潛伏性抗凝血酶iii的製備方法
2023-11-05 15:55:37 2
專利名稱：潛伏性抗凝血酶iii的製備方法
技術領域：
本發明涉及潛伏性抗凝血酶III的製備方法。
背景技術：
抗凝血酶III(AT)是一種具有58.1kDa總分子量的血漿糖蛋白(Lebing等，Vox Sang.67，117-124，1994)，其在凝固級聯中抑制絲氨酸蛋白酶，這樣在血液凝固的調節中起著主要作用。抗凝血酶III是因子IXa，Xa，XI和XIIa以及凝血酶的抑制劑。因此，AT調節凝固級聯不同階段中的凝結形成。血液中AT含量的小的降低與增加的血栓栓塞風險相關。在對後天或先天抗凝血酶缺陷的患者的預防和治療中使用AT濃縮物。另外，曾有報導說AT在人體很多其他過程，例如在血管生成中和在炎症反應中發揮功能。AT在這些生理過程中的功能還沒有完全被認清。
Wardell等(生物化學(Biochemistry)36，13133-13142，1997)第一次表徵的一種特殊的抗凝血酶III形式已知為潛伏型(L-AT)。已經證明L-AT和選擇性彈性蛋白酶裂解的變體具有強抗凝血酶活性，並且還抑制皮下注射有人成神經細胞瘤細胞系的小鼠體內的腫瘤生長(O′Reilly等，科學(Science)285，1926-1928，1999，和WO00/20026)。因此，肯定地認為L-AT是潛在的人抗癌藥物。但是，還要對這種潛在藥物進行臨床評估。
根據本發明公知的，使用純化的肝素作為固相結合的配體進行用親和色譜對AT的純化。Miller-Andersson等(血栓形成研究(Thrombosis Research)5，439-452，1974)公開了使用肝素瓊脂糖來純化人AT。這種色譜系統也曾用於分離AT和L-AT，其中相對於AT來說肝素對L-AT的降低的親合力使得有可能分離這兩種成分，如Chang和Harper所述(血栓形成和淤血(Thrombosis andHaemostasis)77，323-328，1997)。疏水作用色譜曾被用來分離天然型和潛伏型AT(Karlsson，G Winge，S.(2001)蛋白質表達純化(Protein Expr.Purif.)21149-155)。
先前根據Wardell等(上文)所述曾進行過潛伏型AT的誘導，他通過在0.25M檸檬酸鹽，10mM Tris/HCl，pH 7.4中在60℃下將AT溫育15小時而獲得50-60％ L-AT。
在培養基中或者只有緩衝液下在60℃下溫育天然抗凝血酶III時，經常形成聚合的蛋白質聚集體。這些聚集體的存在對於潛伏性抗凝血酶III的高產率是不利的，應該儘可能避免。
因此本發明的一個目的是提供一種從天然抗凝血酶III，AT的溶液製備潛伏性抗凝血酶III，L-AT的方法，該方法提供比現有技術方法高的期望產物產率。
本發明的另一個目的是提供一種從AT製備L-AT的方法，其中將AT聚合物聚集體的產生保持最小。
本發明的另一個目的是提供一種將AT轉化為L-AT的方法，其中使用通常可獲得的試劑和緩衝液，並且體外進行。
本發明的另一個目的是提供一種從AT製備L-AT的方法，其容易規模化工業生產L-AT。
發明概述權利要求書中定義的方法滿足了本發明的上述和其他目的。因此，提供了一種方法，包括在硫酸根離子和選自Good′s兩性離子緩衝劑的緩衝劑的存在下溫育天然抗凝血酶III的溶液。令人驚奇地發現這些溫育條件使得可能以大大高於現有技術方法(特別是Wardell等的檸檬酸鹽條件)獲得的產率從該方法回收L-AT，同時避免可能的聚集問題。
圖1使用0-2M(5-60分鐘)氯化鈉梯度的抗凝血酶的肝素親和色譜。對於樣品A-B，蛋白質的注入量是100微克，對於樣品C-D注入量是150微克。所有的樣品在60℃下溫育16小時，除了對參考AT樣品A，其沒有被熱處理(實施例中的樣品7)。根據Wardell所述溫育樣品B(實施例中的樣品6)，即在0.5M檸檬酸鹽中溫育。分別使用0.9和0.8M硫酸銨在5mM HEPES，pH 7.4中溫育樣品C(實施例中的樣品2)和D(實施例中的樣品1)。整合22分鐘洗脫的低親和性肝素結合峰，對於樣品B，C，和D分別給出44％，71％和89％的總的整合面積。天然AT在39分鐘時洗脫出。
