一種用於水稻品種鑑定的snp晶片、製備方法及用途
2023-11-05 06:24:07
一種用於水稻品種鑑定的snp晶片、製備方法及用途
【專利摘要】本發明提供了一種用於水稻品種鑑定的SNP晶片，該晶片包含3072個分子標記，3072個SNP分子標記是SEQIDNO.0001~SEQIDNO.3072；本發明還提供一種上述SNP晶片的製備方法，包括步驟：從水稻栽培品種重測序數據獲得SNP分子標記、對SNP分子標記進行篩選和採用篩選後的分子標記設計探針製作SNP晶片；本發明還提供上述SNP晶片在水稻品種真實性和身份鑑定中的應用。本發明提供的3072個SNP分子標記組合的應用將極大提高檢測準確度、縮短檢測時間、大幅提升我國水稻品種鑑定技術水平。
【專利說明】-種用於水稻品種鑑定的SNP晶片、製備方法及用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種SNP分子標記組成的晶片產品、製備方法及其在水稻品種鑑定中 的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國最主要的農作物，對保障國家糧食安全起到舉足輕重的作用。而種子 則是糧食生產的源頭，種子分子特徵是區別農作物品種的關鍵因素。隨著分子標記技術的 發展，DNA標記鑑別農作物品種，是開展品種鑑定、解決品種爭議和授予新品種權的依據，也 將是促進種業有序競爭的有效手段。
[0003] 品種分子鑑定是種業健康發展的必然要求：我國目前種子經營主體數量多，假冒 偽劣種子禁而不絕，套牌侵權問題突出，種子市場秩序比較混亂，嚴重侵害了農民和合法經 營企業的權益。種子鑑定是種子市場監管和品種審定準入的主要內容。2011年，《國務院 關於加快推進現代農作物種業發展的意見》明確提出，建立手段先進、監管有力的種子管理 體系，嚴厲打擊套牌侵權、生產經營假劣種子行為，切實維護公平競爭的市場秩序。分子檢 測技術為解決這一問題提供了有效的途徑，可以破解管理技術瓶頸。加快分子檢測技術的 研發和應用，是當前種子質量管理工作的一項重要而迫切的任務。
[0004] SNP鑑定技術是品種鑑定的發展趨勢：品種分子檢測技術主要有基於RAPD、AFLP、 SSR等標記技術。目前最成熟的快速鑑定方法是利用第二代分子標記SSR檢測，2007年已 經頒布了農業行業標準（NY/T1433-2007)，並建立了一套基於SSR標記的水稻DNA指紋檢測 技術體系和包含水稻授權品種及部分水稻審定品種的DNA指紋圖譜資料庫。但該方法在實 踐過程中也暴露出檢測的通量低、較難實現數據整合共享的缺陷，不適應今後品種快速鑑 定工作的需要。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)指在基因組上單個核苷酸的變異 所形成的核酸序列多態性，是目前認為最具有研發潛力的檢測技術，與SSR標記相比具有 以下優勢：一是在基因組中分布密度更高更均勻；二是易實現數據整合比較；三是通量高， 檢測位點數可達幾百萬個；四是部分標記與功能基因甚至植物表型相關。
[0005] 國際植物新品種保護聯盟（UPOV)於2010年發布了 DNA分子標記選擇和資料庫構 建指南（簡稱BMT指南），認為SSR和SNP標記是特別適用於品種鑑定的技術。近年來SNP 標記被研究者青睞，已成為國內外研究的熱點。Illumina、Affymetrix等公司相繼推出了 SNP基因分型高通量檢測平臺，為自動化和低成本的SNP晶片檢測技術研發與應用提供了 良好的技術保障。SNP分子標記檢測技術近年來被廣泛應用於甜瓜、菜豆、甜椒等蔬菜分子 輔助育種及品種鑑定研究。杜邦先鋒種子公司的種子檢測從2007年開始已淘汰其他技術， 完全採用SNP檢測技術，取得了良好成效。在國內，主要關注的是全基因組精細圖譜的構建 以及關聯分析和複雜性狀研究等方面，而利用SNP標記對水稻品種進行分子鑑定方面正處 於初始研究階段。建立基於SNP標記技術的水稻品種鑑定方法，可以進一步提高我國水稻 品種鑑定技術的規範化和標準化水平，填補國內關於此方面研究的空白。
