突變，其在例如與SEQ ID NO :1比對時改變胺基酸的相對位置。在實施方案中，所述多肽包含給定殘基編號處的指定胺基酸。類似地，短語「在對應於核苷酸位置處」和「對應於核苷酸編號...的位置處」指與周圍核苷酸相比的核苷酸相對位置。例如，在某些實施方案中，本發明的多核苷酸可以具有缺失或取代突變，其在例如與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4比對時改變核苷酸的相對位置。在實施方案中，所述多核苷酸包含給定核苷酸編號處的指定核苷酸。本文所用的術語「處理(treating) 」、「處理(treat) 」或「處理(treatment) 」包括施用治療有效量的本發明的多肽、或編碼其的多核苷酸，足以減少或消除S-三嗪或二嗪所引起的毒性的至少一種症狀。術語「生物材料」在本文中以其最廣泛的含義使用以包含生物來源的任何產物。這樣的產物包括但不限於用於人和動物飼餵的食品。所述產物包括液體介質，其包括水和液體食物如奶；以及半固體食物如酸奶等。本發明還拓展至固體食物，特別是動物飼料。在實施方案中，所述生物材料優選為植物材料，例如但不限於甘蔗、油菜籽(canola seed)、小麥種子、大麥種子、高粱種子、大米、玉米、菠蘿或棉籽。本文所用的術語「提取物」指本發明的宿主細胞、植物或非人轉基因動物的任何部分。所述部分可以是完整的實體如植物的種子，或者通過至少部分均質化和/或純化所獲得。此術語包括宿主細胞所分泌的部分，並因此涵蓋培養上清。本文所用的術語「分子伴侶」指功能是輔助其他蛋白實現適當的摺疊或伸展以改變蛋白從細胞輸出的蛋白。分子伴侶在本領域是已知的，包括但不限於核糖體結合蛋白如引發因子(TF) ；Hsp70分子伴侶家族，如Hsp70、DnaK, Hsp40、DnaJ、GrpE ；以及陪伴蛋白分子伴侶家族，如GroEL、GroES, Hsp60、HsplO0作為非限制性實例，來自大腸桿菌的分子伴侶GroEL是分子伴侶的熱休克蛋白60(Hsp60)類的成員，並從大腸桿菌GroE操縱子與 GroES—起表達。GroEL促進蛋白摺疊反應，這是通過結合未摺疊的蛋白，其降低了傾向於聚集的多肽中間體的濃度及偏離途徑(off-pattway)聚集的速率，從而有利於分配為天然構象。已知共陪伴蛋白GroES以及輔因子如ATP、K+和Mg2+進一步增加GroEL介導的多肽摺疊反應的產率。因此，在特定的實施方案中，技術人員會包括本領域已知的組分、輔因子、 另外的分子伴侶蛋白等以改善或增強分子伴侶介導(或輔助)的蛋白摺疊。可以用於編碼GroEL的載體的實例包括但不限於含有dnaK-dnaJ-grpE-groES-groEL的pG_KJE8，含有 groES-groEL ^ pGro7, UR^^ groES-groEL-tig ^ pG-Tf2 (Nishihara et al. , 1998 and 2000)。s-三嗪和二嗪本文所用的「S-三嗪」是有機化合物，其包含具有由3個碳原子和3個氮原子組成的6元雜環芳環的化學結構。三嗪環中的原子是苯環中那些原子的類似物。被本發明的酶水解(降解)的S-三嗪類型的實例包括但不限於氯-S-三嗪、氟-S-三嗪、甲硫基-S-三嗪和甲氧基-S-三嗪。被本發明的酶水解(降解)的某些S-三嗪的化學結構在圖1中提供。在優選實施方案中，S-三嗪具有以下結構-2-R1-4-R2-6-R3-1,3,5-三嗪(trainzine)； 其中 Rl 可以是(1、？1、0013、5013、5(0)013或吧，其中 R2 或 R3 可以是 0CH3、NHCH2CH20H、 NH (CH2) 2CH3、NH (CH2) 3CH3、NHCH2CH (CH3) 2、NHCH (CH3) CH2CH3、NHC (CH3) 2CN、NHC (CH3) 3、 NH2 或 OH。氯化的(氯)S-三嗪包含至少一個氯。氯化S-三嗪的實例包括但不限於莠去津(6-氯-N-乙基-N' -(1-甲基乙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺)(見圖1)、可樂津(chl0razine，6-氯-N，N，N' , N'-四乙基 _1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、氰草津(2-[[4_氯-6-(乙基氨基)-1，3，5_三嗪-2-基]氨基]-2-甲基丙腈)、環丙津(cyprazine, 6-氯-N-環丙基-N' -(1-甲基乙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺)、甘草津(eglinazine， N-[4-氯-6-(乙基氨基)-l，3，5-三嗪-2-基]甘氨酸)、抑草津(6-氯-N，N-二乙基-N' -(1-甲基乙基)-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、滅莠津(1^80 儀2丨116，6-氯-^(3-甲氧基丙基)-N' (1-甲基乙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺)、環丙青津(procyazine， 2-[ [4-氯-6-(環丙基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-2-甲基丙腈)、甘撲津 (proglinazine, N_[4_氯_6_[ (1-甲基乙基)氨基]_1，3，5-三嗪-2-基]甘氨酸)、撲滅津(6-氯-N，N'-雙(1-甲基乙基)_1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、另丁津(sebuthylazine， 6-氯-N-乙基-N' -(1-甲基丙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺、西瑪津(6-氯-N，N' -二乙基-1，3，5-三嗪-2，4- 二胺)、草淨津(terbuthylazine，6-氯-N-(1，1- 二甲基乙基)-N'-乙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和草達津(6-氯-N，N，N'-三乙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)以及氯-S-三嗪脫烷基化的產物(包括莠去津脫烷基化，如脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津)。