一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法
2023-11-04 11:08:27 1
專利名稱：一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法
技術領域：
本發明屬生物晶片基片的製備領域，特別是涉及一種環氧基修飾的生物晶片基片 的製備方法。
背景技術：
生物晶片技術作為一種可以進行高通量多樣品平行分析的重要工具，已經開始廣 泛應用於基因組學研究、單核苷酸多態性分析、臨床醫學檢驗等方面。它將大量的生物大分 子探針、基因片段、寡聚核苷酸或蛋白質等按特定方式排列在特殊載體的固定位置上，在特 定條件下與待檢樣品進行作用，通過精密的掃描儀器進行記錄、檢測、分析，具有自動化程 度高、檢測目的分子數量較多、高通量等優點。生物晶片一般來說選擇經過相應處理的矽片、玻璃片、金屬片、塑料片或聚丙烯 膜、硝酸纖維素膜等作為載體。玻璃片由於具有廉價、表面光滑、低螢光背景及性能穩定等 優點，已經被廣泛應用於DNA和蛋白晶片微陣列的製作。要使探針固定在玻璃片表面，必須 先對玻璃片表面進行物理化學修飾。目前玻璃片表面化學修飾的方法很多，大致可分為二 維表面修飾和三維表面修飾兩類。以玻璃片為載體的二維表面修飾有氨基修飾、醛基修飾、巰基修飾及聚賴氨酸修 飾等，這類載體大部分通過一些分子間親和力或共價鍵把基因或蛋白探針固定在其表面， 這種方法成本較低、便於製備、重複性好、螢光背景相對較低。但是仍存在一定缺陷，如探針 固定量較小、表面均一性差、點樣點不夠規整以及表面官能團與探針之間發生非特異性交 互作用使玻璃片背景增高等問題。三維表面修飾是在玻璃片表面包一層凝膠或樹突狀多聚 物，然後再引入活性基團，從而在玻璃片表面形成三維立體結構。由於三維多孔結構，載體 表面與探針接觸面積大大增加，從而固定量也增加，提高了固定效率；另外，凝膠內溼潤微 環境使固定在上面的蛋白質溶液不易蒸發，從而保持了蛋白的活性。但是由於這些納米級 的多孔材料結構較為複雜，使得微陣列上的各種生物大分子探針間的距離控制較為困難， 探針及多孔材料之間的交互作用因此增強，導致檢測時的背景增高；此外，這些大分子多孔 材料的使用給微陣列的後續洗脫也帶來了問題。因此有良好的生物分子結合能力和表面質 量高、背景低、信號強度高的生物晶片基片的發明勢在必行。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法， 該製備方法簡單，成本低，適合於工業化生產；所得基片背景低、表面均一、點樣點比較規 整、結合力強，大大提高了固定效率，它具有較高荷載和結合蛋白質分子的能力，是一類較 新的蛋白質微陣列載體。本發明的一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，包括(1)高硼矽玻璃片表面處理將超聲處理過的高硼矽玻璃片浸泡在濃硫酸、過氧 化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，80 130°C下放置15 30分鐘，冷卻、超純水洗衝洗後浸泡於濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1)混合溶液中3 24小時，超純水 清洗3 5次，110 140°C烘乾15 30分鐘；(2)環氧基矽烷偶聯劑溶液的配製配製含1 3vol % GPTMS, 1 3vol %冰醋酸 的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60 80°C，回流1 2小時，降至室溫，整個過 程在避光條件下進行；(3)環氧基修飾調節上述矽烷偶聯劑溶液的PH = 7，磁力攪拌3 5分鐘；迅速 加入經表面過處理後的高硼矽玻璃片，在25 30°C，相對溼度為30 50%恆溫恆溼箱中 放置2 24小時，取出後先用無水乙醇清洗，然後再用超純水衝洗，110 140°C烘乾15 30分鐘，即得環氧基修飾的生物晶片基片。所述步驟(1)中的高硼矽玻璃片外形尺寸為25. Omm士0. 2_X 75. 6mm士0. 2_、 厚度為1.0mm士0. 02mm，其優勢在於「零」螢光背景、表面被拋光達到了原子平整的程度 (士20埃)、玻璃片間差異係數(CV) < 10%。所述步驟(1)中的超聲是在超純水中超聲5 10分鐘。所述步驟(2)中環氧基矽烷偶聯劑溶液的配製取99.8%無水乙醇77.6ml， GPTMS2. 4ml，冰醋酸2. 4ml加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小 時，然後降至室溫。所述步驟(2)中環氧基矽烷偶聯劑溶液的配製取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋 酸加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到80°C，在磁力攪拌下回流1小時，然後降至室溫。所述步驟(3)中使用濃氨水調節矽烷偶聯劑溶液的pH。