圖2在均勻凝膠中使用12.5％聚丙烯醯胺進行的抗凝血酶樣品的非變性電泳。樣品的量是0.5微克蛋白質/泳道，電泳之後將凝膠銀-染色。除泳道7之外的所有的樣品在60℃下溫育16小時。
泳道1)5mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.4泳道2)5mM HEPES，0.9M硫酸銨，pH 7.4泳道3)5mM HEPES，1.1M硫酸銨，pH 7.4泳道4)5mM HEPES，1.4M硫酸銨，pH 7.4泳道5)5mM HEPES，2.0M硫酸銨，pH 7.4泳道6)10mmol Tris/HCl，0.5M檸檬酸三鈉，pH 7.4(根據Wardell等，1997)泳道7)參考AT樣品，沒有熱處理泳道8)25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH 7.4泳道9)25mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.4泳道10)5mM HEPES，0.5M硫酸銨，pH 7.4泳道11)5mM HEPES，2.0M硫酸銨，pH 7.4泳道12)5mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.0所有的泳道號對應於下面的實施例中列出的樣品號。
本發明的詳細描述本發明提供了從天然形式的抗凝血酶III(稱之為AT)的溶液起始製備潛伏性抗凝血酶III(稱之為L-AT)的方法。如所描述過的，通過肝素-瓊脂糖色譜能夠從血漿中分離AT。根據本發明，然後在硫酸根離子和緩衝液的存在下溫育AT。本領域技術人員容易確定溫育溫度和時間，但是發現普通巴氏滅菌法條件，例如大約60℃的溫度下溫育16小時的操作很好。
優選以硫酸鹽形式提供硫酸根離子。這裡，優選使用鹼金屬硫酸鹽，鹼土金屬硫酸鹽或硫酸銨。特別優選的是使用硫酸銨。根據本發明的方法中硫酸根離子濃度範圍是0.5至2.0M，優選0.7至1M，0.8和0.9M之間的濃度是最優選的。
溫育混合物中另一種成分是選自Good′s兩性緩衝劑的緩衝劑(Good等，Biochemistry 5，467-477，1966)。本發明方法中使用的指明的緩衝劑不用過度的實驗就能夠確定，記住所述緩衝劑應該滿足下面要求的大部分或全部應該具有大約6和大約9之間的pKa值，在水中的最大溶解度和在其他溶劑中的最小溶解度，產生最小的鹽作用，在使用的實驗條件下穩定，在可見或紫外光譜區不吸收光(這樣不幹擾分光光度測定)。Good′s兩性緩衝劑例如HEPES，MES和IPES，一般代表期望的特徵。在本發明方法中使用HEPES是特別優選的。廣泛使用的Tris緩衝劑對於本發明目的不適合。優選的緩衝劑濃度多少取決於選擇的緩衝劑，但是一般處於1至25mM的範圍內，更優選2.5至10mM，最優選4至6mM。
如上文所指出的，溫育反應的pH應該處於pH 6和pH 9之間，優選在pH 7和pH 8之間，最優選pH 7.4和pH 7.6之間。
在上文指出的條件下溫育AT之後，從剩餘的AT分離這樣的獲得的L-AT優選使用肝素親和色譜進行。與AT相比，L-AT表現出對肝素的更低的結合親合力，洗脫快得多並且使得容易分離抗凝血酶III的兩種形式。
有利地用這樣獲得的L-AT製劑處理，以將病原體特別是病毒和朊病毒形式的病原體滅活或去除。這可以在應用本領域公知的滅活或去除的幾種方法中的任一種或這樣的方法的組合的過程中的任一階段中進行。這樣的方法的例子包括化學滅活，熱滅活，光滅活，微波滅活和納米過濾去除。使用高鹽含量的終端過濾方法，象描述於WO96/00237中的方法，單獨的或者與其它方法聯合，是特別優選的。在轉化為L-AT之前抗凝血酶III分子是天然狀態時也可以進行病原體的去除和滅活。
通過下面的非限制性實施例進一步詳細描述本發明。
實施例從Plasma Products，Pharmacia，Stockholm，Sweden獲得純度＞95％的AT實驗樣品。根據已知方法(Miller Andersson等，上文)製備該樣品並且用於潛伏性抗凝血酶的誘導。