甲硫基-S-三嗪包含至少一個硫醇(thiol)基。甲硫基-S-三嗪的實例包括但不限於莠滅淨(N2-乙基-N4-異丙基-6-甲硫基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、撲草淨(N2， N4-二異丙基-6-甲硫基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和西草淨(N2，N4-二乙基-6-甲硫基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)。甲氧基-S-三嗪包含至少一個甲氧基。甲氧基-S-三嗪的實例包括但不限於莠去通(N2-乙基-N4-異丙基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、西瑪通(N2，N4-二乙基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和撲滅通(N2，N4-二異丙基-6-甲氧基_1，3， 5-三嗪-2，4-二胺)。氟-S-三嗪包含至少一個氟。氟-S-三嗪的實例為氟莠去津(2-氟-4-N-乙基氨基-6-N-異丙基氨基-1,3,5-三嗪)。在實施方案中，S-三嗪具有至少一個N-乙基、N-異丙基、N-二乙基和/或N-氰基二甲基甲基烷基側鏈。在優選實施方案中，二嗪具有以下結構-2-Rl-4-R2-6-R3_l，3-嘧啶；其中Rl可以是 Cl、Fl、0CH3、SCH3、S (0) CH3 或 N3，其中 R2 或 R3 可以是 0CH3、NHCH2CH20H、NH (CH2) 2CH3、 NH (CH2) 3CH3、NHCH2CH (CH3) 2、NHCH (CH3) CH2CH3、NHC (CH3) 2CN、NHC (CH3) 3、NH2 或 0H。二嗪類型的實例包括但不限於氯-S- 二嗪和氟-S- 二嗪。作為除草劑的二嗪的實例為除草定 (5-溴-3-叔丁基-6-甲基尿嘧啶)。多肽「基本上純化的」或「純化的」表示這樣的多肽，其已從該多肽在天然狀態相伴的一種或多種脂質、核酸、其他多肽或其他汙染分子中分離。優選地，基本上純化的多肽為至少 60%不含該多肽天然相伴的其他組分、更優選至少75%、更優選至少90%。然而，目前還沒有本發明多肽在自然中存在的證據。以多肽為背景的術語「重組」指當由細胞或在無細胞表達系統中產生時，與天然狀態相比量發生改變或速率發生改變的多肽。在一個實施方案中，所述細胞是天然不產生所述多肽的細胞。然而，所述細胞可以是包含非內源基因的細胞，所述非內源基因導致所產生的多肽的量發生改變優選增加。本發明的重組多肽包括尚未與產生其的轉基因(重組)細胞或無細胞表達系統的其他組分分離的多肽；和在這樣的細胞或無細胞系統中產生並隨後隨後從至少某些其他組分純化分離的多肽。術語「多肽」與「蛋白」通常可互換使用，並指單一多肽鏈，其可以被或未被非胺基酸基團的添加所修飾。應當理解，這樣的多肽鏈可以與其他多肽或蛋白或者其他分子如輔因子相結合。本文所用的術語「蛋白」和「多肽」還包括本文所述的多肽的變體、突變體、生物學活性片段、修飾物、類似物和/或衍生物。多肽的％ 同一性通過 GAP (Needleman and ffunsch, 1970)分析(GCG program)以缺口建立(gap creation)罰分=5和缺口延伸罰分=0.3來確定。查詢序列的長度為至少25個胺基酸，GAP分析在至少25個胺基酸的區域上比對兩個序列。更優選地，查詢序列的長度為至少50個胺基酸，GAP分析在至少50個胺基酸的區域上比對兩個序列。更優選地，查詢序列的長度為至少100個胺基酸，GAP分析在至少100個胺基酸的區域上比對兩個序列。更優選地，查詢序列的長度為至少250個胺基酸，GAP分析在至少250個胺基酸的區域上比對兩個序列。更優選地，查詢序列的長度為至少400個胺基酸，GAP分析在至少400 個胺基酸的區域上比對兩個序列。更優選地，GAP分析在其全長上比較兩個序列。本文所用的「生物學活性片段」是本文所述的多肽的部分，其保留了全長多肽指定的活性。生物學活性片段可以是任何大小，只要它們保留指定的活性。優選地，生物學活性片段的長度為至少100個胺基酸，更優選至少400個胺基酸。優選實施方案涉及以「可溶性生物學活性形式」產生的多肽。本領域技術人員應當理解，這指的是當在細胞中表達時，多肽不以不溶並因而失活的形式存在。此外，生物學活性表示水解S-三嗪和/或二嗪的能力。對於指定的多肽，應當理解，高於上文所提供的那些％同一性數字的％同一性數字涵蓋了優選的實施方案。因此，當可用時，對於最小的％同一性數字，優選所述多肽包含這樣的胺基酸序列，其與相關指定的SEQ ID NO具有至少50%的同一性，更優選具有至少 60%的同一性，更優選具有至少70%的同一性，更優選具有至少75%的同一性，更優選具有至少80 %的同一性，更優選具有至少85 %的同一性，更優選具有至少90 %的同一性，更優選具有至少91%的同一性，更優選具有至少92%的同一性，更優選具有至少93%的同一性，更優選具有至少94%的同一性，更優選具有至少95%的同一性，更優選具有至少96% 的同一性，更優選具有至少97 %的同一性，更優選具有至少98 %的同一性，更優選具有至少99%的同一性，更優選具有至少99. 