經修飾的蛋白酶的製作方法
2023-11-06 23:43:57
經修飾的蛋白酶的製作方法
【專利摘要】本發明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。具體地，本發明涉及改變蛋白酶在微生物（例如芽孢桿菌種）中的表達的方法。本發明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。
【專利說明】經修飾的蛋白酶
[0001]本申請是申請日為2008年3月12日、發明名稱為「經修飾的蛋白酶」的中國專利申請200880007877.6 (國際申請號PCT/US2008/003291)的分案申請。
發明領域
[0002]本發明提供了編碼經修飾的蛋白酶的經修飾的多核苷酸以及改變微生物中蛋白酶生產的方法。具體地，本發明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌種)中的表達的方法。本發明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。
【背景技術】 [0003]微生物，例如是芽孢桿菌屬成員的革蘭氏陽性微生物，已被用於大規模的工業發酵，這部分是因為它們能將其發酵產物分進其培養基。分泌的蛋白穿過細胞膜和細胞壁被輸出，隨後再釋放進外部培養基。多肽分泌進周質空間或其培養基依賴於多個參數，在工業發酵中需要對它們詳加考慮。
[0004]事實上，異源多肽的分泌是工業界廣泛使用的技術。典型地，用編碼待表達且待分泌的目的異源多肽的核酸轉化細胞，以生產大量的想要的多肽。該技術已用於生產大量的多肽。已可通過對編碼想要的蛋白質的多核苷酸進行遺傳操作，來控制想要的多肽的表達和分泌。雖然蛋白質生產方法已有若干進展，但是本領域中仍需要提供細胞外蛋白質分泌的有效方法。
[0005]發明概述
[0006]本發明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。特別地，本發明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌種)中的生產的方法。本發明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。
[0007]本發明涉及經過遺傳操作以增強經修飾蛋白質生產的多核苷酸、多肽和細胞。特別地，本發明涉及具有引入其中的外源核酸序列的革蘭氏陽性微生物以及在此類宿主細胞(例如芽孢桿菌屬的成員)中生產蛋白質的方法。更具體地，本發明涉及蛋白酶的生產以及經過遺傳操作從而具有改變的生產表達的蛋白質的能力的細胞。特別地，本發明提供了微生物對蛋白酶的增強的生產。
[0008]在一些實施方式中，本發明提供了分離的經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域(pro region)的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID N0:5、13和244的胺基酸位置28-108和109。在一些實施方式中，經修飾的全長蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID NO: 5、13和244的胺基酸位置28-108和109。在其他實施方式中，全長蛋白酶是源於野生型或變體前體鹼性絲氨酸蛋白酶的鹼性絲氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ IDN0:5、13和244的胺基酸位置28-108和109。在其它一些實施方式中，全長蛋白酶是源於野生型或變體前體鹼性絲氨酸蛋白酶(其是克勞氏芽孢桿菌(B.Clausii)或緩慢葡萄球菌(S.1entus)鹼性絲氨酸蛋白酶)的鹼性絲氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID NO: 5、13和244的胺基酸位置28-108和109。在一些實施方式中，經分離的經修飾的多核苷酸包含SEQ ID NOS: 1、9或240所示的多核苷酸序列。
[0009]在一些實施方式中，本發明提供了經分離的經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID N0:5、13和244的胺基酸位置28-108和109，其中，所述至少一處取代是在選自SEQ ID NO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84 和 E88 的一處胺基酸位置進行的。在其它一些實施方式中，E33的胺基酸取代選自E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q和E33R。在其它一些實施方式中，E57的胺基酸取代選自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 E57N。
[0010]在一些實施方式中，本發明提供了經分離的經修飾的多核苷酸，其包含已被突變為編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同於SEQID NO: 5、13或244的胺基酸位置28-108和109。在另外一些實施方式中，經分離的經修飾的多核苷酸還包含編碼包含成熟區域的全長蛋白酶的多核苷酸，其中，編碼蛋白酶成熟區域的多核苷酸與SEQ ID N0S:8、16或247有至少大約70%同一性。
[0011]在一些實施方式中，本發明提供了包含經修飾的多核苷酸的至少一種載體，所述多核苷酸編碼經修飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID NO: 5、13和244的胺基酸位置28-108和109，或者，提供了包含經分離的經修飾的多核苷酸的至少一種載體，所述多核苷酸包含已被突變為編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同於SEQ ID NO:5、13或244的胺基酸位置28-108 和 109。