L-AT的製備將AT實驗樣品轉移給下面的溶液樣品1)5mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.4樣品2)5mM HEPES，0.9M硫酸銨，pH 7.4樣品3)5mM HEPES，1.1M硫酸銨，pH 7.4樣品4)5mM HEPES，1.4M硫酸銨，pH 7.4樣品5)5mM HEPES，2.0M硫酸銨，pH 7.4
樣品6)10mmol Tris/HCl，0.5M檸檬酸三鈉，pH 7.4(根據Wardell等，1997)樣品7-8)25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH 7.4樣品9)25mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.4樣品10)5mM HEPES，0.5M硫酸銨，pH 7.4樣品11)5mM HEPES，2.0M硫酸銨，pH 7.4樣品12)5mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.0樣品13)5mM HEPES，0.8M硫酸銨，pH 7.8在室溫下將上述所有的緩衝液調節至期望的pH；使用1M HCl調節樣品6，同時使用1M氫氧化鈉調節所有其它樣品的pH。
將終濃度是6mg/ml的AT在玻璃試管的溶液(樣品1-13)中在60℃下溫育16小時(除了對於樣品7，將其保持在大約8℃的電冰箱中)並且使用小凝膠過濾柱(NAP-5 Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)轉移給含有50mM Tris/HCl，50mM氯化鈉，pH 7.4的溶液。
通過肝素親和色譜分析樣品中L-AT的生成，通過非變性電泳分析聚集體的存在。
肝素親和色譜根據Chang和Harper的文獻(上文)實施該方法。使用裝有TSKHeparin柱子(Tosohaas，Stuttgart，德國，7.5i.d.x 75mm，10微米，1000埃)的HPLC。洗脫緩衝液是20mM Tris/HCl緩衝劑，pH7.4(緩衝劑A)和20mM Tris/HCl緩衝劑，pH 7.4中的2M氯化鈉(緩衝劑B)。以線性梯度洗脫(0％ B 0-5分鐘，0-100％ B 5-60分鐘，0％B 60-90分鐘)。流速是0.4毫升/分鐘，通過測定280nm處的吸光度進行檢測。
非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳使用12.5％聚丙烯醯胺同質Phasts凝膠(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)利用建議的電泳參數進行電泳。每一條泳道加載1微升中0.5微克蛋白質。根據Pharmacia Upjohn小冊子(Phast SystemTM，Technical Note No 2，使用PhastGelTM分離介質的二維電泳，Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，瑞典)進行二氨基銀染色，除了使用含有50％乙醇，10％乙酸和40％水稍微強一些的固定液。
抗凝血酶活性根據Handeland等(Scand J.Haematol. 31，427-436，1983)，使用凝血酶顯色肽底物(S-2238)(Chromogenix，Molndal，瑞典)對樣品2(在0.9M硫酸銨中溫育)分析AT生物學活性。測試溶液由凝血酶，肝素，顯色底物和樣品組成，並且以405nm處吸光度的變化記錄溫育之後的反應。
結論肝素親和色譜在39分鐘時洗脫出天然AT(大約0.9M氯化鈉)，並且在22分鐘洗脫出主要潛伏峰(大約0.3M氯化鈉)(附圖1A-1B)。低肝素-結合峰的整合表明，根據Wardell的方法製備的樣品(樣品6)的產率是44％(圖1B)，而在0.9和0.8M硫酸銨中溫育(分別是樣品2和1)分別得到71％和89％的總的整合面積(附圖1C-1D)。表1表明，在提高的硫酸銨/HEPES的濃度下或者在較高pH值下，生成的L-AT的百分比降低。
