微生物活菌組合物及其製備方法
2023-11-05 00:08:37 1
專利名稱：微生物活菌組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種利用已知的酪酸梭菌、雙歧桿菌活菌作為有效成份，調節腸道功能及增強體液免疫力的組合物及其製備方法。
在正常人的腸道中生存著大量微生物，細菌總數約100萬億個，微生物間相互作用形成腸道菌群並保持著微生態平衡。在受到飲食、藥物、微生物、氣候及宿主本身生理狀況發生劇烈變動的情況下，腸道菌群平衡遭到破壞，致病菌大量繁殖，產生大量的有害物質，有益菌的生長受到抑制，從而導致腸道功能紊亂。尤其是自五十年代使用抗生素以來，雖然抗生素在醫學領域中起了很大的作用，然而隨著時間的推移，抗生素帶來的憂慮也越來越明顯，長期應用抗生素所引起抗藥菌株的產生、腸道菌群失調、抗生素相關性腹瀉、二重感染已成為目前臨床上難以解決的一大問題。
微生態製劑是一種口服非致病性活菌製劑，它能改進腸道細菌的平衡，對人或動物產生有益的作用，國外早在30年前就已進入實際應用階段，至今這門科學發展迅速，日本、德國、美國、法國、義大利、荷蘭和丹麥等國已都有產品投放市場。我國近年來也陸續出現了一些產品。
目前用於研製生態製劑的細菌，主要有雙歧桿菌、乳桿菌、枯草桿菌、腸球菌、大腸桿菌、酵母菌、臘樣芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、棒狀桿菌、類桿菌及表皮葡萄球菌等。其中以雙歧桿菌應用最廣，這與雙歧桿菌是人體內微生物主要成員有關，它是人類大腸中的優勢菌，對人體有營養和保護作用，對腸內腐敗菌、食物中毒菌、病原菌等有抑制作用，菌群失調的恢復主要是雙歧桿菌的恢復，雙歧桿菌製劑可調整腸道菌群微生態平衡。雙歧桿菌是Orla-Jensen1924年發現，並記載於Peter H.A Sneath主編1986年出版的《伯傑氏系統細菌學手冊》(Berger’s Manual of Systematic Bacteriology)第二卷第1418頁。本菌存在於土壤和糞便中，其菌種分離方法是將糞便按1∶9(重量、體積比)加入無菌生理鹽水，振蕩混勻後接種於SSCM培養基，37℃厭氧培養48小時，然後用接種環劃線接種於雙歧桿菌選擇性培養基表面，37℃厭氧培養72小時；生長培養特性厭氧條件下生長良好，菌落灰白色，呈露珠樣，針帽大小，邊緣整齊，突起，表面光滑，為厭氧性細菌，鏡檢革蘭氏染色陽性，呈直形或彎曲狀，兩端著色較深，可出現「Y」、「V」型的排列形態，不形成芽胞。據報導日本至今雙歧桿菌製劑就有70餘種。這些生態製劑在目前主要用於治療腹瀉、調整腸道菌群。國內已有用枯草桿菌活菌製劑預防和控制燒傷創面的感染；用乳桿菌、腸球菌製劑降低膽固醇等。另還有幾種雙歧桿菌活菌製劑，如口服雙歧桿菌活菌製劑商品名為回春生或麗珠腸樂，是由青春型雙歧桿菌製備而成的活菌製劑；如商品名為培菲康，由兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌組成的活菌製劑等。
酪酸梭菌是1933年由日本千葉醫科大學宮入近治首先發現報告，並記載於Peter H.A Sneath主編1986年出版的《伯傑氏系統細菌學手冊》(Berger’s Manual of Systematic Bacteriology)第二卷第1160頁。本菌存在於土壤、動物和人的腸道中，可從土壤、動物和人的糞便中分離；其分離方法是取糞便，按1∶9(重量、體積比)比例加入無菌生理鹽水，振蕩混勻後接種於SSCM培養基，37℃厭氧培養24小時，然後用接種環劃線接種於酪酸梭菌選擇性培養基表面，37℃厭氧培養48小時；培養特徵及菌體形態，生長培養特性厭氧條件下生長良好，菌落為灰白色，大小約1-6mm，邊緣不整齊，呈油煎蛋樣，中心有突起，表面不光滑，為厭氧性細菌，鏡檢革蘭氏染色呈陽性，菌體呈直杆形，兩端較圓，大多數菌體中央有芽胞。酪酸梭菌是人體腸道內暫住非定植性正常菌群，除能調整和補充正常菌群外，能與雙歧桿菌、乳酸菌等腸內的有益菌共生，並促使其增殖和發育，抑制有害菌和腐敗菌的生長和繁殖。它能減少胺、吲哚待物質的產生；產生B組維生素、維生素K、澱粉酶、酪酸醋酸和乳酸待代謝產物；代謝產物酪酸為人體腸上皮細胞新陳代謝的主要能量來源，可促進腸上皮組織的再生和修復；酪酸梭菌為梭狀芽胞桿菌，在胃腸內不受胃酸、膽汁等的影響，對多種抗生素有較強的耐受性，可與抗生素共用。
