臍帶華通膠來源的間充質幹細胞在急性心肌梗死細胞移植治療中的應用的製作方法

2023-11-05 12:01:22 2

專利名稱：臍帶華通膠來源的間充質幹細胞在急性心肌梗死細胞移植治療中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物材料在醫療領域的用途，特別涉及以人臍帶華通膠為原料制 備的間充質幹細胞在製備治療急性心肌梗死細胞移植材料方面的應用。
背景技術：
冠心病是一種嚴重危害人類生命和健康的疾病，僅中國每年就有500多萬人 死於冠心病，其中死於急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)者佔相當 大的比例。近年來直接介入手術、藥物溶栓等血管重建技術的發展，使AMI早期 預後得到了改善，但是，循證醫學證實，早期血管重建只能挽救缺血頓抑心肌， 不能阻止己經壞死的心肌被無收縮力的纖維結締組織替代形成疤痕，經歷心室重 構，部分病人發展為心力衰竭。因此，必須將血管重建與心肌修復同時進行才能 根本改善冠心病患者的預後。
當代細胞生物學研究表明，具有自我更新、多向分化潛能的胚胎幹細胞和骨 髓間充質幹細胞(MSCs)可以在梗死心肌存活、分化為心肌樣細胞，改善心功能。 但是在相繼的臨床研究和應用中遇到了種種問題和障礙，諸如胚胎幹細胞的應 用存在倫理、法律、免疫排斥及致腫瘤性等問題，被醫療界放棄或擱置；自體成 體幹細胞在急性心肌梗死的細胞學治療中也遇到一些障礙①骨髂肌成肌細胞移 植治療心肌梗死存在嚴重致心律失常性；②骨髓單個核細胞移植成分複雜，具有 多向分化潛能的幹細胞含量低，分化潛能有限；③造血幹細胞CD34不能分化為 心肌細胞表型；④CD133細胞移植可致冠脈支架再狹窄；⑤內皮祖細胞改善心功 能作用有限；⑥骨髓間充質幹細胞(MSCs)來源受限，細胞增殖分化潛能隨年齡 的增長而明顯下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明顯低於同齡健康人， 體外長期擴增降低體內分化歸巢潛能；⑦臍血源MSCs分離效率低。因此，冠心 病幹細胞治療的技術瓶頸是解決多能幹細胞的來源。
目前急性心肌梗死細胞治療亟待解決的問題是①冠心病及老年患者自體
4幹細胞分化增殖及旁/自分泌功能減低，不能達到有效的生物學效應；②AMI細 胞移植的最佳時間窗為梗死相關血管重建後4-6天，而自體骨髓MSCs製備時間 要長得多，因此錯失最佳細胞移植時機;③自體骨髓MSCs製備經約14天後，BMSCs 細胞數也僅能達到2-3X106，達不到有效劑量，如進一步擴增，則BMSCs體積過 大易致冠脈微栓塞；④AMI患者對於抽取自體約80ml骨髓顧慮重重，醫從性差； ⑤病人為等待BMSCs製備拖延住院時間，醫療費用增加。
本發明人的在先專利申請"200910157731.6臍帶華通膠間充質幹細胞的制 備方法及其產品"為急性心肌梗死實施細胞治療提供了新的物質基礎。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，將臍帶華通膠來源的間充質幹細胞作為細胞移 植材料應用於對急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的治療。
本發明所稱"臍帶華通膠來源的間充質幹細胞"，英文名稱為"Umbilical Cord Wharton， s Jelly- Derived MSCs, UW-MSCs"，是按以下方法製備的
取人新鮮臍帶，以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養基洗去臍帶殘留血液，去 除臍動脈、臍靜脈及臍帶外膜，剝離華通膠並剪切成小塊，再以等滲的平衡鹽溶 液或無血清培養液衝洗後，浸泡於0.05-0.3%膠原酶溶液中，置於35-37.5 "C溫箱中10-30小時，組織塊消化，液體呈粘稠狀，然後加入相當於原液l-10倍量的含胎牛血清的培養基終止消化，分裝於培養瓶或培養皿，置C02培養箱， 待細胞貼壁後更換含胎牛血清的培養基溶液，以後每隔2 4天換液一次，細胞貼 壁融合後傳代培養；傳代培養2~4代，即時使用或冷凍保存備用。
