一種通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法
2023-11-04 08:59:57 4
專利名稱：一種通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法
技術領域：
本發明涉及植物轉基因工程領域，具體地，涉及一種通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法。
背景技術：
小麥是禾本科(Gramineae)小麥屬(Tritucum) —年生或多年生草本植物，是世界上廣泛種植、總產量僅次於玉米的重要糧食作物。目前小麥新品種的培育依然主要靠常規育種。由於常規雜交育種周期長、手段單一、種間雜交困難，而且效率較低、預見性差，致使雜交後代遺傳背景狹窄、選育難度增大，使小麥育種水平難有突破性提高，育種進展緩慢。利用現代基因工程技術進行小麥的品種改良是當前小麥育種的一個新方向。其主要手段是指利用生物及物理化學等手段，將外源基因導入植物細胞以獲得轉基因植物的植物轉基因技術。自1983年Zambryski獲得世界上第一株轉基因植株以來，植物轉基因技術迅猛發展，這也使得轉基因工程技術育種成為了可能。它可以打破生殖隔離，使得不同物種間遺傳交流成為可能，為拓寬植物可利用基因庫創造了條件，彌補了常規雜交育種的不足， 加速了作物遺傳育種的發展。目前，幾乎所有的作物都開展了轉基因技術研究，已發展的方法有以原生質體為受體的PEG法和電激法、離子束介導法、花粉管通道法、基因槍法及農桿菌介導法等。其中， 以農桿菌作為媒介的方法由於其簡單易行，不需昂貴的設備，成本低，轉化頻率高，拷貝數少，遺傳表達穩定性較好等優點，越來越受到科研工作者的青睞。雙子葉植物是農桿菌的天然寄主，利用農桿菌Ti質粒介導已經將一些外源基因轉入雙子葉植物，並建立了多種雙子葉植物的基因轉移體系。但由於單子葉植物不是農桿菌的天然寄主，加之單子葉植物的外植體再生能力低下、感受態細胞缺乏和遺傳轉化不穩定等，限制了這一方法在禾本科作物上的應用。近年來對小麥轉基因的研究發展很快，也取得了一定的成就，但是與水稻、玉米等禾穀類作物以及雙子葉植物相比，仍然存在較大的差距。小麥與其他作物相比進行轉基因育種的特殊難點主要表現在缺乏一種高效的基因導入方法。其次，原生質體培養和植株再生只限於個別基因型，且再生植株的遺傳穩定性尚不清楚。而且小麥本身是異源六倍體， 其基因組較大並且複雜，導入外源基因沉默與修飾現象嚴重。幼穗作為小麥遺傳轉化中優良的外植體材料，其愈傷組織誘導率和誘導質量均優於幼胚。然而，幼穗的遺傳轉化也需經過組織培養，這就不可避免地要經過由於單一的轉化細胞而進行組織培養獲得再生植株的過程。為了避免此過程，將此法結合活體轉化便應運而生。農桿菌介導的浸染幼穗轉化方法是近年發展起來的一種簡便、快速、高效、重複性好、穩定性高的非組織培養轉基因方法。其最大的優點在於能直接獲得轉化的種子，避開了組織培養和繼代培養，排除了組織培養中因體細胞變異給目的基因的正確表達及分子遺傳學研究帶來的極為不利的遺傳背景，同時為一些不易建立遺傳再生體系的作物類型提供了基因轉移的新途徑。
何道一等將農桿菌滴入小麥小花中進行轉化，通過PCR和Southern雜交進行分子水平鑑定，最終獲得轉化植株效率為2. 0% 3. 2%。hie等Q009)用農桿菌浸泡幼穗的方法成功轉化了北美硬紅春小麥Crocus，並能穩定表達外源基因。轉化效率為 0.44% 6.8%。然而葉興國等0011)參考^116等Q009)的方法對我國北方冬麥區輪選 987、科農199等多個當前主導冬小麥品種進行農桿菌侵染轉化均未獲得轉化籽粒或植株， 說明hie等Q009)的方法可能並不適合對我國當前主導冬小麥品種的遺傳轉化，需要依據我國小麥的特性進行技術改良。而且，目前利用農桿菌介導的幼穗法獲得轉基因小麥的轉化效率也並不理想，並且所用品種主要是春小麥。因此，迫切需要針對我國當前主導小麥品種的一種穩定、高效、簡便的獲得轉基因小麥的方法