有益效果(1)本發明所提供的生物晶片基片的製備方法簡單易行，不僅可以用於製備環氧 基修飾的生物晶片基片，同時也可以用於氨基修飾的生物晶片基片的製備；(2)本發明所製備的生物晶片基片，由於表面環氧基的活性較強，提高了基片結合 氨基修飾的DNA探針和蛋白探針的能力，從而降低了在製備生物晶片過程中DNA探針和蛋 白探針的點樣濃度，最終降低了生物晶片的成本，推動了生物晶片產業的進一步發展；(3)本發明所得的生物晶片基片背景低、表面均一、點樣點比較規整、信號強度達 6萬左右遠高於普通氨基片、醛基片等，不僅解決了普通氨基片和普通醛基片對氨基修飾的 核酸探針固定弱或固定不上的問題，大大提高了固定效率，而且它具有較高荷載和結合蛋 白質分子的能力，是一類較新的蛋白質微陣列載體，其表面的環氧基活性很強，不但可以和 氨基反應，還可以和蛋白質表面的其他集團如羧基、巰基、羥基等反應，如圖1和2所示；本 發明的環氧基片其點的變異度較小，沒有拖尾現象，點較圓潤，背景較低，是一種理想的制 備生物晶片的基片；(4)本發明所得的生物晶片基片表面具有牢固的特異性結合點，能夠廣泛應用於 DNA微陣列和蛋白微陣列的載體。
圖1環氧基與氨基修飾的DNA分子的反應機理2環氧基與蛋白質表面活性基團的反應機理3環氧基片點樣試驗中點樣矩陣示意圖
圖4環氧基片點樣後的螢光掃描圖片。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1環氧基生物晶片基片的製備(1)分別量取99. 8%無水乙醇77. 6ml, GPTMS2. 4ml，冰醋酸2. 4ml加入到三口燒 瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小時，然後降至室溫，整個過程在避光條件 下進行。(2)將硼矽玻璃片放入裝有超純水的染色缸中超聲10分鐘，超純水衝洗兩次，然 後浸泡於濃硫酸、過氧化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，在130°C的鼓風 乾燥箱中放置15分鐘，冷卻，用超純水衝洗3次；然後在濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1) 混合溶液中浸泡3小時，超純水清洗3次，110°C烘乾30分鐘，冷卻至室溫。(3)在配製好的矽烷偶聯劑溶液中加入濃氨水，調節溶液pH = 7，在避光條件下磁 力攪拌5分鐘，將經過表面處理的硼矽玻璃片放入環氧基矽烷偶聯劑溶液中，然後放入恆 溫恆溼箱中，相對溼度控制在50 %，溫度設定為30°C，分別放置2、5、8、10、15、20、24小時， 取出後用無水乙醇衝洗3次，超純水衝洗3次，110°C烘乾30分鐘即得到環氧基基片。此實施例中所得到的表面處理過的高硼矽玻璃片和環氧基基片分別用原子力顯 微鏡進行了表面表徵。實施例2環氧基生物晶片基片的製備(1)分別量取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋酸加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到 80°C，在磁力攪拌下回流1小時，然後降至室溫，整個過程在避光條件下進行。(2)首先硼矽玻璃片放入染色缸中在超純水中超聲5分鐘，超純水衝洗3次後浸 泡於濃硫酸、過氧化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，80°C放置30分鐘，冷 卻，超純水清洗3次，然後浸泡於濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1)混合溶液中24小時，超 純水清洗5次後140°C烘乾15分鐘。(3)在配製好的矽烷偶聯劑溶液中加入濃氨水，調節溶液pH = 7，在避光條件下磁 力攪拌3分鐘，將經過表面處理的硼矽玻璃片放入環氧基矽烷偶聯劑溶液中，然後放入恆 溫恆溼箱中，相對溼度控制在30 %，溫度設定為25 °C，放置2、5、8、15、20、24小時，取出後用 無水乙醇清洗3次，超純水清洗3次，140°C烘乾15分鐘後即得到環氧基片。實施例3環氧基生物晶片基片固定能力的檢測本實施例所用到的環氧基基片是按實施例1所述的方法製備的，本實施例是通過 Arrayit SpotBot 2點樣儀對環氧基片進行點樣試驗，點樣矩陣設計示意圖如圖3所示， 然後再通過Axon GenePix 4000B :Cy3PMT600，PowerlOO掃描儀檢測其螢光信號強度來反映環氧基片的固定能力，具體操作如下(1)準備點樣樣本a.室溫下，將DNA探針以0. 05 μ M、0. 1 μ M、0. 5 μ M、1 μ M的濃度分別到50 % DMS0/50%H20 的緩衝液中。將抗體探針以 0. 5μ g/μ 1、1μ g/μ 1、2. 5μ g/μ 1、5μ g/μ 1 的 濃度分別到20%甘油/80% H2O的緩衝液中； b.將樣本根據矩陣設計示意圖轉移到96孔板或384孔板中，輕敲微孔板使液體流 至孔底，將玻片整齊擺放在點陣儀底盤上；c.