的同一性，更優選具有至少99. 2%的同一性，更優選具有至少99. 3%的同一性，更優選具有至少99. 4%的同一性，更優選具有至少99. 5% 的同一性，更優選具有至少99. 6%的同一性，更優選具有至少99. 7%的同一性，更優選具有至少99. 8%的同一性，更優選具有至少99. 9%的同一性。本文所述多肽的胺基酸序列突變體可以通過向本文指定的核酸引入合適的核苷酸改變，或通過期望多肽的體外合成來製備。這樣的突變體包括例如胺基酸序列中殘基的缺失、插入或取代。可以組合進行缺失、插入和取代以達到最終的構建物，只要該最終構建物具有期望的特徵。突變體(改變的)多肽可以利用本領域已知的任何技術來製備。例如，可以對本文所述的多核苷酸進行體外誘變。這樣的體外誘變技術可以包括將多核苷酸亞克隆入合適的載體，將載體轉化入「增變(mutator)」菌株如大腸桿菌XL-I red (Stratagene)並使轉化的細菌增殖合適的代數。在另一實例中，對本發明的多核苷酸進行Harayama(1998)所廣泛描述的DNA混編技術。源自突變/改變的DNA的產物可以容易地利用本文所述的技術進行篩選，以確認它們是否能夠賦予期望的表型，如增強的活性和/或改變了的底物特異性。在設計胺基酸序列突變體中，突變位點的位置和突變的性質取決於要修飾的特徵。突變的位點可以單獨或系列地修飾，例如通過(1)首先用保守胺基酸選擇來取代，然後根據獲得的結果用更激進的選擇(radical selection)進行取代；( 缺失靶殘基；或者 (3)向相鄰位點插入其他殘基。胺基酸序列缺失的範圍一般為約1-15個殘基，更優選約1-10個殘基，並且通常為約1-5個連續殘基。取代突變體在多肽分子中移除至少一個胺基酸殘基並在該位置插入不同的殘基。 取代誘變最感興趣的位點包括鑑定為對功能重要的位點。其他感興趣的位點是得自各種菌株或物種的特定殘基相同的那些位點。這些位置對生物學活性可能是重要的。這些位點， 特別是位於至少3個其他相同的保守位點的序列中的那些位點，優選地以相對保守的方式取代。這樣的保守性取代示於表1中。在優選的實施方案中，突變體/變體多肽與本文特別定義的多肽相比具有1或2 或3或4個保守性胺基酸改變。保守性胺基酸改變詳細示於表1中。在優選實施方案中，多肽包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列，並且具有一個或多個以下胺基酸取代或者對應於其胺基酸位置處的取代I2T、F13L、L26M, D28E, A34D、 D38N、S43G、M53L、Y67F、S84R、L90M、T91S、D99G、K101R、D105E、D105G、V106A、I107T、E109A、 I123V、L131P、L131N、L131T、L131D、L131V、L131G、L131C、L131S、L131Q、L131H、L131Y、 L131I、T137I、S140R、T150S、F156L、A159T、A159V、S161G、M163I、F177L、D182E、D182G、 R183H、G190D、G190S、Y195F、E197K、P210A、V213I、M227I、M227I、A229V、D230E、L243P、 L243G、G246A、G246S、G246D、G246E、G246K、G246V、D249N、A294T、A294S、A294L、I310V、 Y313F、L314P、V320E、L335M、D350N、D350Y、D350F、D350R、D350H、R365H、L396M、V399A、 A408V、V424I、V429D、V437I 和 L451M。表1.示例性取代
權利要求
1.編碼水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的分離的和/或外源多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽具有至少40%的同一性，並且i)當在細菌細胞中表達時，比在相同條件下培養的包含含SEQID NO :2或SEQ ID NO: 4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞產生更多的多肽，和/或ii)所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大於包含SEQID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其編碼多肽，所述多肽在對應於SEQID N0:1的胺基酸編號159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其包含SEQID NO 2或SEQ ID NO 4所提供的核苷酸序列，具有一或多個以下核苷酸取代或者對應於其核苷酸位置處的取代T5C，C39A， C76A, C84A, T87C, C101A, T108A, T108A, G112A, A127G, C135T, A157T, C165T, G168A, C180T,C189T,Α200Τ,C207T,G210A,G225T,A228G,C229T,T240C,A250C,C268A,G270A,Α271Τ,Τ273Α,C279T,A296G,A302G,A303G,A314G,C315A,T317C,T320C,A326C,A333G,T336C,C346T,G357A,A367G,C372T,C375A,C381T,T384C,C391A,C391G,C391T,T392C,Τ392Α,T392G,G393C,T399C,C410T,C411A,C411T,A414G,A418C,T423C,Τ426Α,Α432Τ,C438T,C449G,C454T,T466C,T468C,T471C,C474T,G475A,C476T,A481G,C483T,G489A,G489T,T498C,Τ531Α,A537G,A540G,A545G,T546G,G548A,T555C,T555C,C564T,G567A,G567A,G568A,G569A,G573C,T579C,Α584Τ,G589A,A600G,T618C,T618C,T627C,C628G,G630A,C633T,G637A,T639C,T639C,A654G,G660A,G660T,T663C,C675A,G681T,C686T,C690A,C696T,G705A,A723G,C727G,T728C,T728G,G729C,G736A,G737C,G737A,G737T,T738G,T738C,T738C,G745A,G753C,G768A,Τ774Α,C807A,Τ840Α,A843G,Α852Τ,A855G,C867T,T879C,G880A,G880T,G880C,C881T,G882T,C885T,G897A,T900C,Τ906Α,A928G,Α938Τ,T941C, C957A, T959A, C972T, T978A, C981T, C993T, C999T, C1003A, C1003T, T1011C, G1048A, G1048T，G1048C，A1049T，A1049G，G1053A，A1059G，A1086G，G1094A，T1101C，T1101G，C1128T， A1152G，G1176T，C1186A，C1186T，T1196C，C1203T，G1221A，C1223T，C1236T，G1248T，G1270A， C1278T, T1286A, T1305C, G1309A, C1321T, A1326G, C1329T, C1329T, C1332T, C1344A, C1351A 和 G1353T。
4.如權利要求1-3任一項所述的多核苷酸，其編碼包含SEQID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽，具有一或多個以下胺基酸取代或者在對應於其胺基酸位置處的取代I2T， F13L, L26M, D28E, A34D, D38N, S43G, M53L, Y67F, S84R, L90M, T91S, D99G, K101R, D105E, D105G, V106A, Ι107Τ, Ε109Α, I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I, Τ137Ι, S140R, T150S, F156L, Α159Τ, A159V, S161G, Μ163Ι, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, Ε197Κ, Ρ210Α, V213I, Μ227Ι, Μ227Ι, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, Α294Τ, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 和 L451M。
5.如權利要求1-4任一項所述的多核苷酸，其在對應於SEQID NO 2或SEQ ID NO 4 的核苷酸編號468的位置處包含胞嘧啶。
6.如權利要求1-5任一項所述的多核苷酸，其編碼多肽，所述多肽包含i)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號67的位置處的苯丙氨酸；和/或ii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號91的位置處的絲氨酸，和/或iii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號131的位置處的脯氨酸、天冬醯胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；和/或iv)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號159的位置處的蘇氨酸或纈氨酸；和/或 ν)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號161的位置處的甘氨酸；和/或vi)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號210的位置處的丙氨酸；和/或vii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號243的位置處的脯氨酸或甘氨酸；和/或viii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號Μ6的位置處的天冬氨酸、絲氨酸、穀氨酸、 賴氨酸、纈氨酸或丙氨酸；和/或ix)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號四4的位置處的蘇氨酸、絲氨酸或亮氨酸；和/或χ)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號335的位置處的甲硫氨酸；和/或xi)對應於SEQID NO :1的胺基酸編號350的位置處的酪氨酸、天冬醯胺、苯丙氨酸、 精氨酸或組氨酸；和/或xii)i)至xi)的任一種的生物學活性片段。
