基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法

2023-11-05 22:53:12

專利名稱：基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法
技術領域：
本發明涉及基因融合和蛋白晶片技術領域，更具體地涉及一種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法，採用基因融合技術構建單鏈抗體融合蛋白用於夾心抗體晶片；建立兩種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統。該系統的模式不僅可用於朊病毒的檢測，還適用於其他疾病的病原檢測，該模式在病原檢測領域具有很好的應用價值。
背景技術：
將抗體分子片段與其它蛋白融合，可以得到具有抗體活性和其它生物活性或功能的抗體融合蛋白，抗體融合蛋白能改善免疫分析、免疫治療和抗體純化。抗體融合蛋白的構建形式主要有兩種，即根據其抗體的可變片段和恆定片段的兩大功能進行分別利用，使抗體融合蛋白具有抗體的某項特性，形成兩大類抗體融合蛋白。一類是將功能蛋白和抗體的可變片段融合，另一類是將功能蛋白和抗體的恆定片段融合。以前的抗體融合蛋白的構建是採用化學交聯的方法，但這樣的抗體交聯蛋白組成不均一，性能不穩定，分子大，穿透能力低，免疫源性大。隨著基因工程和基因工程抗體技術的迅速發展，特別是90年代以來噬菌體抗體技術的發展，不僅使抗體片段的篩選和製備越來越方便，而且由於基因工程抗體片段的分子小、功能強、穩定性高、易於基因融合的特點，抗體融合蛋白的構建也越來越方便。採用基因融合的方法包括以一段多肽鏈連接抗體分子和功能蛋白而構建的抗體融合蛋白結構穩定性高，性能也更為可靠。目前應用於抗體融合蛋白較多的抗體分子是Fab和scFv。它們與具各種特徵的短肽標記融合，如與E-tag，C-myc，His-tag等融合，可用於對抗體的快速純化和抗原的分析檢測；與其他特徵標記的蛋白融合，其主要用於對目標抗原的分析檢測和抗體抗原結合後性質的研究，如Fab、scFv與鹼性磷酸酶、鏈黴抗生物素蛋白、金黃色葡萄球菌蛋白A(spA)等融合構建的抗體融合蛋白可改善免疫分析，簡化分析過程。
目前，對於疾病標誌物的檢測和蛋白組分析中的蛋白晶片主要分為正向晶片(forward phase array)(或抗體晶片，antibody array)、反向蛋白晶片(reverse-phase protein array，RPA)和夾心蛋白晶片，正向晶片是在晶片上固定抗體，再加入通過標記的待檢的樣品混合物，進行信號檢測，主要用於蛋白譜的研究；反相蛋白晶片是待檢的樣品混合物直接固定在晶片的特定固相支持物上，然後加標記的蛋白或抗體進行檢測，主要用於蛋白的功能分析。夾心蛋白晶片是首先將捕獲抗體固定在晶片基片上，捕獲要檢測的分析物，然後加帶有標記的檢測抗體，捕獲抗體和檢測抗體要求針對目標分析物不同的抗原表位，主要用於目標分析物的特異性檢測。目前的雙抗體夾心蛋白晶片用於分析物的檢測主要採用兩個單克隆抗體。雖然單克隆抗體具有較高的親和力，但單克隆抗體的篩選和製備比較煩瑣和昂貴以及朊病毒檢測靈敏度仍然滿足不了實際檢測要求。

發明內容
本發明的目的在於提供一種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法，通過DNA重組構建了帶有鏈黴親和素親和肽(SBP)的單鏈抗體融合蛋白用於蛋白的定向固定，構建的單鏈抗體融合蛋白scFv-Fc，親和力有了明顯提高。基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片是完全通過DNA重組構建單鏈抗體融合蛋白組成的檢測系統，單鏈抗體融合蛋白分子和夾心抗體檢測系統，不僅為解決狂牛症快速、靈敏的檢測提供了技術途徑，而且還為其他疾病的病原檢測提供新的模式。
為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施A、構建了三個單鏈抗體融合蛋白Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z163-Fc(Z1030-Fc在夾心ELISA過程中被淘汰)。
單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表達載體的構建利用上遊引物SBP15』ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3』和下遊引物SBP25』TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3』擴增N端帶Linker(SSSGGSGSG)的SBP片段(L-SBP)(KEEFEAD.et al.2001，Protein Expression and Purification，23(3)440-446)，雙鏈兩端分別為NotI和BamHI限制性酶切位點。然後雙鏈序列與經NotI和BamHI雙酶切的線性化質粒pOPE101-215(Yol)片段混合(Wang T.et al.2003，ZhonghuaShi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi.17(2)116-20)，經T4DNA連接酶於16℃下連接過夜，連接產物為載體pOPE-L-SBP。將篩選到的陽性克隆用NcoI和NotI雙酶切進行線性化，與經同樣雙酶切的pCANTAB5E-Z163(pCANTAB 5EPharmacia公司產品)和pCANTAB5E-Z186膠回收的產物Z163和Z186，以1∶3的摩爾用T4DNA連接酶於16℃下連接過夜，連接產物為pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP。