啟動點陣儀，自上而下在基片的右邊點陣5個1號緩衝液5X4的陣列到抽選 的基片上，在基片的左邊點陣5個2號緩衝液5X4的陣列到擺放好的基片上。溫度控制在 25 °C室溫，溼度控制在70%左右。(2)探針與環氧基的結合點樣後，將晶片放入晶片盒中，在37°C恆溫恆溼箱中靜 止24小時。(3)洗片a.製備洗滌液 1 (2xSSC/0. 2 % SDS)，洗滌液 2 (IxSSC)；b.將晶片置於晶片染色缸中，浸泡在洗滌液1中，室溫下輕輕地放下、提起晶片15 下；將晶片轉移到盛有洗滌液2的染色皿中，室溫下輕輕地放入、提起晶片15下；c.移出染色缸。用去離子水徹底衝洗，衝洗次數不少於2次；用離心法(200Xg for 10s)乾燥晶片。(4)掃描a.將一片樣本放入掃描儀中，通過專用掃描儀軟體將光電倍增管強度調整至 Cy3/PMT600, PowerlOO,點擊啟動按鈕，開始粗掃樣本，得到掃描圖片如圖4所示；b.細掃信號最佳的2個5X4蛋白陣列、2個5X4DNA陣列。讀取Cy3背景信號中 值、點信號中值及SD值讀數，並計算其差異係數CV值和信噪比S/N值，如表1所示；c.結束掃描，取出樣本。本實施例在點樣的過程中同時放入普通氨基片、醛基片、瓊脂糖片以及 ThemoFisher環氧基片作為對比。表1環氧基片掃描數據DNA 探針 蛋白探針
權利要求
一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，包括(1)高硼矽玻璃片表面處理將超聲處理過的高硼矽玻璃片浸泡在體積比為4∶1∶20的濃硫酸、過氧化氫和超純水的混合液中，80～130℃下放置15～30分鐘，冷卻、超純水洗衝洗後浸泡於體積比為1∶1的濃鹽酸和乙醇混合溶液中3～24小時，超純水清洗3～5次，110～140℃烘乾15～30分鐘；(2)環氧基矽烷偶聯劑溶液的配製配製含1～3vol％GPTMS、1～3vol％冰醋酸的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60～80℃，回流1～2小時，降至室溫，整個過程在避光條件下進行；(3)調節上述矽烷偶聯劑溶液的pH＝7，磁力攪拌3～5分鐘；迅速加入經表面過處理後的高硼矽玻璃片，在25～30℃，相對溼度為30～50％恆溫恆溼箱中放置2～24小時，取出後先用無水乙醇清洗，然後再用超純水衝洗，110～140℃烘乾15～30分鐘，即得環氧基修飾的生物晶片基片。
2.根據權利要求1所述一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，其特徵在於 所述步驟(1)中的高硼矽玻璃片外形尺寸為25. Omm士0.2mmX75. 6mm士0.2mm、厚度為 1. Omm士0. 02mmo
3.根據權利要求1所述一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，其特徵在於所 述步驟(1)中的超聲是在超純水中超聲5 10分鐘。
4.根據權利要求1所述一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，其特徵在於所 述步驟⑵中環氧基矽烷偶聯劑溶液的配製取99. 8%無水乙醇77. 6ml, GPTMS2. 4ml，冰 醋酸2. 4ml加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小時，然後降至室
5.根據權利要求1所述一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，其特徵在於所 述步驟(2)中環氧基矽烷偶聯劑溶液的配製取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋酸加入到三 口燒瓶中，用油浴加熱到80°C，在磁力攪拌下回流1小時，然後降至室溫。
6.根據權利要求1所述一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，其特徵在於所 述步驟(3)中使用濃氨水調節矽烷偶聯劑溶液的pH。
全文摘要
本發明涉及一種環氧基修飾的生物晶片基片的製備方法，包括(1)將超聲處理過的高硼矽玻璃片浸泡在濃硫酸、過氧化氫和超純水的混合液中，80～130℃下放置15～30分鐘，冷卻、衝洗後浸泡於濃鹽酸和乙醇混合溶液中，清洗，烘乾；(2)配製含GPTMS、冰醋酸的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60～80℃，回流；(3)調節矽烷偶聯劑溶液的pH＝7，攪拌；迅速加入經表面過處理後的高硼矽玻璃片，放置，清洗，烘乾。本發明的方法簡單，成本低，適合於工業化生產；所得基片背景低、表面均一、點樣點比較規整、結合力強，大大提高了固定效率，它具有較高荷載和結合蛋白質分子的能力，是一類較新的蛋白質微陣列載體。
文檔編號C12Q1/68GK101880712SQ201010167800
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者張青紅, 李耀剛, 王宏志, 馬董雲 申請人:東華大學