【發明內容】
[0006] 本發明的一個目的在於提供一種用於水稻品種鑑定的SNP晶片，能通過晶片上的 分子標記對水稻品種進行檢測。
[0007] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是：所述SNP晶片包含3072個SNP分 子標記，所述3072個SNP分子標記是基於950份水稻栽培品種的序列比對篩選得到的，所 述3072個SNP分子標記是序列表中的SEQ ID NO. 0001?SEQ ID NO. 3072。
[0008] 本發明所提供的SNP晶片命名為RiceID3072,本發明的晶片RiceID3072上的SNP 位點是指序列表中SEQ ID NO. 0001?SEQ ID NO. 3072所示的序列中方括號（[])中的核 苷酸。
[0009] 本發明的另一個目的在於提供上述SNP晶片的製備方法。
[0010] 本發明解決該技術問題所採用的技術方案是：SNP晶片RiceID3072的製備方法， 包含以下步驟：
[0011] (1)通過基於950份水稻栽培品種重測序的數據獲得800, 000個SNP分子標記，所 述重測序的數據來源於網址WWW. ncgr. ac. cn/ricehap2 ;
[0012] (2)利用生物信息學軟體Haploview對步驟（1)所獲得的800, 000個SNP分子標 記根據連鎖不平衡篩選具有標記性的SNP (tagsnp)，得到10, 000個SNP分子標記；
[0013] (3)根據步驟（2)所得到的10, 000個SNP分子標記的缺失率、位點評分估值、多態 值和基因分布等，從中篩選了 3072個分子標記用於製備水稻晶片；
[0014] (4)根據步驟（3)篩選的3072個分子標記設計探針製作SNP晶片。
[0015] 本發明所提供的方案中，所述3072個SNP分子標記的物理位置是基於950份水稻 栽培品種的序列比對確定的，網址見WWW. ncgr. ac. cn/ricehap2 ;所述3072個SNP分子標 記的序列是 SEQ ID NO. 0001 ?SEQ ID NO. 3072。
[0016] 本發明還提供了上述SNP晶片在鑑定水稻品種真實性和鑑定水稻品種身份中的 應用。
[0017] 鑑定水稻品種的真實性時，利用所述SNP晶片檢測並獲得任意兩個待測水稻樣品 基因組DNA的3072個SNP分子標記基因型，進行比較從而鑑定待測和對照水稻樣品為同一 品種或不同品種；鑑定水稻品種的身份時，利用所述SNP晶片檢測並獲得待測水稻樣品基 因組DNA的3072個SNP分子標記基因型，與已知品種進行比較從而鑑定所述待測水稻樣品 為哪個水稻品種；所述3072個分子標記的基因序列是序列表中的SEQ ID NO. 0001?SEQ ID NO. 3072。
[0018] 具體的比較方法通過如下方案來實現的：將不同水稻樣品的3072個分子標記的 基因型進行比較後，根據公式（1)計算不同水稻樣品的遺傳相似度，若兩個水稻樣品在所 述3072個SNP分子標記的遺傳相似度> 95%，則這兩個樣品屬於同一品種；若所述遺傳相 似度彡95%，則這兩個樣品存在顯著差異，不屬於同一品種。所述95%為採用本發明的SNP 晶片進行水稻品種鑑定時，優選的遺傳相似度閾值。
[0019] 遺傳相似度 GS = 2NijV(Ni+Nj) 公式（I) (Neil979)
[0020] 其中Nij為兩個水稻樣品共有的多態基因條帶數，Ni為其中一個水稻樣品的基因 條帶數，Nj為另一個水稻樣品的基因條帶數。
[0021] 本發明的有益效果是：本發明所提供的基於3072個SNP分子標記新組合基礎上的 SNP晶片--RiceID3072可應用於水稻真實性檢測及品種鑑定中；而且這3072分子標記組 合的應用可極大提高檢測準確度、縮短檢測時間、提高檢測水平。這將為分子檢測提供更有 效、可靠的技術手段；並將為水稻品種鑑定提供重要的技術支撐。
[0022] 附加說明
[0023] 圖1為SNP位點（SEQ ID NO. 0016)檢測效果示意圖；
[0024] 圖2為SNP位點（SEQ ID NO. 0027)檢測效果示意圖；
[0025] 圖3為需剔除的SNP位點的檢測效果示意圖；
[0026] 圖4為需剔除的SNP位點的檢測效果示意圖；
[0027] 圖5為RiceID3072晶片上所有位點在全基因組上分布示意圖；參照基因組為水稻 第6版本基因組序列（http://rice. plantbiology. msu. edu)，染色體上的每一條短線表示 1個SNP位點。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例對本發明作進一步的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0029] 實施例I :RiceID3072晶片的製備。
[0030] 通過基於950份水稻栽培品種重測序的數據（見網址WWW. ncgr. ac. cn/ricehap2) 獲得800, 000個SNP分子標記；利用生物信息學軟體（Haploview)根據連鎖不平衡篩選具 有標記性的SNP (tagsnp)得到10, 000個SNP分子標記；然後對每個位點根據以下特徵進行 進一步篩選評估：（1)位點評估分值是否在〇. 6以上；（2)重複性是否在99%以上；（3)缺 失率是否低於3% ; (4)是否為單拷貝；（5)不在轉座子、重複區域等中；（6)位點上下60bp 以內不存在其他SNP;(7)基因組均勻分布。最終篩選了 3072個分子標記，按照Illumina Infinium iSelectHD要求設計探針製作晶片。所述3072個SNP分子標記的序列表如表1所 示：
[0031] 表1:
[0032]
【權利要求】
1. 一種用於水稻品種鑑定的SNP晶片，其特徵在於：所述SNP晶片包含3072個SNP分 子標記，所述3072個SNP分子標記是序列表中的SEQ ID NO. 0001?SEQ ID NO. 3072。
2. 權利要求1所述的SNP晶片的製備方法，其特徵在於：包含以下步驟： (1) 通過基於950份水稻栽培品種重測序的數據獲得800, 000個SNP分子標記； (2) 對步驟（1)所獲得的800, 000個SNP分子標記根據連鎖不平衡篩選具有標記性的 SNP，得到10, 000個SNP分子標記； (3) 根據步驟（2)所得到的10, 000個SNP分子標記的缺失率、位點評分估值、多態值和 基因分布等，篩選3072個分子標記； (4) 根據步驟（3)篩選的3072個分子標記設計探針製作SNP晶片。
3. 權利要求1所述的SNP晶片在水稻品種真實性鑑定中的應用，其特徵在於：所述SNP 晶片用於鑑定水稻品種的真實性，即利用所述SNP晶片檢測並獲得任意兩個待測水稻樣品 的如權利要求1所述的3072個SNP分子標記的基因型，進行比較從而鑑定待測和對照水稻 樣品為冋一品種或不冋品種。
4. 權利要求1所述的SNP晶片在水稻品種身份鑑定中的應用，其特徵在於：所述SNP芯 片用於鑑定水稻品種的身份，即利用所述SNP晶片檢測並獲得待測水稻樣品的如權利要求 1所述的3072個SNP分子標記的基因型，與已知品種進行比較從而鑑定所述待測水稻樣品 為哪個水稻品種。
【文檔編號】C40B40/06GK104328507SQ201410535766
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】徐群, 韓斌, 魏興華, 黃學輝, 龔浩, 馮躍, 袁筱萍, 餘漢勇, 王一平 申請人:中國水稻研究所