7.如權利要求1-5任一項所述的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽，具有以下胺基酸取代或取代組之一或者對應於其胺基酸位置處的一或多個取代i)Y313Fii)Y67Fiii)A159Viv)A159V,L243Pv)D350Yvi)G190D,M227Ivii)A159Tviii)A408Vix)L26M,S161Gx)F13L,A34D, G246A,D350Yxi)T137I,S140Rxii)L335Mxiii)P210Axiv)A294Txv)I123Vxvi)Y67F,V437Ixvii)M163I,D249Nxviii)T137Ixix)G246Sxx)L90Mxxi)A159V,L243P, L451Mxxii)T150S,A159V, A229V, D230E, L243Pxxiii)Y67F,L335Mxxiv)Y67F, K101R, A294Txxv)L335Mxxvi)V106A,S161G, F177L, L335Mxxvii)S43G, I107T, A159V, D350Yxxviii)M53L,T137I, S140R, D182G, G190S, D350Yxxix)A159V,L335M,D350Yxxx)D28E,A294T, D350Nxxxi)P210A,V424Ixxxii)A159V,G190Dxxxiii)P210A,A294T, R365H, D350Yxxxiv)I123V,S161G, A294Txxxv)Y67F, A159V, D350Yxxxvi)T91S,A159V,A294Txxxvii)Y67F,A 159V, L243Pxxxviii)A159V,P210Axxxix)A159V,I310V, L335M, L396M,L243Pxl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335Mxli)A159V, L335Mxlii)S84R, D105G, A159Vxliii)Y67F, A294Txliv)A159V, D182E, L335M, D350Yxlv) Y67F, A159V, L243Pxlvi)D38N, A159Vxlvii)A159V, M163I, Y195F, D350Yxlviii)F156L, P210A, D350Yxlix)Y67F, D350Y1)A159V, D350Yli)Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335Mlii)E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429Dliii)A159V, L335Mliv) Y67F, A159V, L335M, D350Ylv)D38N, L131P, A159Vlvi)T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y lvii)R183H, P210A,D350Y lviii)Y67F, A159V,D350Y lix)A159V, P210A, A294T, D350Nlx) Y67F, A159V, D350N lxi)A159V, L335M, D350Y lxii)P210A, A294T, D350Y lxiii)T91S, A159V, A294T lxiv) P210A, A294T, L335M,或 lxv)Y67F, L335M。
8.如權利要求1-5任一項所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所提供的核苷酸序列，具有以下核苷酸取代或取代組之一或者對應於其核苷酸位置處的一或多個取代i)T468C,ii)T468C,A938T,iii)A200T,G210A,T468C,iv)T468C,C476T, G753C, ν)T468C, C476T, T728C,vi)T468C,1048T,vii)T384C,T468C, G569A, G681T,viii)T468C,G475A,ix)C279T, T468C, C1223T, C1329T,x)C76A, T468C, A481G,xi)C39A,C101A, T468C,T639C,G737C, G1048T,xii)C410T,A418C, T468C, A600G,xiii)T468C,G705A,C 1003A,xiv)T468C,G573C,xv)T468C, C474T, C628G, C1278T,xvi)T399C,T468C, G880A, T900C,xvii)T468C,C1236T,xviii)T87C,A367G,T468C,xix)T468C,G1176T,xx)C135T,T468C, C1344A,xxi)T468C,A852T,xxii)T468C,T738C,xxiii)C454T,T468C,xxiv)A200T,T468C, G1309A,xxv)T468C, G489T, G745A,xxvi)C410T,T468C,xxvii)T468C,G736A,xxviii)G225T,C268A, A414G, T468C, T627C, C1321T,xxix)A432T,T468C, T471C, C476T, T728C, G1053A, C1351A,xxx)A303G,C449G, T468C, C476T, C686T, C690A, T728C, C1128T,xxxi)A200T,G210A, C372T, T468C, A654G, C1003A,xxxii)C180T,A200T, A302G, C375A, T399C, C411T, T468C, A540G, G880A, T900C,xxxiii)C229T,T468C,G705A, C1003A,xxxiv)T317C,T468C, A481G, T531A, G753C, T906A, T978A, C1003A, A1326G,xxxv)A127G,T320C, T468C, C476T, G753C, G1048T,xxxvi)A157T,C410T, A418C, T468C, A545G, G568A, A600G, C628G, G630A, G1048T, C1332T,xxxvii)T468C,C476T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,xxxviii)C84A,T399C, T468C, C483T, G880A, T900C, G1048A,xxxix)T468C, T498C, C628G, C885T, A1086G, G1270A, xl)T384C, T468C, C476T,G569A,G753C,A1152G, xli)T336C, T468C, C476T, A537G, C564T, xlii)A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, G1048T, G1094A, xliii)T273A, A367G, C381T, T399C, T468C, A481G, G880A, T900C, xliv)A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, G1048T, A1059G, xlv)A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1236T, xlvi)A200T, G210A, C346T, T468C, C476T, T579C, T728C, C1278T, xlvii)C438T, T468C, C476T,A855G,xlviii)G168A, T426A, T468C, C476T, C628G, C1203T, T1305C,xlix)T468C, C476T, T663C, C1236T,1)T384C, T468C, C476T, T728C, A928G, C1003A, C1186A,li)T5C, C315A, T468C, C476T, G589A, G681T, T728C, G897A, C1003A,lii)C279T, T468C, C476T,C1003A,liii)A250C, A314G, T468C, C476T,liv)A200T, G210A,T468C,T555C,G880A,T900C,lv) T468C, C476T, T546G, C696T, C1003A, G1048T,lvi)A200T, G210A, T468C, C476T, T728C, T1101G,lvii)G112A, C165T, T468C, C476T, T618C, G753C, C999T, T1101C,lviii)T423C, T468C, C476T, G489A, A584T, G753C, G1048T,lix)T466C, T468C, C474T, C628G, G1048T,lx)T 108A, A200T, G210A, G357A, T468C, G1048T, A1059G, C1278T lxi)T468C, C476T, G567A, G753C, G1048T, lxii)A200T, G210A, A296G, T468C, C476T, G637A, T728C, C1003A, lxiii)C189T, A326C, T468C, C476T, T941C, T959A, A1059G, C1186T, T1196C, G1248T, T1286A,lxiv) T468C, C476T, C1003A,lxv)A200T, G210A, C279T, T468C, C476T, T879C, C1003A, G1048T, lxvi)G112A, C165T, T392C, T468C, C476T, T618C, G660A, C675A, G753C, C807A, C993T, C999T, T1101C, T1305C,lxvii)A271T, T392C, T468C, C476T, G753C, G880A, G1048T, G1094A, C1186A, G1221A,lxviii)A228G, T240C, T468C, G548A, C628G, G1048T, C1332T,lxix)T108A, A200T, G210A, T423C, T468C, C476T, G567A, G1048T,lxx)T384C, T468C, C476T, C628G, C867T, G880A, T900C, C981T, G1048A, A1326G,lxxi)A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, T840A, T900C, G1048A,lxxii)T468C, C476T, C633T, G660T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,lxxiii)A228G, T240C, G270A, T468C, C628G，880A，G1048T,lxxiv)A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1003T, C1236T,lxxv)A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, C957A, C1003A, orlxxvi)A200T，G210A,C411A,T468C,T555C,T639C，A654G，G768A,T774A,C972T, C1003A, T1011C, G1353T.