[0012]在其它一些實施方式中，本發明提供了經包含本發明的經修飾的多核苷酸的載體轉化的宿主相比。在一些優選的實施方式中，經轉化的宿主細胞是微生物。例如，在一些實施方式中，本發明提供了下述宿主細胞，所述宿主細胞經包含經修飾的下述多核苷酸的至少一種載體轉化，所述多核苷酸編碼經修飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID NO: 5、13和244的胺基酸位置28-108和109，或者，所述宿主細胞經分離的經修飾的下述多核苷酸轉化，所述多核苷酸包含已被突變為編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同於SEQ ID N0:5、13或244的胺基酸位置28-108和1·09。在一些實施方式中，經本發明的多核苷酸轉化的宿主細胞是選自芽抱桿菌屬(Bacillus sp).、鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)、埃希氏菌屬(Escherichiasp.)和麴黴屬(Aspergillus sp.)構成的組的微生物。在一些其它實施方式中，宿主細胞是枯草芽孢桿菌(B.subti I is)。[0013]在一些實施方式中，本發明提供了通過本發明的經轉化的宿主細胞生產的蛋白酶。[0014]本發明還提供了在微生物中生產異源蛋白酶的方法，其中所述方法包含下述步驟:(a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在一些實施方式中，通過芽孢桿菌宿主生產的蛋白酶被回收。本文提供的經修飾的多核苷酸中任何一種都可用於本發明的方法。
[0015]在一些實施方式中，本發明提供了在微生物中生產異源鹼性絲氨酸蛋白酶的方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。本發明還提供了在微生物中生產異源蛋白酶的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶，所述經修飾的蛋白酶包含與SEQ ID N0S:8、16或247有至少大約70%同一性的成熟區域；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在一些實施方式中，芽孢桿菌宿主生產的蛋白質被回收。
[0016]在一些實施方式中，本發明提供了在微生物中生產異源蛋白酶的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶，所述經修飾的蛋白酶包含下述前區域，所述前區域包含編碼選自下述位置的至少一處胺基酸位置上的取代的突變，所述位置等同於SEQ ID NO: 5、13或244的胺基酸位置28-108和109;以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在其它一些實施方式中，所述至少一處胺基酸取代選自E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q、E33R、E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 E57N。
[0017]本發明還提供了在微生物中生產是克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌(B.1entus)蛋白酶的異源蛋白酶的方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b )通過所述微生物來生產蛋白酶。
[0018]本發明還提供了在微生物中生產異源蛋白酶的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養選自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(B.Amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪桿菌(B.stearothermophilus)、克勞氏芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)、耐鹽芽抱桿菌(B.halodurans)、凝固芽抱桿菌(B.coagulans)、環狀芽孢桿菌(B.circulans)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)和蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在一些實施方式中，所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌宿主細胞。
[0019]本發明還提供了在微生物中生產異源蛋白的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶，並且，其中，所述異源蛋白酶展示出至少I的生產比例。
[0020]附圖簡述
[0021]圖1A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的野生型蛋白酶的全長多核苷酸序列(SEQ IDNO:1)。該序列中編碼蛋白酶的前區域的部分以粗體字母顯示。
[0022]圖1B、C和D顯示了多核苷酸序列(SEQ ID NO: 2、3和4)，它們分別編碼SEQ IDN0:5的全長克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQ ID N0:6)、前區域(SEQ ID N0:7)和成熟形式(SEQ ID N0:8)。
[0023]圖2A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的野生型蛋白酶的全長多肽序列(SEQ IDN0:5)。該序列中編碼蛋白酶的前區域的部分以粗體字母顯示。