本發明所稱"臍帶華通膠來源的間充質幹細胞"在生物學表型鑑定中，具 有以下技術特徵:①在標準培養條件下粘附於塑料制培養器皿生長;②表達CD90、 CD105、 CD44; HLA-ABC;不表達CD45、 CD34, HLA-DR;③體外可誘導分化為成 骨細胞和脂肪細胞。
本發明方法所用UW-MSCs細胞移植材料，可以即時使用剛剛完成傳代培養2 一4代的UW-MSCs新鮮品；也可以使用冷凍保存的傳2—4代UW-MSCs備用品。
本發明方法對急性心肌梗死患者移植UW-MSCs的常用方法為冠狀動脈灌注。
本發明經冠狀動脈UW-MSCs移植術治療心肌梗死的適應症包括，根據病史、 心電圖、實驗室等檢査，按照WHO/AHA/ACC急性心肌梗死診斷標準及分類，屬於急性ST段抬高型心肌梗死和急性非ST段抬高心肌梗死，發病在1個月以內者。
下列情況屬於本發明方法的不適應症肝臟或腎臟功能障礙；出血性疾 病、惡性腫瘤；自身免疫病或任何嚴重致命性疾病；冠脈介入治療禁忌證；其 它心臟病者先天性心臟病(室缺、房缺、動脈導管未閉等先天性畸形)；原發 性心瓣膜疾病；肺源性心臟病；甲亢性心臟病、粘液水腫性心臟病等。 經冠狀動脈超選擇性UW-MSCs移植術技術要點
急性心肌梗死發病6小時之內實施血管重建術者，於血管重建後4-6天實施 UW-MSCs移植；急性心肌梗死發病在12小時以上，在一個月內擇期實施血管重 建的患者，於血管重建手術的同時實施冊-MSCs移植。手術方法是，在冠狀動脈 梗死相關血管，經穿導絲球囊導管，每次在充盈球囊完全封堵靶血管下高壓注 入l-2 X107rd臍帶華通膠間充質幹細胞懸液2ml，每次球囊充盈持續I分鐘， 後解除球囊充盈2分鐘，共重複5-6次，移植細胞數共2-3X107。
行冠脈造影及經皮穿刺冠脈介入治療(PCI術)，成功的血管再通後行超選擇 性UW-MSCs移植。將超長(3m)BMW導絲置於閉塞重建血管遠端，沿導絲插入穿導 絲球囊置於梗死閉塞段血管，抽出導絲，連接壓力泵，充盈球囊4-8個大氣壓 不等，以阻斷前向血流為標準，以高壓快速注入2ml含4Xl(fUW-MSCs(2X106 個/ml)細胞懸液，氣囊保持充盈1分鐘後恢復灌注，2分鐘後重複上述操作注 入UW-MSCs,共注入5-6次。術中密切心電和血液動力學監測。
本發明匿-MSCs移植術治療心肌梗死的機理是利用UW-MSCs較自體幹細胞 更強的自我更新及多向分化潛能，及歸巢與旁/自分泌功能，釋放大量生物因子， 促進血管和心肌再生等生物學效應來修復心肌、減少梗死面積、限制心室重構， 從而改善心肌梗死患者的近期和遠期預後。
對本發明細胞移植療法的效應，按照國際醫學界通行的標準，主要從心肌重 建有效和心功能改善有效兩方面進行分析判斷；對本發明細胞移植療法的安全 性，按照國際醫學界通行的標準，主要從冠脈再狹窄、心律失常發生率、致腫瘤 性、心肌纖維化和鈣化、微血管栓塞、系列實驗室檢査指標進行評價。
本發明應用以臍帶華通膠製備的間充質幹細胞UW-MSCs，其增殖能力、純度 均高於骨髓間充質幹細胞MSCs。UW-MSCs所釋放的幹細胞因子、粒細胞集落因子、 肝細胞生長因子、轉化生長因子-3、白介素-8等生長因子、細胞因子量明顯高 於BMSCs。本發明方法的應用有助於解決目前困擾醫學界的多個問題，例如①胚胎幹細胞存在的倫理道德、法律、免疫排斥及致腫瘤性等問題；②成體幹細胞 存在的分化增殖歸巢能力低及製備周期長等種種缺陷；③冠心病患者自體骨髓抽 取醫從性差、MSCs增殖能力差劑量不足、AMI細胞時間窗等問題；④從根本上改 善心肌梗死預後。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步說明。
實施例1 UW-MSCs移植材料的準備——應用UW-MSCs新鮮品