發明內容
本發明的目的是提供一種通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法。根據本發明的通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，包括以下步驟1)培養包含載有目的基因的表達載體的農桿菌菌株，用浸染培養基懸浮菌體，其中，用YEB培養基過夜培養到OD6tltl為1. 5 2. 0，離心，沉澱菌體後用浸染培養基懸浮菌體至0D_ = 0. 6 0. 8，所述YEB培養基為，酵母提取物lg/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白腖 5g/L，蔗糖 5g/L，MgS04 · 7H20 0. 5g/L，ρΗ7· 0 ；2)選取溫室或田間種植的抽穗期小麥進行轉化，去掉幼穗頂端和末端未發育好的小穗，剪去小麥生長錐頂端約1/3，將小麥幼穗浸入含農桿菌的浸染培養基中1 2min，浸染後用玻璃紙套袋保溼，同時防止植株間雜交。選擇幼穗作為轉化受體在於能夠直接獲得轉化的種子，將小穗頂端剪去約1/3可以使菌液與幼穗小花中的雌蕊充分接觸，提高轉化成功率，同時保留有足夠的穎片也保證了籽粒不會脫落。根據本發明的通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其中，所述農桿菌菌株為 EHA105 或 GV3101。根據本發明的通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其中，所述載體為 PBI121。根據本發明的通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其中，所述浸染培養基為以MS為基本培養基，添加MES buffer 0. 5mM，乙醯丁香酮(AQ 200 μ M和表面活性劑 Silwet L-77 0. 04% 0. 06%, ρΗ5. 8 6. 0。根據本發明的通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其中，所述小麥為冬小麥品種冀麥38或周麥16。根據本發明的所述通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其中，所述抽穗期小麥為小麥生長錐已部分露出且尚未完全從鞘中抽出時的小麥幼穗。用農桿菌轉化擬南芥的研究表明T-DNA的插入是一種異源插入，這也就表明轉化可能發生在花發育的晚期且在胚充分發育完成之前，而在擬南芥的轉化方面，已獲得的遺傳轉化植株大都是在開花前5-10d進行農桿菌浸染的。經過多次試驗，我們選擇抽穗期的小麥幼穗，在其生長錐已有部分露出且尚未完全從鞘中抽出時進行農桿菌轉化，不僅獲得了轉基因植株，而且大幅度提高了轉化效率。
本發明用農桿菌浸染小麥幼穗，成功地將外源基因轉入冬小麥中，不需要經過原生質體培養、細胞培養、組織培養以及植株再生等遺傳轉化過程，從而避免了其它方法的周期較長、體細胞變異可能性大、愈傷組織胚再生能力差等缺點。本發明操作簡單方便、節省人力物力，並且轉化效率高，可達26. 3% 82. 3%，浸染後的植株能夠正常生長、結實，這對於小麥基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實踐具有重要的意義。
圖 1 為質粒 pBI121-0sDREB2. 2 的 T-DNA 區域。圖2為浸染前的小麥。圖3為獲得的轉基因植株的成熟穗部。圖4為0sDREB2. 2轉基因植株Ttl代PCR檢測結果。1，DNA分子量標記；16，陽性質粒對照pBI121-0sDREB2. 2 ；17，陰性空載體對照pBI121 ； 15，未侵染野生型小麥品種植株； 14，PCR水；2-13，農桿菌轉化Ttl代籽粒植株。箭頭所指為陽性目的條帶。圖5為0sDREB2. 2轉基因植株T1代PCR檢測結果。1，DNA分子量標記；14，陽性質粒對照pBI121-0sDREB2. 2 ；15，陰性空載體對照pBI121 ； 13，未侵染野生型小麥品種植株； 12，PCR水；2，7-11，為分別來自不同Ttl代籽粒的T1代植株；3_4，5-6,為分別來自同一 Ttl代籽粒的不同T1代植株。箭頭所指為陽性目的條帶。