在60℃下在磷酸鹽/NaCl中溫育的AT(樣品8)的非變性電泳強有力生成聚集體，只有少部分蛋白質以單體形式保留(附圖2，泳道8)。根據Wardell方法溫育的AT(附圖2，泳道6)，以及沒有溫育的AT(附圖2，泳道7)，沒有產生聚集體。在0.5M硫酸銨中溫育(樣品10)誘導強的聚集作用(附圖2，泳道10)，而0.8M(樣品1)只給出一小部分聚集體(附圖2，泳道1)。0.9-2.0M濃度的硫酸銨(樣品2-5)沒有產生可見的聚集體(附圖2，泳道2-5)。pH 7.0下，觀察到很多聚集體(附圖2，泳道12)，而pH 7.8給出較少量的聚集體(數據沒有給出)。
對樣品2(使用0.9M硫酸銨)的抗凝血酶活性測定表明保留了原特異活性的34％；相比之下，通過親和色譜對相同樣品的分析表明高親合力肝素-結合AT產率是29％(表1)。
表1肝素親和色譜。60℃下溫育16小時之後各種樣品緩衝劑中L-AT的形成。
1根據該實施例*當通過非變性電泳分析時沒有可見的聚集體(參見附圖2)實驗結論通過在60℃下將AT在含有0.8或0.9M硫酸銨的5mM HEPES，pH7.4中溫育16小時，分別將大約85-90％和70-75％的AT轉化為潛伏型。非變性電泳表明0.8M硫酸銨情況下有少部分聚集體，0.9M情況下沒有可見的聚集體。在純化過程中，通過凝膠過濾或相似技術能容易去除這樣少量的聚集體。
使用硫酸銨將AT轉化為L-AT的最佳濃度是0.8-0.9M。在0.7和1M之間該轉化作用也會得到好的結果，在0.5和2.0M之間也會得到一些結果。對於形成L-AT，發現利用0.5-2.0M硫酸銨，優選0.8-0.9M，並且最多25mM HEPES，優選不大於10mM，在pH接近7.4下給出最令人滿意的結果。較高濃度的硫酸銨/HEPES或者較高pH值會降低形成的L-AT的百分比，另外，對於防止聚集體的形成，不需要使用太低的硫酸銨濃度或者太低的pH值。
權利要求
1.一種製備潛伏性抗凝血酶III的方法，包括在硫酸根離子和選自Good′s兩性離子緩衝劑的緩衝劑的存在下溫育天然抗凝血酶III的溶液。
2.根據權利要求1的方法，其中以選自硫酸銨，鹼金屬硫酸鹽和鹼土金屬硫酸鹽的鹽提供所述硫酸根離子。
3.根據權利要求2的方法，其中所述硫酸鹽是硫酸銨。
4.根據權利要求1-3任一項的方法，其中所述硫酸根離子濃度在0.5至2.0M的範圍內。
5.根據權利要求4的方法，其中所述硫酸根離子濃度在0.7至1M的範圍內。
6.根據權利要求5的方法，其中所述硫酸根離子濃度在0.8至0.9M的範圍內。
7.根據權利要求1-6任一項的方法，其中所述緩衝劑包括HEPES緩衝劑。
8.根據權利要求1-7任一項的方法，其中所述緩衝劑濃度在1至25mM的範圍內。
9.根據權利要求8的方法，其中所述緩衝劑濃度在2.5至10mM的範圍內。
10.根據權利要求9的方法，其中所述緩衝劑濃度在4至6mM的範圍內。
11.根據權利要求1-10任一項的方法，其中pH值在6-9的範圍內。
12.根據權利要求11的方法，其中pH值在7-8的範圍內。
13.根據權利要求12的方法，其中pH值在7.4-7.6的範圍內。
14.根據權利要求1-13任一項的方法，進一步包括將病原體特別是病毒和朊病毒滅活或去除的處理。
15.根據權利要求1的方法，其中處理天然抗凝血酶III以將病原體特別是病毒和朊病毒滅活或去除。
16.根據權利要求14或15的方法，其中所述處理包括選自化學滅活，熱滅活，光滅活，微波滅活和納米過濾去除方法之一或者它們的組合。
全文摘要
本發明提供了一種潛伏性抗凝血酶III的製備方法。該方法包括在硫酸根離子和選自Good’s兩性離子緩衝劑的緩衝劑的存在下溫育天然抗凝血酶III的溶液。
文檔編號A61K38/55GK1922206SQ01818577
公開日2007年2月28日 申請日期2001年11月8日 優先權日2000年11月8日
發明者G·卡爾松 申請人:奧克塔法馬有限公司