將剛剛完成傳代培養2—4代的臍帶華通膠間充質幹細胞新鮮品，以0. 05 -0.25%胰酶消化1一5分鐘，血清中和，平衡鹽溶液洗滌3遍，離心機的離心力 控制在100-1000g，應用"10-20單位肝素/毫升0. 9%氯化鈉"注射液重懸使用。
實施例2 UW-MSCs移植材料的準備——應用冷凍保存的UW-MSCs備用品
從低溫容器中取出凍存的傳2—4代臍帶華通膠間充質幹細胞，迅速放入35 一38"溫箱及水浴箱中，2分鐘內溶化，使用完全培養基溶液重懸細胞，培養2 一4天細胞融合後重新消化、洗滌細胞，配以肝素氯化鈉注射液製成細胞濃度為 l一2X107ml的細胞懸液，通常按每支10毫升包裝。其中用以懸浮細胞的肝素 氯化鈉注射液，優選配比為肝素1000單位生理鹽水100毫升。
實驗例l W-MSCs體內外向心肌細胞分化及功能鑑定
純化3代UW-MSCs用DAPI染色標記後用5-氮胞苷誘導分化，2周後行免疫 螢光染色，共聚焦顯微鏡下檢測發現在DAPI染色陽性的UW-MSCs可分化為具 有心肌細胞表型特徵的心肌樣細胞，與DAPI共表達肌鈣蛋白(TnT)、肌動蛋白 (a-actin) 、 GATA-4、 connexin-43。進一步在體內，在大鼠急性心肌梗死模型上， 將綠色螢光蛋白基因(EGFP)轉染UW-MSCs作為UW-MSCs標記，將IX 106UW-MSCs-EGFP注入大鼠梗死心肌周圍，4周後心肌組織冷凍切片，免疫螢光 共聚焦顯微鏡檢測，可見原梗死心肌組織中有EGFP標記的移植細胞UW-MSCs存 活生長及分化，EGFP陽性的移植細胞與EGFP共表達肌鈣蛋白(TnT)、肌動蛋白 (a-actin) 、GATA-4、connexin-43等心肌細胞表型標誌。為了進一步鑑定UW-MSCs 移植後整體心功能效應，於AMI製備後及UW-MSCs移植後應用2維超聲心動圖進 行了動態心功能監測，結果顯示UW- MSCs移植後7天LVEF絕對值增加5. 3%、 28天增加6.8%,短軸縮短率亦明顯增加，而對照組心功能惡化化，應用TTC染
7色心肌梗死範囲明顯縮小。
實驗例2 UW-MSCs免疫源性鑑定
本發明將UW-MSCs作心肌梗死移植材料，與自體BMSCs所不同的是，採用的 是同種異體幹細胞作為種子細胞來源，即異基因種子細胞。異基因種子細胞移植 的關鍵是移植免疫學問題，此也是本發明實用性所系。為此，發明人進行了系統 的UW-MSCs體內外免疫源性鑑定。
體外實驗以流式細胞儀進行了 UW-MSCs免疫表型鑑定，結果為UW-MSCs 僅表達HLA-ABC，不表達HLA-II類抗源HLA-DR及協同刺激抗源CD80, CD86,表 明UW-MSCs體外無免疫源性。
UW-MSCs移植後進行整體免疫學觀察，觀察項目和結果為①動態混合淋巴 細胞培養試驗發現UW-MSCs對異體淋巴細胞有明顯抑制增殖反應；②外周血T細 胞亞群檢測，流式細胞儀動態檢測移植後大鼠周圍血T淋巴細胞CD3、 CD4、 CD8 變化，UW-MSCs均無刺激增加；③局部組織病理學檢測光鏡檢測UW-MSCs移植 區域心肌組織未見淋巴細胞、巨噬細胞增殖侵潤等心肌組織免疫反應性變化。
實驗例3 UW-MSCs移植在急性心肌梗死模型實驗
大鼠給鹽酸氯胺酮10mg/kg、速眠新80mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管人工 呼吸支持下，於左3-4肋間切開，逐層切開暴露左心耳與肺動脈交界前室間溝， 7-0絲線模穿冠狀動脈左前降支近段全層結紮，顯示左室前壁心肌變紫黑色，局 部心電圖顯示ST段-T明顯抬高，為AMI模型成功。於AMI後lh，將經ad-EGFP 基因轉染的1X106UW- MSCs分5點注入梗死心肌周圍。
大鼠存活4周處理，UW-MSCs移植大鼠及對照組大鼠心臟大體解剖石臘切片， 光鏡檢測，顯示在梗死心肌中可見新生心肌細胞。共聚焦圖心肌細胞表型特徵。
UW-MSCs移植後心臟功能明顯改善，如下表所示。
Control group (n:=8)UW-MSCs group (n=8)lday7 days28 days1 day7 days28 days