[0024]圖2B、C和D顯示了分別編碼SEQ ID NO: 5的全長克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQ ID N0:6)、前區域(SEQ ID NO:7)和成熟形式(SEQ ID N0:8)的多肽序列。
[0025]圖3A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的變體蛋白酶V049的全長多核苷酸序列(SEQID N0:9)。該序列中編碼蛋白酶的前區域的部分以粗體字母顯示。
[0026]圖3B、C和D顯示了多核苷酸序列(SEQ ID NO: 10、11和12)，它們分別編碼SEQID NO: 13的全長變體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQ ID NO: 14)、前區域(SEQ IDNO: 15)和成熟形式(SEQ ID NO: 16)。
[0027]圖4A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的變體蛋白酶V049的全長多肽序列(SEQ IDNO: 13)。該序列中編碼蛋白酶的前區域的部分以粗體字母顯示。
[0028]圖4B、C和D顯示了分別編碼SEQ ID NO: 13的全長變體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQ ID NO: 14)、前區域(SEQ ID NO: 15)和成熟形式(SEQ ID NO: 16)的多肽序列。
[0029]圖5顯示了對SEQ ID NO: 5的克勞氏芽孢桿菌野生型絲氨酸蛋白酶、SEQ ID NO: 13的克勞氏芽孢桿菌變體絲氨酸蛋白酶和SEQ ID NO: 244的遲緩芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的胺基酸序列的比對。胺基酸的區別被下劃線示出。
[0030]圖6提供了包含SEQ ID NO:9的變體絲氨酸蛋白酶的pXX_049質粒載體的圖譜。
[0031]圖7A-D顯示了用於本發明的pXX-049質粒載體的多核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)。
[0032]圖8A顯示了來自遲緩芽孢桿菌的蛋白酶的全長多核苷酸序列(SEQ ID N0:240)。該序列中編碼蛋白酶的前區域的部分以粗體字母顯示。
[0033]圖8B、C和D顯示了多核苷酸序列(SEQ ID NO:241、242和243)，它們分別編碼SEQ ID N0:244的遲緩芽孢桿菌前體蛋白酶的信號肽(SEQ ID N0:245)、前區域(SEQ IDNO: 246)和成熟形式(SEQ ID NO: 247)。
[0034]圖9A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的變體蛋白酶GG36的全長多肽序列(SEQ IDN0:244)。該序列中編碼蛋白酶的前區域的部分以粗體字母顯示。
[0035]圖9B、C和D顯示了分別編碼SEQ ID NO: 244的全長遲緩芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQ ID N0:245)、前區域(SEQ ID NO:246)和成熟形式(SEQ ID NO:247)的多肽序列。
[0036]發明描述
[0037]本發明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。·特別地，本發明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌的種)中的表達的方法。本發明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。[0038]本發明提供了經修飾的多核苷酸，其編碼具有經突變的前區域的蛋白酶，本發明還提供了所述經修飾的多核苷酸編碼的經修飾的蛋白酶以及用於生產它們的方法。經修飾的蛋白酶多核苷酸適於在微生物中表達經修飾的蛋白酶以及以比相應前體蛋白酶更高的水平對成熟形式進行加工。產生的蛋白酶可用於對適用於多種工業(包括但不限於:清潔、動物飼料和紡織品加工工業)的酶的工業生產。本發明還提供了生產這些酶的手段。在一些優選的實施方式中，本發明的蛋白酶是純的或相對純的形式。
[0039]除非另有指明，本發明的實踐涉及分子生物學、微生物學、蛋白質純化、蛋白質工程、蛋白質和DNA測序以及重組DNA領域通常所用的常規技術，它們在本領域技術範圍內。此類技術是本領域技術人員已知的，它們被描述於大量的教材和參考文獻中(見，例如 Sambrook et al.，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual〃，Second Edition (ColdSpring Harbor), [1989]和 Ausubel et al.，"Current Protocols in MolecularBiology"[1987])。本文中(包括上文和下文中)提到的所有專利、專利申請、文章和出版物都通過引用明確併入本文。
[0040]除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常的理解相同的含義。例如，Singleton and Sainsbury, Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY(1994);和Haleand Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY(1991)為本領域技術人員提供了本發明所用的很多術語的一般性詞典解釋。雖然與本文的描述相似或等同的任何方法和材料都可用於本發明的實施，但本文描述了優選的方法和材料。因此，通過參考說明書整體能更完整地理解下文即將定義的術語。此外，在本文中使用時，除非上下文另有清楚指示，單數術語「一個/種」和「這個/種」(「a」、「an」和「the」)也包括複數指代。數值範圍包括界定該範圍的數字。除非另有指明，分別地，核酸是按照5』至3』的方向從左到右書寫的；胺基酸是按照氨基到羧基的方向從左到右書寫的。應當理解，本發明並不限於所述的特定的方法、方案和試劑，它們可根據本領域技術人員使用它們的背景而有所改變。
[0041]此外，本文提供的標題並非是對本發明的多個方面或實施方式的限制，它們可參照說明書整體而得到。因此，通過參考說明書整體能更完整地理解下文即將定義的術語。但是，為了協助理解本發明，下文定義了多個術語。
[0042]定義
[0043]「經修飾的蛋白酶」是具有下述胺基酸序列的全長蛋白酶，所述胺基酸序列源於全長「前體蛋白酶」的胺基酸序列。前體蛋白酶也可被稱為「未經修飾的蛋白酶」。經修飾的蛋白酶在前區域與其前體蛋白酶有所不同。前體蛋白酶可以是天然存在的，即野生型的蛋白酶，或者其可以是變體蛋白酶。野生型或變體蛋白酶的前區域經過修飾，以產生經修飾的蛋白酶。經修飾的蛋白酶的胺基酸序列被認為是通過對前體胺基酸序列的前區域中一個或多個胺基酸的取代、缺失或插入而「源於」所述前體蛋白酶胺基酸序列。在一些優選的實施方式中，前體蛋白酶的前區域的一個或多個胺基酸被取代，以產生經修飾的蛋白酶。此類修飾是對編碼前體蛋白酶胺基酸序列的「前體DNA序列」的修飾，而非對前體蛋白酶本身進行的操作。本文中，經修飾的蛋白酶包括在前體蛋白酶的前區域的任何一處胺基酸殘基處用19種天然存在的胺基酸中的任何一種進行的取代。在本文上下文中，「經修飾的」和「前體」蛋白酶都是包含信號肽、前區域和成熟區域的全長蛋白酶。編碼經修飾的序列的多核苷酸被稱為「經修飾的多核苷酸」，編碼前體蛋白酶的多核苷酸被稱為「前體多核苷酸」。「前體多肽」和「前體多核苷酸」可分別互換地稱作「未經修飾的前體多肽」或「未經修飾的前體多核
苷酸」。
[0044]「天然存在的」或「野生型」指具有與自然界中所發現的相同的未經修飾的胺基酸序列的蛋白酶或編碼所述蛋白酶的多核苷酸。天然存在的酶包括天然的酶，即在特定微生物中天然表達或發現的那些酶。野生型的或天然存在的序列指變體所源自的序列。野生型序列可編碼同源或異源蛋白質。
[0045]在本文中使用時，「變體」指通過在C-末端和N-末端中任一或兩者添加一個或多個胺基酸，在胺基酸中的一個或多個不同位點取代一個或多個胺基酸，在蛋白質的任一末端或兩個末端或胺基酸序列的一個或多個位點缺失一個或多個胺基酸，和/或在胺基酸序列的一個或多個位點插入一個或多個胺基酸，而與其相應野生型蛋白質有所不同的前體蛋白質。本發明上下文中，通過克勞氏芽孢桿菌蛋白酶V049 (SEQ ID NO: 13)來示例變體蛋白質，其是天然存在的蛋白質Maxacal (SEQ ID N0:5)的變體。變體的前體蛋白可以是野生型或變體蛋白。
[0046]在本文中使用時，「等同於」指蛋白質或肽的列舉的位置上的殘基或者與蛋白質或肽的列舉殘基類似、同源或相應的殘基。
[0047]在提到蛋白酶時，術語「生產」包括對全長蛋白酶的兩個加工步驟，包括:1.除去信號肽，這已知在蛋白質分泌期間發生，和2.除去前區域，這產生了酶的活性成熟形式，並且已知在成熟過程期間發生(Wang et al., Biochemistry37:3165-3171 (1998) ;Power etal.,Proc Natl Acad Sci USA83:3096-3100(1986))。
[0048]在提到成熟蛋白酶時，術語「經加工的」指全長蛋白質(例如蛋白酶)所經歷以成為活性成熟酶的成熟過程。
[0049]術語「活性比例」和「生產比例」可互換使用，用於表示從經修飾的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性與從未經修飾的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性之比。
[0050]術語「全長蛋白質」在本文中表示基因的一級基因產物，其包含信號肽、前序列和成熟序列。
[0051]術語「信號序列」或「信號肽」指可參與蛋白質的成熟或前體形式分泌的核苷酸和/或胺基酸的任何序列。信號序列的該定義是功能性定義，其意欲包括參與實現蛋白質分泌的蛋白質基因N-末端部分編碼的所有那些胺基酸序列。
[0052]術語「前序列」或「前區域」是信號序列和成熟序列之間的胺基酸序列，其對於蛋白酶的分泌/生產來說是必要的。將前序列切割掉將產生成熟活性蛋白酶。舉例而言，本發明的蛋白酶的前區域至少包括與SEQ ID N0:5、13或244的28-111位殘基相同的胺基酸序列。
[0053]術語「成熟形式」或「成熟區域」指蛋白質的最終功能性部分。舉例而言，本發明的蛋白酶的成熟形式至少包括與SEQ ID NO:5、13或244的112-380位殘基相同的胺基酸序列。在本文上下文中，「成熟形式」「加工自」全長蛋白酶，其中，對全長蛋白酶的加工包括除去信號妝和除去如區域。
·[0054]在本文中使用時，術語「異源蛋白」指不在宿主細胞中天然存在的蛋白質或多肽。相似地，「異源多核苷酸」指不在宿主細胞中天然存在的多核苷酸。
[0055]在本文中使用時，「同源蛋白」指在細胞中是天然的或天然存在的蛋白質或多肽。相似地，「同源多核苷酸」指在細胞中是天然的或天然存在的多核苷酸。
[0056]在本文中使用時，術語「啟動子」指指導下遊基因轉錄的核酸序列。在一些優選的實施方式中，啟動子適合於其中將要表達靶基因的宿主細胞。啟動子與其它轉錄和翻譯調控核酸序列(也稱為「控制序列」)一起，是表達給定基因所必需的。通常，轉錄和翻譯調控序列包括但不限於:啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或活化序列。
[0057]當核酸相對另一核酸序列以功能性關係放置時，其被稱為「有效連接的」。例如，如果啟動子或增強子能影響編碼序列的轉錄，它們就是與編碼序列有效連接的；或者，如果核糖體結合位點被放置為能協助翻譯，它就是與編碼序列有效連接的。通常，「有效連接的」指相連的DNA序列是毗鄰的。