近半個世紀以來，酪酸梭菌製劑在日本、韓國、臺灣等亞洲國家和地區被廣泛應用。可調整腸道菌群微生態平衡、具有增殖雙歧桿菌的作用。
但將酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌混合的製劑，利用酪酸梭菌對雙歧桿菌的增殖作用共同發揮其有益作用的製劑尚未見文獻報導。
本發明的目的是為了提供一種將酪酸梭菌和雙歧桿菌聯合起來製成一種新的微生態製劑，利用酪酸梭菌增殖雙歧桿菌的作用，更為有效地發揮複合菌製劑調節人體腸道菌群及提高人體體液免疫力的作用，可防治胃腸疾病，改善胃腸功能，且無毒無副作用的微生物活菌組合物。
本發明的目的可通過如下措施來實現一種微生物活菌組合物它包括酪酸梭菌活菌菌粉、雙歧桿菌活菌菌粉和載體；其中以重量計每克組合物中含酪酸梭菌數為105-1010個，含雙歧桿菌活菌數為105-1010個。
本發明的目的還可通過如下措施來實現一種微生物活菌組合物的製備方法先培養酪酸梭菌和雙歧桿菌，再從培養物中分離菌體，將菌體按體積比1∶(0.8-1.5)加入乳品，將乳品菌液在低溫真空下凍幹得到菌粉；再按每克組合物中分別含酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌數105-1010個稱取菌粉，然後按常規製劑比例加入載體至1克，並按常規製劑方法製劑即可。
酪酸梭菌和雙歧桿菌的培養方式可採用液體培養；上述兩種菌體的培養對培養基中的營養源並無特殊的規定，可使培養基中含有常用於微生物培養的碳源、氮源及其它營養源。其中碳源可為澱粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可為腖、大豆粉、肉膏、米糖、麥皮、尿素、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽，以及其它有機或無機含氮化合物。至於其它營養源則可適當添加一些無機鹽類。對溫度、時間等培養條件並無嚴格限制，以適於使用菌的生長為準，並以選擇酪酸梭菌、雙歧桿菌產量最高的條件為好。例如，培養基的PH範圍可為4-9，尤以接近中性為好。
本發明相比現有技術具有如下優點1、本發明首次將酪酸梭菌和雙歧桿菌聯合製成新的微生態製劑，利用酪酸梭菌除能調整和補充正常菌群外，還能與雙歧桿菌、乳酸菌等腸內的有益菌共生，並促使其增殖和發育功能，來增殖雙歧桿菌，使這一雙菌製劑更能有效地發揮其調節人體腸道群及提高人體體液免疫力的作用。本發明的防治胃腸功能失調及改善胃腸功能、提高人體體液免疫力的效果經衛生部食品衛生監督檢驗所對小白鼠進行的試驗證實。
2、本發明的組合物急性毒性，經小白鼠口服大於10000mg/kg，無任何中毒症狀及死亡情況。
3、本發明組合物的穩定性在常溫下留樣考察一年，穩定性良好。
