一種用於檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測方法
2023-07-24 07:55:21 1
一種用於檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測方法
【專利摘要】本發明通過對GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對分析，在基因組多聚酶基因編碼區(1b區)設計了一對簡併引物hCoV-For和hCoV-Rev用於對人冠狀病毒的通用定性檢測。上遊引物序列hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下遊引物序列hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴增目的片段大小為605bp。分別提取HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1陽性樣本的RNA，通過One-step RT-PCR對該通用引物對進行驗證。結果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進行One-step RT-PCR反應後都能擴增出大小約600bp的單一目的條帶。對PCR產物進行測序驗證，結果表明擴增序列正確且不存在交叉反應。本發明可用於對人冠狀病毒感染的核酸快速定性檢測。
【專利說明】一種用於檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子生物學和病毒學領域，更具體涉及一種新的利用一對簡併引物， 通過One-step RT-PCR反應即可達到對人冠狀病毒感染定性檢測的目的。
【背景技術】
[0002] 冠狀病毒（Coronavirus)在病毒學分類上屬於巢式病毒目（orderNidovirals)、 冠狀病毒科（family Coronavirade)、冠狀病毒屬（genus Coronavirus)的成員，基因組為 單鏈、正鏈的RNA，全長在26?32kb之間，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒。冠狀 病毒在自然界的感染普非常廣泛，常見的哺乳類動物如犬、貓、鼠、豬、牛以及家禽類等都易 感。近幾年來，又從白鯨、駱駝，尤其是蝙蝠體內分離到多種類型的冠狀病毒。冠狀病毒依 據核酸序列的系統發生分析，國際病毒學分類委員會（ICTV，2012)在第九次報告中將冠狀 病毒屬又分成了 α、β、γ及δ共四個亞組。人及其他哺乳類冠狀病毒主要位於α和β 亞組，禽類及其它鳥類冠狀病毒主要位於γ和S亞組。冠狀病毒感染後，能夠侵害機體的 呼吸道、消化道、肝臟、腎臟以及神經系統等多種器官，造成不同程度的病理性損，從而引起 不同程度的病理性疾病，嚴重者甚至能造成死亡。
[0003] 人冠狀病毒目前已知共有六種，分別是二十世紀60年代最早發現的人冠狀病毒 229E(Human coronavirus 229E，HCoV-229E)和HC〇V-〇C43 ;2002?2003年在我國廣東地區 出現並迅速爆發的嚴重急性呼吸道症候群（Severe acute respiratory syndrome, SARS) 冠狀病毒SARS-CoV ;2004年在荷蘭分離的新型人冠狀病毒HCoV-NL63 ;2005年在香港鑑定 的新型人冠狀病毒HCoV-HKUI以及2012年在中東地區出現的新型中東呼吸症候群（Middle East respiratory syndrome, MERS)冠狀病毒 MERS-CoV。其中，HCoV-229E 和 HCoV-NL63 位於α亞組，HC〇V-〇C43和HCoV-HKUI位於β亞組中的2a亞組，SARS-CoV屬於β亞組 中的2b亞組，MERS-CoV屬於β亞組中的2c亞組。分子流行病學研宄表明，人冠狀病毒主 要感染嬰幼兒及免疫功能低下或缺陷者，既能感染上呼吸道引起發熱、咳嗽、喉炎等普通感 冒症狀，又能感染下呼吸道引起支氣管炎、毛細支氣管炎及肺炎等急性呼吸道症狀。其中， SARS-CoV和MERS-CoV感染後能夠引發呼吸系統和腎功能衰竭，嚴重者甚至造成死亡。除 了 SARS-CoV和MERS-CoV外，冠狀病毒在常見人呼吸道病毒感染中的平均檢出率為15% (Perlman S, et al. 2009) 〇
[0004] 冠狀病毒基因組不連續的複製轉錄機制、RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerase, RdRp)複製的低忠實性、廣泛的宿主嗜性使其在進化過程中極易發生鹼基 的插入、缺失以及基因重組或重配，在此過程中新型別或新的冠狀病毒不斷出現。因此，深 入開展冠狀病毒及新出現的冠狀病毒的分子流行病學調查，及時研發新的快速、靈敏的分 子檢測技術對於闡釋冠狀病毒跨種屬傳播的分子機制以及滿足快速診斷的要求等具有重 要意義。目前，人冠狀病毒分子檢測方法主要有常規RT-PCR、real-time RT-PCR及血清學 診斷法。這些方法通常利用特異性引物針及探針對某一特定種類的人冠狀病毒進行單一檢 測，屬於盲篩檢測，不僅費時費力，而且檢測試劑昂貴且容易造成汙染。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是以GenBank上登陸的目前已知的六種人冠狀病毒全基因組序列 為基礎，通過對人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對分析，在基因組多聚酶基因編碼區設 計了一對簡併引物用於對人冠狀病毒的通用定性檢測。
[0006] 本發明提供的技術方案是：
[0007] 一種用於檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，即：hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ;其下遊引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，gp :hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG〇