[0058]在本文中使用時，術語「蛋白酶」和「蛋白水解活性」指展示出能水解肽或具有肽鍵的底物的能力的蛋白質或肽。已有很多公知方法用於測量蛋白質水解活性(Kalisz,"Microbial Proteinases, 〃In:Fiechter(ed.).Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, [1988])。例如,可通過比較檢驗(分析產生的蛋白酶水解商業底物的能力)來確定蛋白水解活性。可用於此類蛋白酶或蛋白水解活性分析中的示例性底物包括但不限於:二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛膠原蛋白(Sigma C-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。利用這些底物的比色檢驗是本領域公知的(見，例如，W099/34011和美國專利號6，376，450，它們都通過引用併入本文)。AAPF 檢驗(見，例如 Del Mar et al.，Anal.Biochem.，99:316_320[1979])也可用於測定成熟蛋白酶的生產。該檢驗測量該酶水解可溶的合成底物一琥珀醯丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(sAAPF-pNA)時釋放對硝基苯胺的速率。在分光光度計上於410nm測量從水解反應產生黃色的速率，其與活性酶濃度成比例。
[0059]在本文中使用時，「芽孢桿菌屬」包括本領域技術人員已知的「芽孢桿菌」屬中的所有種，其包括但不限於，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝固芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌(B.1autus)和蘇雲金芽孢桿菌。應當認識到，芽孢桿菌屬還將繼續經歷分類重構。因此，該屬包括已經被重新分類的物種，這包括但不限於嗜熱脂肪桿菌等生物，其現在被稱為「Geobacillusstearothermophilus」。存在氧時產生抗性內生孢子被認為是芽孢桿菌屬的界定特徵，雖然該特徵也適用於近來命名的脂環酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、AneurinibaciIIus> Anoxybacillus、Brevibacillus、Filobacillus、Gracilibacillus、Halobacillus、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、Salibacillus、熱桿菌屬(Thermobacillus)、Ureibacillus 和 Virgibacillus。
[0060]術語「多核苷酸」和「核酸」在本文中可互換使用，它們指任何長度的核苷酸聚合形式。這些術語包括但不限於，單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、cDNA或包含嘌呤和嘧啶鹼基或其它天然的、經化學修飾的、經生化修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、染色體片段、ESTs、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核糖體、cDNA、重組多核苷酸、帶分支的多核苷酸、質粒、載體、任何序列的經分離DNA、任何序列的經分離RNA、核酸探針和引物。
[0061]在本文中使用時，術語「DNA構建體」和「轉化DNA」可互換使用，以表示用於將序列引入宿主細胞或生物的DNA。DNA可通過PCR或本領域技術人員已知的任何其它合適技術體外產生。在一些特別優選的實施方式中,DNA構建體包含目的序列(例如,經修飾的序列)。在一些實施方式中，所述序列與另外的元件，例如，控制元件(例如啟動子等)有效連接。在一些實施方式中，DNA構建體包含與宿主細胞染色體同源的序列。在其它一些實施方式中，DNA構建體包含非同源序列。一旦DNA構建體被體外裝配，其即可用於突變宿主細胞染色體的區域(即，用異源序列代替內源序列)。
[0062]在本文中使用時，術語「載體」指設計來向一種或多種細胞類型中引入核酸的多核苷酸構建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體和質粒。在一些實施方式中，多核苷酸構建體包含編碼全長蛋白酶的DNA序列(例如，經修飾的蛋白酶或未經修飾的前體蛋白酶)。
[0063]在本文中使用時，術語「質粒」指用作為克隆載體的環狀雙鏈(ds ) DNA構建體，其在一些真核生物或原核生物中形成染色體外的自主複製遺傳元件，或整合進宿主染色體。
[0064]在本文中使用時，在向細胞中引入核酸序列的上下文中，術語「引入」表示適用於將核酸序列轉入細胞的任何方法。用於引入的此類方法包括但不限於原生質體融合、轉染、轉化、接合和轉導(見，例如，Ferrari et al.，"Genetics, "in Hardwood etal, (eds.), Bacillus.Plenum Publishing Corp., pages57-72, [1989])。
[0065]在本文中使用時，術語「經轉化的」和「穩定轉化的」指這樣的細胞，它們具有整合進其基因組中的或作為保持了至少兩代的游離型質體存在的非天然(異源)多核苷酸序列。
[0066]本發明提供了經分離的經修飾的編碼胺基酸序列的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶。通過對前體蛋白酶的多核苷酸序列加以突變，獲得經修飾的蛋白酶。具體地，對編碼前體蛋白酶的前區域的多核苷酸序列進行一處或多處突變，以提供本發明的經修飾的多核苷酸。
[0067]發明詳述
[0068]本發明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。特別地，本發明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌屬的種)中的表達的方法。本發明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。