本發明還將結合實施例作進一步詳述實施例一一種微生物活菌組合物的製備方法包括下述步驟(1)將從成人糞便和嬰兒糞便中分離出的酪酸梭菌和嬰兒型雙歧桿菌菌種接種於庖肉培養基，在38℃下，將酪酸梭菌和嬰兒型雙歧桿菌分別培養10小時和30小時；(2)將(1)接種培養後的菌種進行傳種；其中酪酸梭菌傳種用GAM(GAM Broth「Nissui」日水製藥株式會社)；雙歧桿菌傳種用Bf液體培養基；均在38℃下厭氧培養，酪酸梭菌培養12小時，雙歧桿菌培養36小時；(3)按2.0％的接種比例，酪酸梭菌和雙歧桿菌分別用LDS培養基和Bf液體培養基，在36℃下厭氧增菌培養24小時；(4)將(3)增菌培養的菌體培養液(應留樣計數)進行14000rpm離心分離得到菌體沉澱，將菌體按體積比1∶1.1加入脫脂牛奶並混勻；牛奶菌液留樣計數，測定總量，然後將牛奶菌液放入-70℃低溫冰箱預凍14小時；(5)將預凍的牛奶菌液在低溫真空下凍幹得到菌粉；(6)在酪酸梭菌菌粉和嬰兒型雙歧桿菌菌粉中按常規製劑比例加入澱粉、蔗糖，並按常規製劑方法製成片劑，每克片劑中含酪酸梭菌活菌數為107個，嬰兒型雙歧桿菌活菌數為10個，將活菌數計數後得到的菌粉重量稱重後再按每克片劑的餘量加入澱粉和蔗糖即可得到成品。
所述的皰肉培養基的製備方法是以重量份計將牛肉水500份、酪素水解液500份混合過濾後，煮沸10分鐘，並調節其PH值為7.8，然後再加入明膠5份、瓊脂份1.1份、葡萄糖6份，溶解、調節PH值為8，並滅菌即可製成。
所述的Bf液體培養基的製備方法是按重量份計在1000份西紅柿汁中加入0.5份澱粉、14份蛋白腖、5份酵母粉、25份葡萄糖、5份氯化鈉、0.8份吐溫-80，依次加熱溶解，並調節PH值為6，滅菌即製成。
所述的LDS培養基的製備方法是按重量份在1000份蒸鎦水中加入17份腖、4份酵母粉、4份澱粉、12份磷酸氫二鈉、12份硫代乙醇酸鈉，依次加熱溶解後，調節其PH值為8，滅菌即可製成。
實施例二一種微生物活菌組合物的製備方法與例一同；但存在下述不同將酪酸梭菌活菌和青春型雙歧桿菌活菌數均確定為每克製劑含1010個而得到菌粉的重量，然後再加入硬脂酸鎂和抗壞血酸鈉至1克製劑，硬脂酸鎂與抗壞血酸鈉的重量比按常規製劑比例，將製劑製成膠囊。
實施例三一種微生物活菌組合物的製備方法與例一同；但存在下述不同將酪酸梭菌活菌和雙歧雙歧桿菌活菌數均確定為每克製劑含9×105個而得到菌粉的重量，然後再加入澱粉和維生素B、D至1克製劑，澱粉和維生素B、D的重量比按常規製劑比例，將製劑製成微膠囊。
實施例四一種微生物活菌組合物的製備方法與例一同；但存在下述不同將酪酸稜菌活菌和長雙歧桿菌活菌數均確定為每克製劑含6×106個而得到菌粉的重量，然後再加入乳糖、乳酸鈣和酪蛋白酸鈉至1克製劑，乳糖、乳酸鈣和酪蛋白酸鈉的重量比按常規製劑比例，將製劑製成粉劑。
權利要求
1.一種微生物活菌組合物，其特徵在於它包括酪酸梭菌活菌菌粉、雙歧桿菌活菌菌粉和載體；其中以重量計每克組合物中含酪酸梭菌數為105-1010個，含雙歧桿菌活菌數為105-1010個。
2.如權利要求1所述的微生物活菌組合物，其特徵在於在該組合物中還可添加維生素和/或微量元素和/或甜味劑。
3.一種權利要求1所述的微生物活菌組合物的製備方法，其特徵在於先培養酪酸梭菌和雙歧桿菌，再從培養物中分離菌體，將菌體按體積比1∶(0.8-1.5)加入乳品，將乳品菌液在低溫真空下凍幹得到菌粉；再按每克組合物中分別含酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌數105-1010個稱取菌粉，然後按常規製劑比例加入載體至1克，並按常規製劑方法製劑即可。
全文摘要
本發明涉及一種微生物活菌組合物,該組合物是先培養酪酸梭菌和雙歧桿菌,再從培養物中分離菌體,將菌體按體積比加入乳品,將乳品菌液在低溫真空下凍幹得到菌粉;再按每克組合物中分別含酪酸梭菌和雙歧桿菌活菌數稱取菌粉,然後按常規製劑比例加入載體至1克,並按常規製劑方法製劑即可;本發明將酪酸梭菌和雙歧桿菌聯合起來製成一種新的微生態製劑,利用酪酸梭菌增殖雙歧桿菌的作用,更為有效地發揮複合菌製劑調節人體腸道菌群及提高人體體液免疫力的作用,可防治胃腸疾病,改善胃腸功能,且無毒無副作用。
文檔編號C12N1/20GK1252439SQ9812376
公開日2000年5月10日 申請日期1998年10月27日 優先權日1998年10月27日
發明者傅思武, 王棣, 孟筱琦 申請人:衛生部蘭州生物製品研究所