[0008] 一種用所述通用引物序列檢測人冠狀病毒感染的檢測方法，包括：
[0009] (1)人冠狀病毒檢測通用引物設計
[0010] 通過對GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對分析，在基因 組多聚酶基因編碼區設計了一對簡併引物hC 〇V-F〇r和hCoV-Rev用於對人冠狀病毒感染的 初步確診，引物對序列分別為上遊引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下遊引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴增目的片段大小為 605bp ;
[0011] (2)人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測驗證
[0012] 利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分別從四種人冠狀病毒：HCoV-NL63、 HCoV-0C43、HCoV-229E和HCoV-HKUI的陽性樣本中提取病毒RNA，然後以hCoV-For和 hCoV-Rev為引物對，通過One-step RT-PCR Quick Master Mix對四種人冠狀病毒分別進行 檢測驗證。
[0013] 所述步驟（2)中，對四種人冠狀病毒分別進行檢測驗證的反應體系為25 yL :2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5 yL，50mM Mn(0AC)21. 25 yL，10 μΜ hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 I μ L，病毒 RNA 5 μ L，去離子水 7. 25 μ L ;反應程序為：90°C 30s，60°C 30min，94°C，Imin ; 94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，35個循環；72°C 7min ;反應產物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳後 在紫外燈下觀察結果，結果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev為通用引物進行One-st印RT-PCR反應後都能擴增出大小600bp的單一目的條 帶，PCR產物經測序驗證後序列正確且不存在交叉反應。
[0014] 所述步驟（2)中人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測驗證包括人冠狀病毒 通用引物One-st印RT-PCR檢測靈敏性驗證和人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測 特異性驗證。
[0015] 所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測靈敏性驗證，利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取人冠狀病毒RNA，並用分光光度計進行定量，並通過公式計算出每微升的 拷貝數，將病毒RNA進行稀釋，然後分別取各個稀釋倍數的RNA為模板進行RT-PCR，結果表 明，每反應病毒RNA拷貝數從1. 6x109到1. 6x103是均能擴增出目的條帶，而每反應病毒 RNA拷貝數從1. 6x102到1. 6x100均不能擴增出目的條帶，上述結果表明，該人冠狀病毒通 用引物One-step RT-PCR最低檢測下限為1600拷貝/每反應，與常規單一冠狀病毒檢測所 用 RT-PCR 及 real-time RT-PCR 靈敏性相當；
[0016] 所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測特異性驗證，病毒RNA分別以 HC〇V-NL63、HC〇V-〇C43、HC〇V-229E、HC〇V-HKU1 以及 Influenza virus A、Influenza virus B、諾如病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、人鼻病毒為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為 引物對進行PCR擴增，結果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev為通用引物進行One-st印RT-PCR反應後都能擴增出大小為600bp的單一目的條 帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴增出條帶，表明該人冠狀病毒通用檢測引物對特異 性較好。
[0017] 本發明改變了以往對人冠狀病毒檢測的思路，以GenBank上登陸的目前已知的六 種人冠狀病毒（HCoV-229E、HC〇V-〇C43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKUI 和 MERS-CoV)全 基因組序列為基礎，通過多序列比對在其基因組Ib區設計了一對簡併引物hCoV-For和 hCoV-Rev，通過One-step RT-PCR實現對人冠狀病毒感染快速定性檢測，通過PCR產物測序 即可準確判定人冠狀病毒感染的種類。本發明可用於開發人冠狀病毒感染快速確診的核酸 定性檢測試劑盒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1是人冠狀病毒檢測通用引物設計圖。
[0019] 圖2是人冠狀病毒通用引物對信息圖。
[0020] 圖3是人冠狀病毒通用引物One-St印RT-PCR檢測特異性圖。
【具體實施方式】