[0069]在一些實施方式中，本發明提供了編碼經修飾的蛋白酶的經修飾的多核苷酸，所述經修飾的蛋白酶源於動物、植物或微生物來源的野生型或變體前體蛋白酶。編碼源於微生物的前體蛋白酶的多核苷酸是優選的，其包含編碼野生型前體蛋白酶和變體前體蛋白酶(源於野生型形式)的多核苷酸。在一些實施方式中，本發明的經修飾的多核苷酸源於編碼微生物來源的前體蛋白酶的多核苷酸。本發明還包括源於編碼蛋白工程化的前體的多核苷酸的、編碼經修飾蛋白酶的多核苷酸。編碼絲氨酸蛋白酶的多核苷酸是優選的前體蛋白酶多核苷酸，其中鹼性微生物蛋白酶多核苷酸是特別優選的。絲氨酸蛋白酶是催化其中在活性位點有關鍵絲氨酸殘基的肽鍵水解的酶。絲氨酸蛋白酶具有大約25，000至30，000範圍內的分子量(見Priest, Bacteriol.Rev.，41:711-753 [1977])。在一些優選的實施方式中，編碼枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)和枯草桿菌蛋白酶變體的多核苷酸是優選的前體絲氨酸蛋白酶多核苷酸。在一些實施方式中，本發明包括編碼經修飾的蛋白酶的下述多核苷酸，它們源於微生物，例如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌的多核苷酸。編碼枯草桿菌蛋白酶的多種芽孢桿菌多核苷酸已被鑑定和測序,例如,枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN』、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶309 (見，例如EP414279B ；W089/06279 和 Stahl et al., J.Bacteriol.，159:811-818[1984]，它們每篇都通過引用整體併入本文)。在本發明的一些實施方式中，突變體(例如變體)蛋白酶多核苷酸作為編碼本發明的經修飾的蛋白酶所源自的蛋白質的前體多核苷酸。多篇參考文獻提供了變體蛋白酶的例子(見，例如，W099/20770 ；W099/20726 ；W099/20769 ；W089/06279 ；RE34, 606 ;美國專利號4，914，031 ;美國專利號4，980，288 ;美國專利號5，208，158 ;美國專利號5，310，675 ;美國專利號5，336，611 ;美國專利號5，399，283 ;美國專利號5，441，882 ；美國專利號5，482，849 ;美國專利號5，631，217 ;美國專利號5，665，587 ;美國專利號5，700, 676 ;美國專利號5，741,694 ;美國專利號5，858，757 ;美國專利號5，880，080 ;美國專利號6，197，567和美國專利號6，218，165 ;它們每篇都通過引用整體併入本文)。在其它一些實施方式中，本發明所包括的多核苷酸包括:源於編碼可商業獲得的蛋白酶的多核苷酸的經修飾的多核苷酸。例如，可商業獲得的蛋白酶包括但不限於:ALCALASE?、SAVINASE?、PRIMASE?、DURALASE?、ESPERASE? 和 KANNASE? (Novo Nordisk AJS),MAXATASE?、MAXACAL?、MAXAPEM?、PROPERASE?、PURAFECT? 和 PURAFECT OXP? (GenencorInternational Inc.)。在一些實施方式中，本發明包括源於編碼來自克勞氏芽孢桿菌的前體蛋白酶的多核苷酸的經修飾的多核苷酸。在其它一些實施方式中，本發明包括源於編碼來自遲緩芽孢桿菌的前體蛋白酶的多核苷酸的經修飾的多核苷酸。
[0070]在一些實施方式中，本發明的經修飾的全長多核苷酸包含編碼已突變的前體蛋白酶前區域的序列。編碼任何合適的前體蛋白酶的前區域的多核苷酸序列可用於產生本發明的一種或多種經修飾的多核苷酸。在一些優選的實施方式中，前體多核苷酸序列的編碼前區域的部分被突變，以編碼位於下述位置的一處或多處胺基酸取代，所述位置等同於SEQID N0:5、13或244的1-109位。在一些實施方式中，經修飾的前體多核苷酸編碼前區域中位於下述位置的至少一處胺基酸取代，所述位置等同於SEQ ID N0:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和E88。在一些實施方式中，編碼等同於 E33 的位置處的胺基酸的多核苷酸序列被突變為編碼取代E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q或E33R中的至少一種。在一些其它實施方式中，編碼等同於E57的位置處的胺基酸的多核苷酸序列被突變為編碼取代E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 / 或 E57N 之一。
[0071]在一些實施方式中，前體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶多核苷酸(例如SEQ ID NO:1)編碼野生型蛋白酶(MAXACAL? ；SEQ ID NO:5)。
[0072](SEQ ID NO:1)
[0073]ATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGA·AGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGC
TGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACT
TAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTG
GCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAA
AGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGC
ACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGA
GGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAAT
GGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCAC
CAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCAT
GTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAA
TACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA
[0074](SEQ ID NO:5)
[0075]MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0076]在其它一些實施方式中，前體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶多核苷酸(例如SEQ ID NO:9)編碼變體蛋白酶(例如，SEQ ID NO:13)
[0077](SEQ ID NO: 13)
[0078]VRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0079]在其它實施方式中，前體蛋白酶多核苷酸是遲緩芽孢桿菌的多核苷酸(例如SEQID NO:240)，其編碼 SEQ ID NO:244 的蛋白酶 GG36。
[0080] (SEQ ID NO:240)
[0081]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGCTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAAT
GGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCAC CAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCAT
GTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAA
TACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGT
[0082](SEQ ID NO:244)
[0083]MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0084]在一些實施方式中，本發明提供了源於SEQ ID NO:9的全長前體多核苷酸的經修飾的全長多核苷酸。
[0085](SEQ ID NO:9)
[0086]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAA
[0087]SEQ ID NO:9的多核苷酸序列包含序列(SEQ ID NO:10)，當其表達時，被用來編碼信號序列肽(SEQ ID NO: 14)，其跨越SEQ ID NO:13的1_27位胺基酸；N_末端前序列(SEQID NO: 11)，其編碼前區域序列(SEQ ID NO: 15)，其跨越SEQ ID NO: 13的28-111位胺基酸殘基；以及成熟的絲氨酸蛋白酶序列(SEQ ID N0:12)，其編碼SEQ ID NO: 13的112-380位胺基酸殘基(即，SEQ ID N0:16)。編碼SEQ ID NO:13的蛋白酶的信號肽的前8個胺基酸的多核苷酸序列是編碼枯草芽孢桿菌AprE蛋白酶的前8個胺基酸的序列。
[0088](SEQIDN0:10)
[0089]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT[0090](SEQ ID NO:15)
[0091]AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM
[0092](SEQ ID NO:14)
[0093]VRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA
[0094](SEQ ID NO:11)
[0095]GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG
[0096](SEQ ID NO:12)
[0097]GCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAA
[0098](SEQ ID NO:16)
[0099]AQSVPffGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASPVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSS1AQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQ1RNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0100]在其它一些實施方式中，本發明提供了源於SEQ ID NO:1的野生型全長前體多核苷酸的經修飾的全長多核苷酸。SEQ ID NO:1的多核苷酸包含:序列SEQ ID NO:2，當表達時，其用於編碼信號序列肽(SEQ ID NO:6)，其編碼SEQ ID NO:5的1_27位胺基酸；N-末端前序列(SEQ ID NO:3)，其編碼SEQ ID NO:5的28-111位胺基酸殘基(即，SEQ ID NO:7)和野生型成熟絲氨酸蛋白酶序列(SEQ ID NO:4)，其編碼SEQ ID NO: 5的112-380位胺基酸殘基(即，SEQ ID NO:8)。
[0101](SEQ ID NO:2)
[0102]ATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT
[0103](SEQ ID NO:6)
