一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法
2023-11-05 04:54:37
專利名稱:一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法
技術領域：
本發明具體涉及一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法。
背景技術：
慢性B型肝炎或其它各種慢性肝臟損傷導致的肝硬化是影響肝病患者生存質量的最主要的併發症。目前認為導致肝硬化的肝纖維化過程是可以被阻斷和逆轉的，因此在治療慢性肝病的同時，積極治療肝纖維化是防止肝硬化發生的重要治療措施。目前，西醫對肝纖維化的治療尚無理想藥物，國外的研究還多集中於基礎方面，以期在逐漸明了的肝纖維化形成機理中尋找突破口。而中藥抗肝纖維化研究從臨床觀察和動物實驗入手，其初步結果已顯示出巨大的潛力。
在利用積雪草煎劑預防爆發性肝炎和慢性肝病，特別是慢性病毒性肝炎導致的肝硬化方面進行了長期的臨床觀察，發現積雪草可以較好地阻止肝硬化的發生。為了確保療效的穩定和更加符合現代化醫藥的要求，對積雪草的有效成分進行的提取，並利用動物試驗對其療效和作用機理進行了研究。結果發現積雪草中的三萜皂甙可顯著地阻斷四氯化碳對試驗小鼠造成的肝損傷，特別是減少肝纖維化程度。
對中藥有效成分進行提取並通過動物試驗證明其療效，為中藥現代化提供了一條行之有效的途徑。明確積雪草抗肝纖維化的有效成分為三萜皂甙可確保給藥劑量的穩定，減少煎劑導致的劑量波動。另外，傳統中藥對藥物的產地、種植和採集都有嚴格的規定，目的就是要確保藥材的質量，歸根到底還是有效成分的穩定。因此，確定和提純中藥有效成分可將傳統方法對中藥質量的過程控制，轉變為更為簡便準確的結果控制，有利於中藥的現代化。
積雪草三萜皂甙(Asiaticoside)是從我國傳統中草藥積雪草中提取的具有抗纖維化作用的有效成分。積雪草又名落得打、崩大碗、馬蹄等，分布於我國江南各地，為唇形科植物。中醫認為其性微寒，味苦、辛，有清熱除溼、解毒利尿作用，常用於治療外感風寒。我們從臨床實踐中發現積雪草煎劑對預防各種肝炎所致的肝纖維化和肝硬化效果良好。為了研究積雪草具有抗肝纖維化和肝硬化療效的有效成分，我們從積雪草中提取出一種三萜皂甙，並利用四氯化碳製備的肝硬化大白鼠模型進行了積雪草三萜皂甙對阻止肝纖維化病理基礎的實驗研究。結果表明，積雪草三萜皂甙可明顯減少試驗大白鼠肝臟纖維退行性變、肝纖維化和肝硬化。
努力實現積雪草三萜皂甙中成藥的商品化，以便使積雪草能以療效更加確切可靠、服用更加方便以及副作用更少來造福與廣大患者。
發明內容本發明的目的是提供一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙，及其該積雪草三萜皂甙的製備方法。
本發明一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法的具體技術步驟為1、採用低沸點系統溶劑提取法，積雪草1kg，用乙醇回流提取2小時，共3次，回收乙醇浸膏。
2、將乙醇浸膏加水混溶，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，之後再用水飽和的正丁醇萃取。
3、將正丁醇萃取物減壓回收，再加少量甲醇溶解，加入數倍量無水丙酮，析出黃色沉澱，即可得到粗總甙，得率為0.95％。
4、將獲得的約9.5g的粗總甙用少量甲醇溶解，加矽膠拌勻、烘乾。
5、用矽膠溼法裝柱後，再上樣品矽膠，用16∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脫，依次收集18個組份，每個組份50ml，將收集到的組份用薄板層析檢測，一般需要將9～15組份濃縮後，再上柱用14∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脫液，進一步洗脫純化。
6、將收集液濃縮後，用甲醇反覆結晶，可得到白色針狀晶體，即雪草三萜皂甙，得率為0.15％。