單鏈抗體融合蛋白Z163-Fc表達載體的構建用BamHI和NotI從載體pPICZaFc(Eeckhout D.et al.2004.J ImmunolMethods 294181-187)上切下Fc基因片斷，然後和同樣雙酶切的載體pOPE以3∶1的摩爾比連接，用T4DNA連接酶於16℃條件下連接過夜，連接產物為編碼有Fc的pOPE-Fc。
用NcoI和NotI雙酶切pCANTAB5E-Z163，與同樣雙酶切的載體pOPE-Fc以3∶1的摩爾比連接，用T4DNA連接酶於16℃條件下連接過夜，連接產物為編碼有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc。
用夾心ELISA(酶聯免疫吸附實驗)對單鏈抗體融合蛋白及抗牛朊蛋白單克隆抗體KG9進行配對實驗，Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP配對顯示明顯的陽性結果。
B、通過夾心ELISA，篩選到配對抗體Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP，在此基礎上發展了兩種高特異性和靈敏度的夾心抗體晶片基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片和基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片，對重組牛朊蛋白檢測限可達1pg/mL，並可以檢測鼠腦中天然朊蛋白。兩種夾心抗體晶片可以發展成為新的高靈敏度和高特異性的朊病毒檢測系統。
本發明的目的是構建基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片，發展新的高靈敏度和高特異性的朊病毒檢測系統，並為其它疾病的病原檢測提供新的模式。
本發明與現有技術相比，有以下優點和效果SBP融合於scFv的C端，既能用於純化，又能與Streptavidin修飾的螢光納米顆粒或量子點特異結合，作為檢測抗體用於目標蛋白檢測。scFv-L-SBP融合蛋白在本研究中的另一個突出的特點是可以與鏈黴親和素包被的晶片進行結合，實現scFv-L-SBP融合蛋白的定向固定，作為捕獲性抗體，用於目標蛋白的捕獲和檢測。融合蛋白Z163-Fc既保持了scFv的專一性，又保持了完整抗體的親和力。在實際應用中，通過proteinA、protein G進行純化和定向固定，又可以作為檢測性抗體。
目前，使用的抗體都為單克隆抗體，單克隆抗體有很高的專一性，但常常出現交差反應，而專一性很強的重組抗體，特別是單鏈抗體表現出明顯的優點。本研究採用單克隆抗體和單鏈抗體融合蛋白配對構建了夾心抗體晶片，它結合了單克隆抗體的高親合力和單鏈抗體的專一性。
本發明的另一種夾心抗體晶片是基於單鏈抗體融合蛋白(scFv-L-SBP)定向固定和scFv-Fc的雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片，具有很強的專一性和靈敏度，該蛋白晶片檢測限可達1pg/mL，比目前靈敏度高的時間分辨加強螢光的定量夾心ELISA方法(50pg/mL)更靈敏。


圖1為一種單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表達載體的構建示意2.為一種單鏈抗體融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc表達載體的構建示意3.夾心ELISA篩選單克隆抗體與單鏈抗體融合蛋白配對1.KG9/Z163-L-SBP配對，rb-PrPc(灰色矩形)；2.TrxA(陰性對照，白色矩形)；3.KG9/Z1030-Fc配對，rb-PrPc(灰色矩形)；4.TrxA(陰性對照，白色矩形)；5.KG9/Z186-L-SBP配對，rb-PrPc(灰色矩形)；6.TrxA(陰性對照，白色矩形)。
圖4.為一種基於單克隆抗體和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的模式圖(I)多聚賴氨酸包被的晶片；(II)單克隆抗體KG9包被在多聚賴氨酸晶片上；(III)加rb-PrPc；(IV)加scFv-L-SBP；(V)加QD635nm-streptavidin conjugate。
圖5.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測牛朊蛋白的專一性Aa1-3rb-PrPc(10ng/mL)；b1-3TrxA(10ng/mL)；c1-3BSA(10ng/mL)；d1-3OVA(10ng/mL)。
B635nm螢光強度。黑色矩形對應rb-PrPc，條紋矩形對應TrxA，灰色矩形對應BSA，空白矩形對應OVA。每個矩形表示三個重複。