[0104]MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA·[0105](SEQ ID NO:3)[0106]GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG
[0107](SEQ ID NO:7)
[0108]AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM
[0109](SEQ ID NO:4)
[0110]GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA
[0111](SEQ ID NO:8)
[0112]RVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0113]在其它一些實施方式中，本發明提供了源於SEQ ID NO:240的變體全長前體多核苷酸的經修飾的全長多核苷酸。SEQ ID NO:240的多核苷酸包含:SEQ ID NO:241的序列，當表達時，其用於編碼信號序列肽(SEQ ID NO:245)，編碼SEQ ID NO:244的1_27位胺基酸；N-末端前序列(SEQ ID NO:242)，其編碼SEQ ID NO:244的28-111位胺基酸殘基(SP，SEQ ID NO:246);和野生型成熟絲氨酸蛋白酶序列(SEQ ID NO:243)，其編碼SEQ ID NO:244的112-380位胺基酸殘基(即，SEQ ID NO:247)。編碼SEQ ID NO:244的前體蛋白酶的信號肽的前8個胺基酸的多核苷酸序列是編碼枯草芽孢桿菌AprE蛋白酶的前8個胺基酸的序列。前體GG36的前蛋白和成熟部分由GG36野生型序列編碼。
[0114](SEQ ID NO:241) [0115]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT
[0116](SEQ ID NO:245)MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA
[0117](SEQ ID NO:242)
[0118]GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGA
【權利要求】
1.分離的經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的全長蛋白酶，其中所述經修飾的全長蛋白酶選自 SEQ ID NO: 13 並且包含選自 E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H、E57N和E57G之一的突變，其中所述突變導致所述經修飾的全長蛋白酶與前體蛋白酶相比具有增強的生產活性。
2.權利要求1的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述經修飾的全長蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。
3.權利要求1的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述經修飾的全長蛋白酶是源於野生型或變體前體鹼性絲氨酸蛋白酶的鹼性絲氨酸蛋白酶。
4.權利要求1的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述前體鹼性絲氨酸蛋白酶是克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌鹼性絲氨酸蛋白酶。
5.包含權利要求1一 4任一項的經修飾的多核苷酸的載體。
6.用權利要求5的載體轉化的宿主細胞。
7.權利要求6的宿主細胞，其中所述宿主細胞是微生物。
8.權利要求6的宿主細胞，其中所述宿主細胞是選自芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬、埃希氏菌屬和麴黴屬的微生物。
9.權利要求6-8任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。
10.權利要求6-8任一項的宿主細胞產生的蛋白酶。
11.在微生物中產生異源蛋白酶的方法，所述方法包括步驟:` (a)在合適的條件下培養芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含編碼經修飾蛋白酶的經修飾的多核苷酸；以及 (b)允許所述微生物產生所述蛋白酶， 其中所述經修飾的全長蛋白酶選自SEQ ID NO: 13並且包含選自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H、E57N 和 E57G 之一的突變。
12.權利要求11的方法，其中回收所述芽孢桿菌宿主產生的所述異源蛋白酶。
13.權利要求11的方法，其中所述蛋白酶是鹼性絲氨酸蛋白酶。
14.權利要求11-13任一項的方法，其中所述宿主細胞選自地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌。
15.權利要求11-13任一項的方法，其中所述異源蛋白酶是克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌蛋白酶。
16.權利要求11-13任一項的方法，其中所述異源蛋白酶顯示出至少為I的生產比例，其中生產比例表示從經修飾的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性與從未經修飾的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性之比。
【文檔編號】C12N15/75GK103667323SQ201310559596
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2008年3月12日 優先權日:2007年3月12日
【發明者】D·A·埃斯特爾, E·費拉裡 申請人:丹尼斯科美國公司