[0021] 一種用於檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，即：hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ;其下遊引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，gp :hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG〇
[0022] 一種用通用引物序列檢測人冠狀病毒感染的檢測方法，包括：
[0023] (1)人冠狀病毒檢測通用（簡併）引物設計
[0024] 通過對GenBank上登錄的六種人冠狀病毒包括人冠狀病毒229E (Human coronavirus 229E, HCoV-229E)> HC〇V-〇C43> SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)、HCoV-NL63、HCoV-HKUl 和 MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus)全基因組核酸序列的比對分析，在基因組多聚酶基因編碼區（lb 區）設計了一對簡併引物hCoV-For和hCoV-Rev用於對人冠狀病毒感染的初步確診（如 圖1)，引物對序列分別為上遊引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下遊引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴增目的片段大小為 605bp(其中，HCoV-HKUI 為 608bp)(如圖 2)。
[0025] (2)人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測驗證
[0026] 利用病毒RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN)分別從四 種人冠狀病毒（HCoV-NL63、HC〇V-〇C43、HCoV-229E和HCoV-HKUl)陽性樣本中提取病 毒 RNA，然後以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 為引物對，通過 One-step RT-PCR Quick Master Mix (T0Y0B0公司）對四種人冠狀病毒分別進行檢測驗證；反應體系為25 μ L :2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5 μL，50mM Mn (OAC)21. 25 μL，10 μ M hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 14 1，病毒1?隱5以1^，去離子水7.25以匕反應程序為：90°0 3〇8,60°0 3〇1^11，94°0，11^11; 94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，35個循環；72°C 7min。反應產物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳後 在紫外燈下觀察結果。結果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev為通用引物進行One-st印RT-PCR反應後都能擴增出大小約600bp的單一目的條 帶。PCR產物經測序驗證後序列正確且不存在交叉反應。
[0027] 人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測驗證包括靈敏性驗證和特異性驗證其 中人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測靈敏性驗證如下：
[0028] 以人冠狀病毒HC〇V-NL63為例來說明該通用引物One-st印RT-PCR檢測的靈敏 性。利用 QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN)提取 HCoV-NL63 病毒 RNA 並用分光光度 計（敵腸01?0? 2000(：，11161'1]1〇)進行定量，並通過（拷貝/以1^=(6.0211023)1濃度（叩/) Χ10-9Λ目的片段鹼基數x340))公式計算出每微升的拷貝數。將病毒RNA進行10倍倍比 稀釋（從3. 2x108倍比稀釋到3. 2x100)，然後分別取5 μ L各個稀釋倍數的RNA為模板進 行RT-PCR，結果表明，每反應病毒RNA拷貝數從1. 6x109到1. 6x103是均能擴增出目的條 帶，而每反應病毒RNA拷貝數從1. 6x102到1. 6x100均不能擴增出目的條帶。上述結果表 明，該人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR最低檢測下限為1600拷貝/每反應，與常規 單一冠狀病毒檢測所用RT-PCR及real-time RT-PCR靈敏性相當。
[0029] 其中人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測特異性驗證如下：
[0030] 按照⑵中所述25 μ L反應體系配製反應液。其中，病毒RNA分別以HCOV-NL63、 HCoV-0C43、HCoV-229E、HCoV-HKUI 以及 Influenza virus A (Η3Ν2)、Influenza virus Β、 諾如病毒（Norovirus)、呼吸道合胞體病毒（RSV)、副流感病毒（PIV2&PIV3)、人鼻病毒 (Rhinovirus)為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為引物對進行PCR擴增。反應程序為： 90°C 30s，6(TC 30min，94°C，Imin ;94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin, 35 個循環；72°C 7min。反 應產物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳後在紫外燈下觀察結果。結果表明，分別以上述四種人冠狀 病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進行One-st印RT-PCR反應後都能 擴增出大小約600bp的單一目的條帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴增出條帶（如圖 3)，表明該人冠狀病毒通用檢測引物對特異性較好。