9.如權利要求1-8任一項所述的多核苷酸，其中所述s-三嗪是莠去津、莠滅淨、撲滅津、撲草淨、西瑪津、西草淨、抑草津、草達津或氰草津。
10.如權利要求1-9任一項所述的多核苷酸，其中所述細菌細胞是大腸桿菌。
11.如權利要求1-10任一項所述的多核苷酸，其包含與SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 4具有至少90%同一性的序列。
12.如權利要求1-11任一項所述的多核苷酸，其可操作地連接於能指引所述多核苷酸在細胞中表達的啟動子。
13.如權利要求1-12任一項所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。
14.一種包含權利要求1-13任一項所述多核苷酸的載體。
15.一種宿主細胞，其包含權利要求1-13任一項所述的多核苷酸和/或權利要求14所述的載體。
16.如權利要求15所述的宿主細胞，其還包含編碼分子伴侶的外源多核苷酸。
17.如權利要求15或16所述的宿主細胞，其是細菌細胞、酵母細胞或植物細胞。
18.一種轉基因植物，其包含至少一種權利要求15-17任一項所述的細胞。
19.一種轉基因非人類動物，其包含至少一種權利要求15或權利要求16所述的細胞。
20.水解S-三嗪和/或二嗪的基本上純化的和/或重組的多肽，其中所述多肽與包含 SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽具有至少40%的同一性，並且其中i)當在細菌細胞中表達時，比在相同條件下培養的包含編碼所述SEQID N0:1所提供的胺基酸序列的外源多核苷酸的同基因細菌細胞產生更多的多肽，和/或ii)所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大於包含SEQID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽。
21.如權利要求20所述的多肽，其在對應於SEQID NO 1的胺基酸編號159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。
22.權利要求20或21所述多肽，包含SEQID NO :1提供的胺基酸序列，具有一或多個以下胺基酸取代或者對應於其胺基酸位置處的取代I2T，F13L，L26M，D28E，A34D，D38N， S43G,M53L,Y67F,S84R,L90M,T91S,D99G,K101R,D105E,D105G,V106A,I107Τ,Ε109Α,I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I,T137I, S140R, T150S, F156L, A159T, A159V, S161G, M163I, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, E197K, P210A, V213I, M227I, M227I, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, A294T, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 和 L451M。
23.如權利要求20-22任一項所述的多肽，其包含i)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號67的位置處的苯丙氨酸；和/或ii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號91的位置處的絲氨酸，和/或iii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號131的位置處的脯氨酸、天冬醯胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；和/或iv)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號159的位置處的蘇氨酸或纈氨酸；和/或 ν)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號161的位置處的甘氨酸；和/或vi)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號210的位置處的丙氨酸；和/或vii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號243的位置處的脯氨酸或甘氨酸；和/或viii)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號Μ6的位置處的天冬氨酸、絲氨酸、穀氨酸、 賴氨酸、纈氨酸或丙氨酸；和/或ix)對應於SEQID NO 1的胺基酸編號四4的位置處的蘇氨酸、絲氨酸或亮氨酸；和/或χ)對應於SEQ ID NO 1的胺基酸編號335的位置處的甲硫氨酸；和/或xi)對應於SEQID NO :1的胺基酸編號350的位置處的酪氨酸、天冬醯胺、苯丙氨酸、 精氨酸或組氨酸；和/或xii)i)至xi)的任一種的生物學活性片段。
24.如權利要求20-22任一項所述的多肽，其包含SEQID NO :1所提供的胺基酸序列， 具有以下胺基酸取代或取代組之一或者對應於其胺基酸位置處的一或多個取代i)Y313Fii)Y67Fiii)A159Viv)A159V,L243Pv)D350Yvi)G190D,M227Ivii)A159Tviii)A408Vix)L26M,S161Gx)F13L,A34D, G246A,D350Yxi)T137I,S140Rxii)L335Mxiii)P210Axiv)A294Txv)I123Vxvi)Y67F,V437Ixvii)M163I,D249Nxviii)T137Ixix)G246Sxx)L90Mxxi)A159V,L243P,L451Mxxii)T150S,A159V, A229V, D230E, L243Pxxiii)Y67F,L335Mxxiv)Y67F, K101R, A294Txxv)L335Mxxvi)V106A,S161G, F177L, L335Mxxvii)S43G, I107T, A159V, D350Yxxviii)M53L,T137I, S140R, D182G, G190S, D350Yxxix)A159V,L335M,D350Yxxx)D28E,A294T, D350Nxxxi)P210A,V424Ixxxii)A159V,G190Dxxxiii)P210A,A294T, R365H, D350Yxxxiv)I123V,S161G, A294Txxxv)Y67F, A159V, D350Yxxxvi)T91S,A159V,A294Txxxvii)Y67F,A159V, L243Pxxxviii)A159V,P210Axxxix)A159V,I310V, L335M, L396M,L243Pxl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335Mxli)A159V, L335Mxlii)S84R, D105G, A159Vxliii)Y67F, A294Txliv)A159V, D182E, L335M, D350Yxlv) Y67F, A159V, L243Pxlvi)D38N, A159Vxlvii)A159V, M163I, Y195F, D350Yxlviii)F156L, P210A, D350Yxlix)Y67F, D350Y1)A159V, D350Yli)Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335M lii)E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429D liii)A159V, L335M liv) Y67F, A159V, L335M, D350Ylv)D38N, L131P, A159Vlvi)T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Ylvii)R183H, P210A,D350Ylviii)Y67F, A159V,D350Ylix)A159V, P210A, A294T, D350Nlx)Y67F, A159V, D350Nlxi)A159V, L335M, D350Ylxii)P210A, A294T, D350Ylxiii)T91S, A159V, A294Tlxiv) P210A, A294T, L335M,或lxv)Y67F, L335M。
25.如權利要求20- 任一項所述的多肽，其中所述s-三嗪是莠去津、莠滅淨、撲滅津、 撲草淨、西瑪津、西草淨、抑草津、草達津或氰草津。
26.如權利要求20-25任一項所述的多肽，其具有比包含SEQID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽高至少2倍的莠去津水解活性。
27.如權利要求2046任一項所述的多肽，其是還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。
28.如權利要求20-27任一項所述的多肽，其固定於固體支持物上。
29.權利要求15-17任一項所述宿主細胞、權利要求18所述植物和/或權利要求19所述動物的提取物，其中所述提取物包含權利要求20- 任一項所述的多肽。
30.一種組合物，其包含權利要求1-13任一項所述的多核苷酸、權利要求14所述的載體、權利要求15-17任一項所述的宿主細胞、權利要求20- 任一項所述的多肽和/或權利要求四所述的提取物，以及一種或多種可接受的載體。
31.一種水解S-三嗪或二嗪的方法，所述方法包括使S-三嗪或二嗪與權利要求1-13 任一項所述的多核苷酸、權利要求14所述的載體、權利要求15-17任一項所述的宿主細胞、 權利要求20- 任一項所述的多肽、權利要求四所述的提取物和/或權利要求30所述的組合物接觸。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述S-三嗪或二嗪在樣品中，所述樣品選自由以下組成的組土壤、水、生物材料或其組合。
33.處理對象中由S-三嗪或二嗪所引起的毒性的方法，所述方法包括向所述對象施用權利要求1-13任一項所述的多核苷酸、權利要求14所述的載體、權利要求15-17任一項所述的宿主細胞、權利要求20- 任一項所述的多肽、權利要求四所述的提取物和/或權利要求30所述的組合物。
34.權利要求1-13任一項所述的多核苷酸、權利要求14所述的載體、權利要求15-17 任一項所述的宿主細胞、權利要求20- 任一項所述的多肽、權利要求四所述的提取物和 /或權利要求30所述的組合物在製備用於處理對象中由S-三嗪或二嗪所引起的毒性的藥物中的用途。
35.一種產生能夠水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的方法，所述方法包括在允許表達編碼所述多肽的多核苷酸的條件下培養編碼所述多肽的權利要求15-17任一項所述的宿主細胞、或編碼所述多肽的權利要求14所述的載體，並回收所表達的多肽。
36.一種檢測宿主細胞的方法，所述方法包括i)使細胞或細胞群在允許所述細胞攝取權利要求1-13任一項所述的多核苷酸的條件下與所述多核苷酸接觸，和 )通過將步驟i)的細胞或其後代細胞暴露於S-三嗪或二嗪來選擇宿主細胞。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述多核苷酸編碼權利要求20- 任一項所述的多肽。
38.如權利要求36或37所述的方法，其中所述多核苷酸包含第一可讀框，其包含權利要求1-13任一項所述的多核苷酸；以及第二可讀框，其不包含權利要求1-13任一項所述的多核苷酸。
39.一種用於水解S-三嗪或二嗪的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求1-13任一項所述的多核苷酸，權利要求14所述的載體、權利要求15-17任一項所述的宿主細胞、權利要求 20-28任一項所述的多肽、權利要求四所述的提取物和/或權利要求30所述的組合物。
40.權利要求20-27任一項所述多肽的晶體。
41.一種設計多肽的方法，所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大於包含SEQ ID NO :1所提供的胺基酸序列的多肽，所述方法包括使用權利要求40所述晶體的原子坐標來從計算上評價S-三嗪或二嗪與候選多肽結合的能力，並選擇具有大於包含SEQ ID NO 1 所提供的胺基酸序列的多肽的S-三嗪和/或二嗪水解活性的多肽。
全文摘要
本發明涉及用於降解諸如莠去津的s-三嗪以及二嗪的多肽。還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。本發明還提供了這些多核苷酸和多肽在s-三嗪和二嗪生物整治中的用途。
文檔編號C12N9/14GK102245762SQ200980143896
公開日2011年11月16日 申請日期2009年9月2日 優先權日2008年9月3日
發明者C·J·傑克遜, C·W·科潘, C·斯科特, J·G·奧克肖特, R·J·拉塞爾 申請人:聯邦科學技術研究組織