具體實施例方式實施例1農桿菌浸染幼穗獲得轉0sDREB2. 2轉錄因子基因小麥1.植物材料的準備將冀麥38、周麥16小麥品種種植於實驗室或大田，正常管理至開始抽穗。2.農桿菌的轉化1)分別挑取根癌農桿菌EHA105和GV3101單克隆於IOml的LB液體培養基(含相應抗生素Rif30mg/ml)中，28°C振蕩培養過夜。幻取過夜培養菌液2ml接種於50ml LB (含Rif30mg/ml)液體培養基中，28°C振蕩培養至OD6tltl為0. 6 0. 7。3)將菌液分裝至4個滅菌的IOml管中，冰浴lOmin。然後於4°C，5000rpm，離心 5min。去上清，沉澱用200μ1 20mM冰冷的CaCl2重懸，4°C，5000rpm，離心5min。沉澱用 200 μ 1 20mM冰冷的CaCl2再次重懸，按每管100 μ 1的體積分裝至8個預冷的1. 5ml離心管中。4)取重組質粒(pBI121_0sDREB2.幻5 μ 1分別與100 μ 1農桿菌感受態細胞 (ΕΗΑ105, GV3101)混勻，液氮速凍^iin後，立即置於37°C水浴中，溫育5min。其中，OsDREB2.2 (實驗室命名)，GenBank Acession No. AY064403 (Oryza sativa DREBlmRNA)，具有抗非生物逆境脅迫功能。5)加入Iml不含抗生素的LB液體培養基J8°C，150rpm，培養3h。4000rpm離心 30s，去大部分上清，留約IOOul菌液，重懸。6)將 100 μ 1 菌液全部塗於LB平板(30mg/ml Rif，100mg/ml Kan)，倒置培養。 2 3d後長出單菌落。
3.陽性克隆的鑑定挑取平板上長出的單菌落，接種於LB液體培養基(30mg/ml Rif，IOOmg/ ml Kan)中，觀°C振蕩培養過夜；小量提取質粒DNA，以質粒DNA為模板進行PCR擴增鑑定。根據pBI121載體上CaMV 35S啟動子序列設計上遊引物35S，根據基因序列設計下遊引物0s2.2-R，擴增片段496bp。將鑑定的陽性克隆保菌於_70°C冰箱中。所用引物序列為，35S:5，-GACGCACAATCCCACTATCC-3，(SEQ ID NO. 1) ；0s2. 2-R :5，-GGGACCAT ACATTGCCCTTGCC-3，(SEQ ID NO. 2)。4.農桿菌培養浸染小麥幼穗前3天從_70°C冰箱中取出含有目的基因的農桿菌，於含有相應抗生素的LB固體培養基上劃線，活化培養2天，然後從培養基上挑取單克隆加入2ml含有相應抗生素的YEB液體培養基中振蕩過夜培養，第二天加入適量YEB液體培養基繼續培養6 他。YEB培養基為，酵母提取物lg/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白腖5g/L，蔗糖5g/L， MgS04 · 7H20 0. 5g/L，調節 ρΗ7· 0 後滅菌。5.小麥的遺傳轉化當培養的農桿菌OD6tltl達到1. 5左右時，4500rpm離心15min收集菌體，棄上清，用浸染培養基重懸沉澱，使最後的0D_達到0. 6 0. 8。其中，所述浸染培養基為以MS為基本培養基，添加MES buffer 0. 5mM，乙醯丁香酮200 μ M和表面活性劑Silwet L-77 0.04% 0. 06%, ρΗ5. 8 6. 0。在小麥開花前4 7天，去掉幼穗頂端和末端未發育好的小穗，剪去小麥生長錐頂端約1/3，將已經修剪好的小麥幼穗(圖2、浸入農桿菌菌液中1 2min，然後用玻璃紙袋