【權利要求】
1. 一種用於檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，其下遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -種用權利要求1所述通用引物序列檢測人冠狀病毒感染的檢測方法，其特徵在 於，包括： (1) 人冠狀病毒檢測通用引物設計 通過對GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對分析，在基因組 多聚酶基因編碼區設計了 一對簡併引物hC〇V-F〇r和hCoV-Rev用於對人冠狀病毒感染的 初步確診，引物對序列分別為上遊引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下遊引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴增目的片段大小為 605bp ; (2) 人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測驗證 利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分別從四種人冠狀病毒：HC〇V-NL63、HC〇V_OC43、 HCoV-229E和HCoV-HKUl的陽性樣本中提取病毒RNA，然後以hCoV-For和hCoV-Rev為引物 對，通過One-step RT-PCR Quick Master Mix對四種人冠狀病毒分別進行檢測驗證。
3. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟（2)中，對四種人冠狀 病毒分別進行檢測驗證的反應體系為25 yL:2x RT-PCR Quick Master Mix 12. 5 yL， 50mM Mn(OAC) 21. 25yL，10yM hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 lyL，病毒 RNA 5yL，去離子水 7. 25 y L ;反應程序為：90°C 30s，60°C 30min，94°C，lmin ;94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin, 35 個循環；72°C 7min;反應產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳後在紫外燈下觀察結果，結果表 明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進行 One-st印RT-PCR反應後都能擴增出大小600bp的單一目的條帶，PCR產物經測序驗證後序 列正確且不存在交叉反應。
4. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟⑵中人冠狀病毒通用引物 One-st印RT-PCR檢測驗證包括人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測靈敏性驗證和 人冠狀病毒通用引物〇ne-st印RT-PCR檢測特異性驗證。
5. 根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測靈敏性驗證，利用QIAamp Viral RNAMini kit提取人冠狀病毒RNA，並用分光 光度計進行定量，並通過公式計算出每微升的拷貝數，將病毒RNA進行稀釋，然後分別取 各個稀釋倍數的RNA為模板進行RT-PCR，結果表明，每反應病毒RNA拷貝數從1. 6x109到 1. 6x103是均能擴增出目的條帶，而每反應病毒RNA拷貝數從1. 6x102到1. 6x100均不能 擴增出目的條帶，上述結果表明，該人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR最低檢測下限為 1600拷貝/每反應，與常規單一冠狀病毒檢測所用RT-PCR及real-time RT-PCR靈敏性相 當。
6. 根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR 檢測特異性驗證，病毒 RNA 分別以 HC〇V-NL63、HC〇V-〇C43、HC〇V-229E、HC〇V-HKU1 以 及Influenza virusA、Influenza virus B、諾如病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、人 鼻病毒為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為引物對進行PCR擴增，結果表明，分別以上述四 種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進行One-st印RT-PCR反 應後都能擴增出大小為600bp的單一目的條帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴增出條 帶，表明該人冠狀病毒通用檢測引物對特異性較好。
【文檔編號】C12N15/11GK104498636SQ201510012641
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月9日 優先權日:2015年1月9日
【發明者】耿合員, 汪聖強, 謝曉謙, 肖雨, 張汀, 李宗 , 譚文杰, 蘇川 申請人:江蘇國際旅行衛生保健中心無錫分中心