圖6.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測牛朊蛋白靈敏度。
A定量檢測rb-PrPc(a1-a3)，100pg/mL rb-PrPc；(b1-b3)，10pg/mLrb-PrPc；(c1-c3)，1pg/mL rb-PrPc；陰性對照，(d4-d6)，100pg/mL TrxA；(e4-e6)，10pg/mLTrxA；(f4-f6)1pg/mL TrxA。
B635nm螢光強度，灰色矩形對應rb-PrPc，條紋矩形對應TrxA，每個矩形表示三個重複。
圖7.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心蛋白晶片檢測鼠朊蛋白Aa1-a3鼠腦PrPc；b1-b3TrxA，10ng/mL。
B635nm螢光強度，灰色矩形對應鼠腦PrPc；條紋矩形對應陰性對照，每個矩形表示三個重複。
圖8.夾心ELISA篩選單鏈抗體融合蛋白配對1.Z186-L-SBP/Z163-Fc配對，rb-PrPc(灰色矩形)；2.TrxA(陰性對照，白色矩形)；3.Z186-L-SBP/Z1030-Fc配對，rb-PrPc(灰色矩形)；4.TrxA(陰性對照，白色矩形)；5.Z163-L-SBP/Z1030-Fc配對，rb-PrPc(灰色矩形)；6.TrxA(陰性對照，白色矩形)。
圖9.基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的模式圖。
I)streptavidin修飾的晶片；II)通過SBP-streptavidin相互作用固定Z186-L-SBP的抗體晶片的固定；III)通過抗體晶片固定rb-PrPc；IV)檢測抗體Z163-Fc-Cy3與捕獲的rb-PrPc結合，檢測螢光信號。
圖10.基於雙單鏈抗體融合蛋白夾心抗體晶片檢測牛朊蛋白的專一性Aa1-3rb-PrPc(10ng/mL)；b1-3TrxA(10ng/mL)；c1-3BSA(10ng/mL)；d1-3OVA(10ng/mL)。
B532nm螢光強度。黑色矩形對應rb-PrPc，條紋矩形對應TrxA，灰色矩形對應BSA，空白矩形對應OVA。每個矩形表示三個重複。
圖11.基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心蛋白晶片檢測牛朊蛋白的靈敏度A定量檢測rb-PrPc(a1-a3)，100pg/mL rb-PrPc；(b1-b3)，10pg/mLrb-PrPc；(c1-c3)，1pg/mL rb-PrPc；(d1-d3)，陰性對照，100pg/mL TrxA。
B532nm螢光強度，灰色矩形對應rb-PrPc，條紋矩形對應TrxA，每個矩形表示三個重複。
圖12.基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測鼠朊蛋白Aa1-a3鼠腦PrPc；b1-b3TrxA，10ng/mL。
B532nm螢光強度，灰色矩形對應鼠腦PrPc；條紋矩形對應陰性對照，每個矩形表示三個重複。
具體實施例方式
實施例1單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表達載體的構建根據圖1可知利用上遊引物SBP15』ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3』和下遊引物SBP25』TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3』擴增N端帶Linker(SSSGGSGSG)的鏈黴親和素結合肽(SBP)片段(L-SBP)(KEEFE A D.et al.2001，Protein Expression and Purification，23(3)440-446)，雙鏈兩端分別為NotI和BamHI限制性酶切位點。然後雙鏈序列與經NotI和BamHI雙酶切的線性化質粒pOPE101-215片段混合(Wang T.et al.2003，Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi.17(2)116-20)，經T4DNA連接酶於16℃下連接過夜，連接產物為載體pOPE-L-SBP。將篩選到的陽性克隆用NcoI和NotI雙酶切進行線性化，與經同樣雙酶切的pCANTAB5E-Z163(pCANTAB 5EPharmacia公司產品)和pCANTAB5E-Z186膠回收的產物Z163和Z186，以1∶3的摩爾用T4DNA連接酶於16℃下連接過夜，連接產物為pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP。
實施例2單鏈抗體融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc表達載體的構建用BamHI和NotI從載體pPICZaFc(Eeckhout D.et al.2004.JImmunol Methods 294181-187)上切下Fc基因片斷，然後和同樣雙酶切的載體pOPE-215以3∶1的摩爾比連接，用T4DNA連接酶於16℃條件下連接過夜，連接產物為編碼有Fc的pOPE-Fc。