套袋ο6.轉化後的小麥正常管理，收穫種子。種植後取葉片提取DNA進行PCR檢測獲得轉基因植株，檢測結果如圖4，轉基因植株如圖3。7.對第二代種子進行檢測，驗證目的基因是否已穩定遺傳。實施例2農桿菌浸染幼穗獲得轉0sDREB2. 2轉錄因子基因小麥的轉化率研究對實施例1所得植株及其第二代種子進行目的基因鑑定，研究目的基因轉化和遺傳情況，結果如表1。可以看出，按轉化株數統計周麥16的轉化率達92. 3%，冀麥38的轉化率達65. 5% ；按轉化籽粒數統計目的基因陽性率，周麥16為82. 3%，冀麥38為觀.3%。 對轉基因植株各自對應的T1代隨機抽樣進行檢測均檢測到陽性植株(圖幻，說明轉化的目的基因得到穩定遺傳。用本發明獲得的轉基因小麥轉化效率大大提高，並且獲得了較為滿意的遺傳穩定性。實施例3農桿菌浸染不同時期幼穗獲得轉0sDREB2. 2轉錄因子基因小麥用實施例1所述方法，在小麥幼穗抽穗期不同階段進行農桿菌浸染，結果如表2所示。從表2可知，在小麥幼穗未出鞘前進行浸染，小麥發育異常，不能結籽；在幼穗部分出鞘時進行浸染，小麥發育正常，結籽，並且可以獲得轉基因植株。表ITtl代轉基因植株檢測結果
權利要求
1.一種通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)培養包含載有目的基因的表達載體的農桿菌菌株，用浸染培養基懸浮菌體；2)選取抽穗期小麥進行轉化，去掉幼穗頂端和末端未發育好的小穗，剪去小麥小穗頂端1/3，將小麥幼穗浸入含農桿菌的浸染培養基中。
2.根據權利要求1所述通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其特徵在於，所述農桿菌菌株為EHA105或GV3101。
3.根據權利要求1所述通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其特徵在於，所述表達載體為PBI121。
4.根據權利要求1所述通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其特徵在於，所述小麥為冬小麥品種冀麥38或周麥16。
5.根據權利要求1所述通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其特徵在於，所述浸染培養基為以MS為基本培養基，添加MES緩衝液0. 5mM,乙醯丁香酮200 μ M和表面活性劑 Silwet L-77 0. 04%~ 0. 06%, ρΗ5. 8 6. 0。
6.根據權利要求1所述通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，其特徵在於，所述抽穗期小麥為小麥生長錐已部分露出且尚未完全從鞘中抽出時的小麥幼穗。
全文摘要
本發明涉及植物轉基因工程領域，具體地，涉及一種通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法。本發明的通過農桿菌浸染幼穗獲得轉基因小麥的方法，包括以下步驟1)培養包含載有目的基因的表達載體的農桿菌菌株，用浸染培養基懸浮菌體；2)選取抽穗期小麥進行轉化，去掉幼穗頂端和末端未發育好的小穗，剪去小麥小穗頂端約1/3，將小麥幼穗浸入含農桿菌的浸染培養基中。本發明操作簡單方便、節省人力物力，並且轉化效率高，可達26.3％～82.3％，浸染後的植株能夠正常生長、結實，這對於小麥基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實踐具有重要的意義。
文檔編號A01H5/00GK102559746SQ201110418620
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者劉桂茹, 張貴友, 楊學舉, 溫樹敏, 王維, 郎明林 申請人:河北農業大學