UVEF(%)51.7±2.848.4 ±4.045.9±4.4*51.4±3.156.7±3.7*58.2±3.0**
LVEDV(ml)1.80±0.21.84 ±0.21.83±0.21.81 ±0.31.71 ±0.31.70±0.2
LVESV(ml)0.87 ±0.20.95 ±0.20.99 ±0.2*0.88 ±0.20.74 ±0.20.71 ±0.2*
FS (%)26.5 ±1.824.5 ±0.921.9±1.4*26.1 ±0.927.0±1.128.1 ±1.0*
注LVEF:左室射血分數；LVEDV:左室舒張末容量；LVESV:左室收縮末容量;
FS:短軸縮短率
權利要求
1.臍帶華通膠來源的間充質幹細胞作為治療急性心肌梗死細胞移植材料的應用。
2. 根據權利要求1所述臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵在於， 所述急性心肌梗死為冠心病急性ST段抬高型或非ST段抬高型心肌梗死。
3. 根據權利要求2所述臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵在於， 所述急性心肌梗死為發病在1個月內的病例。
4. 根據權利要求3所述臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵在於， 臍帶華通膠間充質幹細胞移植是對發病6小時內實施血管重建術的急性心肌 梗死病例，在術後4-6天實施冠狀動脈灌注移植的。
5. 根據權利要求3所述臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵在於， 臍帶華通膠間充質幹細胞移植是對擇期實施血管重建的急性心肌梗死病例， 於手術同時實施冠狀動脈灌注移植的。
6. 根據權利要求l一5任一權利要求所述的臍帶華通膠間充質幹細胞的 用途，其特徵在於，所用細胞移植材料為完成2—4代傳代培養的臍帶華通膠 間充質幹細胞新鮮品。
7. 根據權利要求l一5任一權利要求所述的臍帶華通膠間充質幹細胞的 用途，其特徵在於，所用細胞移植材料為經傳代培養2—4代的臍帶華通膠間 充質幹細胞冷凍保存品。
8. 根據權利要求7所述的臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵在於， 使用冷凍保存的臍帶華通膠間充質幹細胞的方法是，從低溫容器中取出凍存 的細胞迅速放入35-38'C溫箱及水浴箱中，2分鐘內溶化，使用完全培養基 溶液重懸細胞，培養2-4天細胞融合後重新消化、洗滌細胞，用肝素氯化鈉 注射液製成細胞濃度為1—2X107ml的臍帶華通膠間充質幹細胞懸液。
9. 根據權利要求8所述的臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵在於， 用以懸浮細胞的肝素氯化鈉注射液，其配比為肝素1000單位生理鹽水 100毫升。
10. 根據權利要求4或5所述臍帶華通膠間充質幹細胞的用途，其特徵 在於，經穿導絲球囊導管，每次在充盈球囊完全封堵靶血管下高壓注入1-2X10Vml臍帶華通膠間充質幹細胞懸液2ni1，每次球囊充盈持續1分鐘，後 解除球囊充盈2分鐘，共重複5-6次，移植細胞數共2-3X107。
全文摘要
本發明公開了臍帶華通膠來源的間充質幹細胞作為治療急性心肌梗死細胞移植材料的應用。適用於發病在1個月內的ST段抬高型心肌梗死或非ST段拾高型心肌梗死病例，發病6小時之內實施血管重建術者在術後4-6天作冠狀動脈灌注，其他擇期實施血管重建術者，於手術同時實施冠狀動脈灌注。本發明方法治療效果優於骨髓間充質幹細胞移植。
文檔編號A61K35/12GK101642469SQ200910170249
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月9日 優先權日2009年9月9日
發明者丁青艾, 張寧坤, 毅 曹, 朱智明, 曄 楊, 宇 陳, 高連如 申請人:中國人民解放軍海軍總醫院