根據圖2可知，用NcoI和NotI雙酶切pCANTAB5E-Z163和pCANTAB5E-Z1030，與同樣雙酶切的載體pOPE-Fc以3∶1的摩爾比連接，用T4DNA連接酶於16℃條件下連接過夜，連接產物為編碼有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc和pOPE-Z1030-Fc。
實施例3基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的構建1.單克隆抗體與單鏈抗體融合蛋白配對根據圖3可知，用1μg/mL單克隆抗體KG9包被96孔酶標板，用4％的PBSM於37℃封閉2h，PBS洗三遍，加10μg/mL rb-PrPc，同時，用10μg/mL TrxA為陰性對照，37℃溫育2h；分別加25μg/mL的scFv-L-SBP和scFv-Fc，37℃溫育2h；PBS洗三次，在scFv-L-SBP組中加入streptavidin-AP耦聯物，37℃溫育1h，加100μL/孔鹼性磷酸酶底物pNPP顯色，於405nm處測定吸光值；在scFv-Fc組中，加帶HRP的馬抗人Fc抗體，37℃溫育1h，加100μL/孔底物TMB顯色，於450nm處測定吸光值，以上反應複合物的OD值/陰性對照的OD值(S/N)＞2時判為陽性，每組配對設3個重複。
在單克隆抗體與單鏈抗體融合蛋白進行的配對實驗中，以單克隆抗體KG9作為捕獲抗體，分別以單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP、Z1030-Fc和Z186-L-SBP為檢測抗體，組合為KG9/Z163-L-SBP、KG9/Z1030-Fc和KG9/Z186-L-SBP，夾心ELISA結果顯示3組配對的rb-PrPc/TrxA OD450nm比值分別為3.4、2.0和1.1，KG9/Z163-L-SBP組配對顯示明顯的陽性反應，KG9/Z1030-Fc顯示陽性反應，但比值較低，因此選用KG9/Z163-L-SBP組配對用於夾心蛋白晶片檢測牛朊蛋白的研究。
2.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的構建圖4為基於單克隆抗體和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片產生的模式圖。在包被有單克隆抗體KG9的多聚賴氨酸晶片上按陣列點0.1μL/點的rb-PrPc或鼠腦組織細胞膜的提取物，室溫(20-25℃)下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，同時，以TrxA設為陰性對照，夾心抗體晶片特異性實驗分別用硫氧還蛋白(TrxA)，牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)作為陰性對照，然後在每個點上加10μg/mL的Z163-L-SBP，室溫(20-25℃)下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，風乾後加streptavidin耦聯的量子點，37℃溫育30min，用PBST和PBS各洗三次洗去未結合的量子點，量子點在635nm(Geho D，et al.2005，Bioconjug Chem，16(3)559-66)的螢光信號檢測使用GenePix 4000B(Axon Instrument)螢光掃描儀。所有的信號分析使用GenePix Pro 4.0分析軟體(Axon Instruments)，檢測限規定為信噪比(S/N)≥3時被檢朊蛋白的濃度(Cretich M.et al.2004，Anal Biochem，332(1)67-74)。
3.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的專一性為了研究基於單克隆抗體和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測牛朊蛋白的專一性，在包被有單克隆抗體KG9的多聚賴氨酸晶片上按陣列點0.1μL/點的樣品加10ng/mL rb-PrPc，同時，以TrxA、BSA和OVA為陰性對照，其然後在每個點上加10μg/mL的Z163-L-SBP，以streptavidin耦聯的量子點作為檢測信號結果顯示rb-PrPc與陰性對照在635nm的螢光強度的信噪比(S/N)分別為5.6、4.2和3.5，表明該夾心蛋白晶片採用不同的蛋白作為陰性對照均能顯示明顯的陽性結果，具有很強的的專一性(圖5A，B)。
4.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的靈敏度為了研究基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測牛朊蛋白的靈敏度，加入不同稀釋度的rb-PrPc(購自德國Roboscreen公司)進行比較，rb-PrPc稀釋度分別為100pg/mL、10pg/mL和1pg/mL，信噪比(S/N)分別為4.0、3.4和3.2，結果表明檢測限可達1pg/mL(圖6A，B)。