本發明製備方法所得積雪草三萜皂甙作為製備治療抗肝纖維化藥物之應用。
本積雪草提取物的檢測應用薄板層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)方法檢測分析。
1.薄板層析(TLC)檢測法對照品積雪草三萜皂甙從上海藥物工業研究所購得，薄板層析矽膠G從青島海洋化工廠購得，展開劑為4∶1∶5的正丁醇∶醋酸乙酯∶水，顯色劑為20％硫酸乙醇。
2.高效液相色譜(HPLC)檢測法對照品同薄板層析法，儀器型號Waters 515，所用檢測器為Waters 2487，使用波長UV204nm，色譜柱為ODS-C184.6×250mm，流動液相為22∶28∶50的乙腈∶甲醇∶水，流速為0.8ml/Min。
我們利用低沸點系統溶劑提取法從積雪草中提取的積雪草三萜皂甙純度經薄板層析和高效液相色譜分析，純度可達90％。
積雪草苷對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化有明顯的阻斷作用的實驗材料與方法1.動物2個月齡的健康雄性SD大鼠24隻，體重250±20g，由廣東省實驗動物中心購得。
2.藥品積雪草苷(1g相當於50g生藥)，室溫保存。四氯化碳由廣州市海珠區化學試劑廠生產，分析純，批號20040614，實驗時用食用花生油配製成20％(Vol Vol)的溶液。
3.方法3.1分組將實驗用SD大鼠隨機分為正常組、模型組和積雪草苷治療組，每組8隻。模型組和積雪草苷治療組用20％的四氯化碳溶液腹腔注射，每次10ml kg，每天1次，連續30天，共30次。正常組腹腔注射等量生理鹽水。積雪草苷治療組給予2mg劑量積雪草苷灌胃給藥。所有大鼠自由飲水、攝食。
3.2病理組織學在實驗結束時用3％戊巴比妥鈉腹腔注射(45mg kg麻醉動物，腹主動脈取血製備血清，-20℃冰箱保存。採血後取肝臟置10％福馬林溶液中固定，HE染色，按王寶恩等對實驗動物肝纖維化程度分級標準[8]進行分級。
3.3血清蛋白、轉氨酶和透明質酸含量檢測血清白蛋白和球蛋白檢測試劑購自上海申能-德賽診斷技術公司，谷丙轉氨酶和穀草轉氨酶檢測試劑購自上海復星長徵醫學科學公司，按試劑說明在日立7170型全自動生化儀上測定。透明質酸檢測試劑購自上海海研醫學生物技術中心，按試劑說明在？品牌1470全自動檢測儀上測定。
4.統計學處理計量資料和等級資料求均數與標準差，計量資料差異分析採用t檢驗，等級資料差異分析採用秩和檢驗。
結果各組大鼠肝臟病理組織學結果正常對照組大鼠未發現肝纖維化，分級均為0級，肝小葉結構完整，無炎細胞浸潤，無纖維化增生。模型對照組大鼠肝纖維化程度明顯，5隻為5級，2隻為6級；5級肝小葉結構完全破壞，假小葉形，大方形假小葉與小園形假小葉各佔50％；6級肝內布滿園形假小葉，假小葉間有粗大增生的膠原纖維。模型治療組3隻為2級，2隻為3級，1隻為4級；2級膠原纖維從匯管區或中央靜脈周圍向外延伸明顯，但未包繞整個肝小葉；3級膠原纖維延伸明顯，相互連接，包繞整個肝小葉；4級膠原纖維包繞分割肝小葉，以致正常肝小葉結構破壞，假小葉形成，但以大方形假小葉形為主。積雪草苷治療組與模型對照組比較，肝纖維化程度、肝組織炎症細胞浸潤和脂肪變性程度均明顯減輕。積雪草苷治療組肝纖維化平均等級為2.67±0.82，模型對照組的5.28±0.40明顯降低，統計學處理差異具有顯著性(P＜0.05)。結果見表1以及圖2、3、4。
表1.積雪草甙治療實驗研究各組SD大鼠肝纖維化等級分布情況
注1.對照組為腹腔注注射生理鹽水的正常對照鼠2.模型對照組為腹腔注注射四氯化碳的肝纖維化模型鼠3.模型治療組為腹腔注注射四氯化碳同時餵積雪草甙的治療鼠結論積雪草苷滴丸對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化有明顯的阻斷作用。
圖1.積雪草甙分子式圖2.正常對照SD大鼠的肝組織肝組織無膽管增生，無纖維化形成，肝纖維化分級為0。
圖3.模型對照SD大鼠的肝組織肝細胞有變性，核縮小，肝內布滿園形假小葉，假小葉間有粗大增生的膠原纖維，該圖為VI級肝纖維化。