5.基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測鼠朊蛋白在包被有單克隆抗體KG9的多聚賴氨酸晶片上，按陣列點0.1μL/點鼠腦組織細胞膜的提取物，以TrxA作為對照同步檢測測，檢測結果顯示鼠腦組織細胞膜的提取物與陰性對照在635nm的螢光強度的信噪比(S/N)為3.1，顯示明顯的陽性結果，表明該夾心抗體晶片能夠檢測鼠腦中天然的朊蛋白(圖7A，B)。
實施例4基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的構建1.單鏈抗體融合蛋白配對用Z186-L-SBP和Z163-L-SBP(10μg/mL in PBS)分別包被96孔酶標板，用4％的PBSM於37℃封閉2h，PBS洗三遍，加10μg/mL rb-PrPc，同時，用10μg/mL TrxA為陰性對照，37℃溫育2h；加1μg/mL的Z163-Fc或Z1030-Fc 37℃溫育2h；PBS洗三次，加入馬抗人Fc-HRP抗體，37℃溫育1h，加底物TMB顯色，1M H2SO4終止反應，於450nm處測定吸光值，以上反應複合物的OD值/陰性對照的OD值(S/N)＞2時判為陽性，每組配對設3個重複。
通過單鏈抗體融合蛋白配對，對四個單鏈抗體融合蛋白進行了兩兩配對，兩個Z186-L-SBP和Z163-L-SBP作為捕獲抗體，兩個Z163-Fc和Z1030-Fc作為檢測抗體，單鏈抗體融合蛋白配對的組合為Z186-L-SBP/Z163-Fc、Z186-L-SBP/Z1030-Fc和Z163-L-SBP/Z1030-Fc，結果顯示三組配對的rb-PrPc/TrxA OD450nm比值分別為4.2、1.3和1.1，Z186-L-SBP/Z163-Fc組配對顯示明顯的陽性反應，該配對用於夾心蛋白晶片檢測牛朊蛋白的研究(圖8)。
2.基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的構建圖9為基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片產生的模式圖。在定向固定有單鏈抗體融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的晶片上按陣列點0.1μL/點的rb-PrPc或鼠腦的勻漿液，室溫(20-25℃)下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，同時，以TrxA設為陰性對照，夾心抗體晶片特異性實驗分別用TrxA，BSA和OVA作為陰性對照，然後在每個點上加1ug/mL Cy3螢光標記的蛋白Z163-Fc，室溫(20-25℃)下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，風乾後，未洗去的Cy3螢光標記的蛋白Z163-Fc在532nm的螢光信號檢測使用GenePix 4000B(Axon Instrument)螢光掃描儀。所有的信號分析使用GenePix Pro 4.0分析軟體(Axon Instruments)，檢測限規定為信噪比(S/N)≥3時，被檢朊蛋白的濃度。
3.基於雙單鏈抗體融合蛋白夾心抗體晶片的專一性按照圖10A，B所示，在定向固定有單鏈抗體融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的晶片(Nallur G，et al.2001.Nucleic Acids Res.29(23)118)上按陣列點0.1μl/點rb-PrPc，同時，以10ng/mL TrxA、BSA和OVA為陰性對照，然後在每個點上1μg/mL的Cy3螢光標記的蛋白Z163-Fc，在532nm的rb-PrPc組與陰性對照組的螢光強度的信噪比(S/N)分別為6.8，8.5和13.3，表明該夾心蛋白晶片採用不同的蛋白作為陰性對照均能顯示明顯的陽性結果，也具有很強的的專一性。
4.基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的靈敏度按照圖11A，B所示，在定向固定有單鏈抗體融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的晶片上按陣列點濃度分別為100pg/mL、10pg/mL和1pg/mL的rb-PrPc，以TrxA作為對照同步檢測，檢測結果顯示在532nm螢光強度的信噪比(S/N)分別為6.1，3.8和3.1，結果表明檢測限也可達1pg/mL。
5.基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測鼠朊蛋白按照圖12A，B所示，在定向固定有單鏈抗體融合蛋白Z186-L-SBP的Streptavidin包被的晶片上，按陣列點0.1μL/點鼠腦組織細胞膜的提取物，以TrxA作為對照同步檢測，檢測結果顯示鼠腦組織細胞膜的提取物組與陰性對照組在532nm的螢光強度的信噪比(S/N)為13，顯示明顯的陽性結果，表明該夾心抗體晶片也能夠檢測鼠腦中天然的朊蛋白。
權利要求
1.一種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法，該系統包括下列步驟A、構建三種單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP、Z186-L-SBP和Z163-Fc首先是單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表達載體的構建，利用上遊引物SBP1 5』ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3』和下遊引物SBP2 5』TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3』擴增N端帶Linker的SBP片段，雙鏈兩端分別為NotI和BamHI限制性酶切位點，然後雙鏈序列與經NotI和BamHI雙酶切的線性化質粒pOPE101-215片段混合，經T4 DNA連接酶於16℃下連接過夜，連接產物為載體pOPE-L-SBP，將篩選到的陽性克隆用NcoI和NotI雙酶切進行線性化，與經同樣雙酶切的pCANTAB5E-Z163和pCANTAB5E-Z186膠回收的產物Z163和Z186，以1∶3的摩爾用T4 DNA連接酶於16℃下連接過夜，連接產物為pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP；其次是單鏈抗體融合蛋白Z163-Fc表達載體的構建，用BamHI和NotI從載體pPICZaFc上切下Fc基因片斷，然後和同樣雙酶切的載體pOPE-215以3∶1的摩爾比連接，用T4 DNA連接酶於16℃條件下連接過夜，連接產物為編碼有Fc的pOPE-Fc，然後用NcoI和NotI雙酶切pCANTAB5E-Z163，與同樣雙酶切的載體pOPE-Fc以3∶1的摩爾比連接，用T4 DNA連接酶於16℃條件下連接過夜，連接產物為編碼有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc；B、通過夾心ELISA，篩選配對抗體Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP，兩種高特異性和靈敏度的夾心抗體晶片基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片和基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片，對重組牛朊蛋白檢測達1pg/mL，並檢測鼠腦中天然朊蛋白。
2.根據權利要求1所述的一種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法，其特徵在於基於單抗和單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的構建，首先在包被有單克隆抗體KG9的多聚賴氨酸晶片上按陣列點0.1μL/點的rb-PrPc或鼠腦組織細胞膜的提取物，室溫下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，以硫氧還蛋白設為陰性對照，夾心抗體晶片特異性實驗分別用硫氧還蛋白，牛血清白蛋白和卵清白蛋白作為陰性對照；其次是在點上加10μg/mL的Z163-L-SBP，室溫下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，風乾後加streptavidin耦聯的量子點，37℃溫育30min，用PBST和PBS洗去未結合的量子點，量子點在635nm的螢光信號檢測使用GenePix 4000B螢光掃描儀。
3.根據權利要求1所述的一種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法，其特徵在於基於雙單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片的構建，首先在定向固定有單鏈抗體融合蛋白scFv-L-SBP的Streptavidin包被的晶片上按陣列點0.1μL/點的rb-PrPc或鼠腦的勻漿液，室溫下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，同時，以TrxA設為陰性對照，夾心抗體晶片特異性實驗分別用硫氧還蛋白，牛血清白蛋白和卵清白蛋白作為陰性對照，然後在點上加1μg/mLCy3螢光標記的蛋白Z163-Fc，室溫下溫育1h，用PBST和PBS各洗三次，風乾後，未洗去的Cy3螢光標記的蛋白Z163-Fc在532nm的螢光信號檢測使用GenePix 4000B螢光掃描儀。
全文摘要
本發明公開了一種基於單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體晶片檢測系統的構建方法。本發明首先是單鏈抗融合蛋白Z186－L－SBP和Z163－L－SBP表達載體的構建，設計上下遊引物，雙鏈兩端分別為NotI和BamHI限制性酶切位點，連接產物；其次是單鏈抗體融合蛋白Z163－Fc表達載體的構建。通過夾心ELISA方法篩選用於夾心抗體晶片配對的單鏈抗體融合蛋白，並在此基礎上建立了特異性和靈敏度更高的夾心抗體晶片檢測系統，該系統的模式不僅適合朊病毒的檢測，還適用於其他疾病的病原檢測。
文檔編號G01N21/64GK1866022SQ20061001936
公開日2006年11月22日 申請日期2006年6月15日 優先權日2006年6月15日
發明者張先恩, 張吉斌, 周亞鳳, 畢利軍, 張治平, 汪世華, 陳媛媛, 郭永超, 文繼開, 喻子牛 申請人:中國科學院武漢病毒研究所