圖4.積雪草甙治療SD大鼠的肝組織膠原纖維從匯管區或中央靜脈周圍向外延伸明顯，但未包繞整個肝小葉，該圖I為I級肝纖維化。
具體實施方式實施例本發明一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法1、採用低沸點系統溶劑提取法，積雪草1kg，用乙醇回流提取2小時，共3次，回收乙醇浸膏。
2、將乙醇浸膏加水混溶，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，之後再用水飽和的正丁醇萃取。
3、將正丁醇萃取物減壓回收，再加少量甲醇溶解，加入數倍量無水丙酮，析出黃色沉澱，即可得到粗總甙，得率為0.95％。
4、將獲得的約9.5g的粗總甙用少量甲醇溶解，加矽膠拌勻、烘乾。
5、用矽膠溼法裝柱後，再上樣品矽膠，用16∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脫，依次收集18個組份，每個組份50ml，將收集到的組份用薄板層析檢測，一般需要將9～15組份濃縮後，再上柱用14∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脫液，進一步洗脫純化。
6、將收集液濃縮後，用甲醇反覆結晶，可得到白色針狀晶體，即雪草三萜皂甙，得率為0.15％。
本發明實施例製備方法所得積雪草三萜皂甙作為製備治療抗肝纖維化藥物之應用。
權利要求
1.一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法，其特徵在於，其製備方法為(1)採用低沸點系統溶劑提取法，積雪草1kg，用乙醇回流提取2小時，共3次，回收乙醇浸膏；(2)將乙醇浸膏加水混溶，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，之後再用水飽和的正丁醇萃取；(3)將正丁醇萃取物減壓回收，再加少量甲醇溶解，加入數倍量無水丙酮，析出黃色沉澱，即可得到粗總甙，得率為0.95％；(4)將獲得的約9.5g的粗總甙用少量甲醇溶解，加矽膠拌勻、烘乾；(5)用矽膠溼法裝柱後，再上樣品矽膠，用16∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脫，依次收集18個組份，每個組份50ml，將收集到的組份用薄板層析檢測，一般需要將9～15組份濃縮後，再上柱用14∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脫液，進一步洗脫純化；(6)將收集液濃縮後，用甲醇反覆結晶，可得到白色針狀晶體，即雪草三萜皂甙，得率為0.15％。
2.根據權利要求
1所述的一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙及其製備方法，其特徵在於，該製備方法所得積雪草三萜皂甙作為製備治療抗肝纖維化藥物之應用。
專利摘要
本發明的目的是提供一種抗肝纖維化的積雪草三萜皂甙，及其該積雪草三萜皂甙的製備方法。本發明製備方法所得積雪草三萜皂甙作為製備治療抗肝纖維化藥物之應用。我們利用低沸點系統溶劑提取法從積雪草中提取的積雪草三萜皂甙純度經薄板層析和高效液相色譜分析，純度可達90％。積雪草苷滴丸對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化有明顯的阻斷作用。從而努力實現積雪草三萜皂甙治療抗肝纖維化中成藥的商品化，以便使積雪草能以療效更加確切可靠、服用更加方便以及副作用更少來造福與廣大患者。
文檔編號A61P1/00GK1990500SQ200510121172
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日
發明者楊光, 譚家駒, 陳陽, 司建華, 胡維維, 鍾銳興 申請人:楊光, 譚家駒, 陳陽, 司建華, 胡維維, 鍾銳興導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan