針對腸球菌和金黃色葡萄球菌具有殺傷活性的人結合分子及其應用的製作方法
2023-11-05 00:47:12 2
專利名稱：：針對腸球菌和金黃色葡萄球菌具有殺傷活性的人結合分子及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及藥物。特別的，本發明涉及腸球菌感染的診斷、預防和/或治療。
背景技術：
：腸球菌是腸球菌科(五^eracocMC^^)的革蘭氏陽性、兼性厭氧細菌。它們以前被分類為D組鏈球菌。腸球菌是在大部分人的腸內發現的，並且通常從廁所、尿和腹內和下肢感染部位中被分離。腸球菌(五"teracoccw)屬的細菌通常被認為是胃腸道的無害共生物，但在過去IO年內，它們已經成為醫院感染(醫院獲得性感染)的重要原因，這並不是因為毒力的提高，而是因為抗生素抗性。估計在美國每年出現800,000例腸球菌感染，這導致了大約5億美元的費用。為了感染宿主，腸球菌主要在黏膜表面上形成菌落。腸球菌是菌血症、手術傷口感染、尿路感染以及心內膜炎的病因。它們還與導致腹內膿腫的混合感染的固性厭氧細菌相關。大體上，存在大約17種腸球菌，其中糞腸球菌(EVferococct^1/^6^//5")禾口屎腸球菌(￡>/^0。0^^々ec/w7")似乎是在人糞便中最經常檢測到的。糞腸球菌(￡.々""//"引起了大部分的人腸球菌感染，通常佔臨床分離物的80-90%。屎腸球菌(五./"^/"附)被檢測到的頻率要少得多，然而因為其對抗菌藥多抗性的高發生率，因此是重要的。通常使用抗菌劑治療腸球菌感染，直到最近，才通過使用這些藥物使腸球菌感染被適當控制。然而，藥物抗性腸球菌株正在出現，並且對所有目前可利用抗生素都有抗性的菌株所引起的感染可能在不久的將來成為嚴重的問題。某些腸球菌已經獲得了對(3-內醯胺系抗生素(青黴素)以及許多氨基糖甙的固有抗性。在最近的二十年中，特別是甚至對抗生素萬古黴素都有抗性的腸球菌(^7teroco"w)毒性菌株(萬古黴素抗性腸球菌或VRE)已經在就醫患者的醫院感染中出現。儘管對開發新型抗生素有迫切的需要，但是主要的藥物公司4似乎已經對抗生素市場失去了興趣。在2002年，超過500種的II期臨床或III期臨床藥物開發中僅有5種是新型的抗生素。在過去6年中，僅10種抗生素被註冊，而且它們中僅2種沒有表現出與現有藥物的交叉反應(因此，不具有相同的藥物抗性特徵)。這種趨勢歸於多種因素新藥開發的成本，以及與針對高血壓、關節炎以及生活方式藥物例如陽痿的藥物相比，對感染藥物治療研究產出的回報相對教少。另一個起作用的因素是發現新靶點的困難，這進一步提高了開發成本。因此，迫切需要對(多藥物抗性)細菌感染的新型治療或預防檢測的研究以滿足這種迫近的保健危機。使用疫苗的主動免疫和使用免疫球蛋白的被動免疫是對經典小分子治療有希望的替代。現在，通過使用疫苗可以預防一些一度引起普遍疾病、殘疾和死亡的細菌疾病。這些疫苗基於弱化的(減毒)細菌或死細菌、細菌表面組分，或者基於滅活的毒素。疫苗所引起的免疫應答主要針對免疫原結構，即細菌上一定數目被免疫系統主動處理的蛋白質或糖結構。由於這些免疫原結構對生物體非常特異，因此疫苗需要包含該疫苗所需要防護的細菌所有變體的免疫原組分。結果，疫苗非常複雜，開發需要長時間並且昂貴。使得疫苗更加複雜的是"抗原置換(antigenreplacement)"現象。在血清學以及進而抗原上與疫苗所覆蓋菌株不同的新菌株流行時出現"抗原置換"現象。有醫院感染危險的人群的免疫狀態進一步使得疫苗設計複雜。這些患者自身就是健康狀態不好的，並且甚至可能是免疫受損(由於免疫抑制藥物的影響)，這導致了針對感染病原體的延遲或不充分的免疫。此外，除了某些遴選程序外，不可能及時對有危險的患者進行鑑定和接種疫苗，從而為他們提供充分的免疫保護免於感染。直接給藥治療性免疫球蛋白也被稱作被動免疫不需要患者的免疫應答，因此提供立即的保護。另外，被動免疫可以針對不是免疫原以及對生物體特異性較差的細菌結構。針對病原生物體的被動免疫基於來自人或非人供體的血清。然而，來自血液的產品具有潛在的健康風險，這種風險是與這些產品所固有相關的。另外，免疫球蛋白能夠表現出批次之間的變化，並且在意外大量暴露時有效性有限。充足產生的抗體不具有這些缺點，因此提供了替換來自血清的免疫球蛋白的機會。5本領域中，針對腸球菌抗原的鼠單克隆抗體是已知的(參見WO03/072607)。然而，鼠抗體被限制在體內使用，這是由於和為人給藥鼠抗體相關的問題，例如血清半衰期短，不能夠引起某些人效應物功能，以及誘發針對人體內鼠抗體(HAMA)的不期望顯著免疫應答。WO99/18996涉及腸球菌抗原和疫苗。WO99/18996還公開了針對從腸球菌分離的偶聯純化抗原的兔抗血清，以及這種抗血清的調理活性。儘管WO99/18996提及人抗體作為所需分子，然而其中所實際公開和運用的抗休是兔來源的，並且該文獻並未實際公開任何人抗體，也未公開其序列。考慮到它們在人體內的治療效果，因此仍需要針對腸球菌的人單克隆抗體。另外，本領域中存在對能夠殺傷更寬範圍細菌例如腸球菌和葡萄球菌的人抗體的需求。本發明提供了這些抗體，並且顯示它們能夠被用於藥物中，特別的用於腸球菌的診斷、預防和/或治療。圖l顯示了體內實驗的數據。在Y軸上，顯示了小鼠血液中的CFU/ml，而在X軸上則表示了各種抗體。除了以7.5mg/kg的量使用CR6016和CR6241外，以15mg/kg的量使用抗體。除了CR6043和CR6071夕卜，所有的抗體均具有如對照IgG顯著不同的中位數(與IgGl對照相比P<0.05)。發明描述本發明中使用下列術語的定義。定1胺基酸序列本文所使用的術語"胺基酸序列"指天然存在或合成的分子，並指肽、寡肽、多肽或蛋白質序列。結合分子6本文所使用的術語"結合分子"指完整免疫球蛋白包括單克隆抗體例如嵌合抗體、人源化抗體或人單克隆抗體，或者指包含免疫球蛋白片段的抗原結合區和/或可變區，其中所述免疫球蛋白片段同完整免疫球蛋白競爭與免疫球蛋白結合配偶體(如腸球菌)的特異性結合。無論結構如何，抗原結合片段與完整免疫球蛋白所識別相同的抗原結合。抗原結合片段可以包含肽或多肽，其中所述肽或多肽包含結合分子胺基酸序列中至少2個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少5個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少10個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少15個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少20個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少25個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少30個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少35個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少40個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少50個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少60個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少70個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少80個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少90個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少100個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少125個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少150個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少175個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，至少200個連續胺基酸殘基的胺基酸序列或者至少250個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。本文所使用的術語"結合分子"包括本領域中已知的所有免疫球蛋白類別以及亞類。根據它們重鏈保守區的胺基酸序列，結合分子可以被分成五類主要的完整抗體類別IgA、IgD、IgE、IgG禾nIgM，這些中的一些可以被進一步分成亞類(同種型)例如IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。抗原結合片段尤其包括Fab、F(ab，)、F(ab，)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、雙價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、二聚抗體、三聚抗體、四聚抗體、包含至少足以提供特異性抗原結合(多)肽的免疫球蛋白片段的(多)肽，等。可以合成生產或者通過對原始免疫球蛋白進行酶切或者化學切割而生產上述片段，或者可以通過重組DNA技術而對它們進行遺傳改造。生產方法是本領域中公知的，並被描述在例如抗體實驗室手冊(Antibodies:ALaboratoryManual),編輯E.Harlow和D,Lane(1988),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,通過參照將其併入7本文中。結合分子或者其抗原結合片段可以具有一個或者多個結合位點。如果存在超過一個的結合位點，則結合位點相互之間可以是相同的，或者它們可以是不同的。結合分子可以是裸結合分子或者未結合的結合分子，但也可以是免疫綴合物(immimoconjugate)的一部分。裸結合分子或未結合的結合分子是指沒有偶聯、可操作連接或者以其它方式物理或功能聯合效應物基團或標籤的結合分子，例如尤其是毒性物質、放射性底物、脂質體、酶。可以理解裸結合分子和未結合的結合分子不排除被穩定化、多聚化、人源化或者通過除聯合效應物成份或標籤以外的任何其它方式處理的結合分子。因此，其包括所有翻譯後修飾的裸結合分子或未結合的結合分子，包括在產生天然結合分子的細胞環境中由產生重組結合分子的細胞進行的修飾，以及在開始製備結合分子之後引入的修飾。當然，術語裸結合分子或未結合的結合分子不排除結合分子與效應細胞和/或分子在為身體給藥後形成功能聯合的能力，因為某些這類相互作用對於產生生物學作用是必要的。因此，缺少聯合效應物基團或標籤被用於對體外而不是體內的裸結合分子或未結合的結合分子的定義。生物樣品本文所使用的術語"生物樣品"包括多種樣品類型，包括血液和生物來源的其它液體樣品、實體組織樣品例如活組織樣品或者組織培養物，或者從其衍生的細胞及其後代。該術語還包括在獲得之後以任何方法進行操作的樣品，例如使用試劑進行處理、溶解或者富集某些組分例如蛋白質或多聚核苷酸。該術語包括各種從任何物種獲得的臨床樣品，還包括培養物、細胞懸浮液和細胞裂解液中的細胞。互補決定區(CDR)本文所使用的術語"互補決定區"的意思是在結合分子如免疫球蛋白的可變區內通常在很大程度上有助於抗原結合位點的序列，其中所述抗原結合位點在形狀和電荷分布方面與抗原上所識別的抗原決定基互補。CDR區可以對於蛋白質或蛋白質片段的線性抗原決定基、不連續抗原決定基或構象抗原決定基(在原始構象蛋白質上出現時，或者某些情況中在出現在變性蛋白質上時，例如通過溶解在SDS中變性時)是特異性的。抗原決定基也可以由8蛋白質的翻譯後修飾構成。缺失本文所使用的術語"缺失"表示胺基酸或核苷酸序列的改變，其中與通常天然存在的親代分子相比，分別缺少一個或者多個胺基酸或核苷酸殘基。表達調節核酸序列本文所使用的術語"表達調節核酸序列"指對於在特定宿主生物體中可操作連接編碼序列的表達必要的和/或影響可操作連接編碼序列的表達的多聚核苷酸序列。表達調節核酸序列例如尤其是適當的轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列、增強子序列；阻抑子或激活子序列；有效的RNA處理信號，例如剪接和聚腺苷化信號；穩定細胞質mJRNA的序列；提高翻譯效率的序列(例如核糖體結合位點)；提高蛋白質穩定性的序列；以及在期望時，增強細胞分泌的序列，可以是任何在所選擇宿主生物體內表現出活性的核酸序列，並且可以衍生自編碼與宿主生物體同源或者異源蛋白質的基因。表達調節序列的鑑定和利用對於本領域技術人員而言是常規的。功能變體本文所使用的術語"功能變體"指結合分子，其包含與親代結合分子的核苷酸和/或胺基酸序列相比，一個或者多個核苷酸和/或胺基酸被改變的核苷酸和/或胺基酸序列，但該結合分子仍能夠與親代結合分子競爭與結合配偶體例如腸球菌的結合。換句話說，親代結合分子的胺基酸和/或核苷酸序列的修飾沒有顯著影響或改變核苷酸序列所編碼或包含該胺基酸序列的結合分子的結合特性，即該結合分子仍能夠識別並結合其靶點。功能變體可以具有保守性序列修飾，包括核苷酸和胺基酸置換、添加和缺失。可以通過本領域中已知的標準技術引入這些修飾，例如定點誘變和隨機PCR介導的誘變，並可以包括天然以及非天然核苷酸和胺基酸。保守胺基酸置換包括胺基酸殘基被具有類似結構或化學性質的胺基酸9殘基替換的置換。本領域中已經定義了具有類似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、中性極性側鏈(例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、(3-支鏈側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。對於本領域技術人員清楚的是，也可以採用與上面所採用的不同的胺基酸殘基家族的分類。此外，變體可以具有非保守胺基酸置換，例如使用具有不同結構或化學性質的胺基酸殘基替換胺基酸。類似的少量變體也可以包括胺基酸缺失或插入，或者包括二者。可以使用本領域中公知的電腦程式獲得對確定哪個胺基酸殘基可以被置換、插入或缺失而不會破壞免疫活性的引導。核苷酸序列中的突變可以是在位點上進行的單個改變(點突變)，例如轉換突變(transitionmutation)或顛換突變(transversionmutation),或者，在一個位點上可以插入、缺失或改變多個核苷酸。另外，可以在核苷酸序列內任何數目的位點進行的一個或者多個改變。可以通過本領域中已知的任何適當方法進行突變。宿主本文所使用的術語"宿主"是為了指已經引入載體(例如克隆載體或表達載體)的生物體或細胞。所述生物體或細胞可以是原核細胞或真核細胞。需要理解該術語是為了不僅指特定的對象生物體或細胞，還指這類生物體或細胞的後代。由於在後代中可以因突變或環境影響而出現某些修飾，因此事實上這些後代與親代生物體或細胞可能不一致，但仍被包括本文所使用術語"宿主"的範圍內。人在用於本文所定義的結合分子時，術語"人"是指直接來自或基於人類序10列的分子。如果結合分子來自或者基於人類序列，並接著被修飾，則在本文中使用時仍被認為是人的。換句話說，術語"人"在用於結合分子時是為了包括具有來自人生殖系免疫球蛋白序列或基於人或人淋巴細胞中所出現可變區或恆定區並以某些形式被修飾的可變區和恆定區。因此，人結合分子可以包括並非由人種系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基，包括置換和/或缺失(例如通過如體外隨機或位點特異性突變或體內體細胞突變所引入的突變)。本文所使用的"基於"指可以精確地從模板拷貝的核酸序列或者具有例如通過錯誤傾向性PCR方法或合成造成的少量突變的情況，其與模板精確匹配或者具有少量修飾。本文所使用的基於人序列的半合成分子也被認為是人的。插入術語"插入"也被稱作術語"添加"表示胺基酸或核苷酸序列的變化，與親代序列相比，分別導致增加一個或者多個胺基酸或核苷酸殘基。固有活性術語"固有活性"在用於本文所限定的結合分子時，指能夠與病原體(如細菌)表面上的某些蛋白質或糖類抗原結合的結合分子，以及能夠抑制病原體正常生長和分裂的能力的結合分子。這些結合分子能夠例如阻斷生長所需特異性營養物的進入，或者從細菌轉運毒性廢物元素。通過後面的作用，它們還能夠提高細菌對抗生素藥物作用的靈敏性。分離的術語"分離的"在用於本文所限定的結合分子時，指基本上不包含其它蛋白質或多肽，特別是基本上不含具有不同抗原特異性的其它結合分子，並且還基本上不包含其它細胞物質和/或化學物質的結合分子。例如，如果通過重組製備結合分子，則優選它們基本上不含培養基，如果通過化學合成製備結合分子，則優選它們基本上不含化學前體或其它化學物質，即它們被從參與11蛋白質合成的化學前體或其它化學物質中區分開。術語"分離的"在用於本文所限定的的編碼結合蛋白的核酸時，是為了指編碼結合分子的核苷酸序列不含其它核苷酸序列，特別是編碼結合腸球菌以外的結合配偶體的結合分子的核苷酸序列。此外，術語"分離的"指基本上從在其天然宿主中天然伴隨原始核酸分子的其它細胞組分(例如天然結合的核糖體、聚合酶或基因組序列)被區分開的核酸分子。而且，"分離的"核酸分子，例如cDNA分子可以是在通過重組技術製備時基本上不含其它細胞物質或者培養基，或者在化學合成時基本上不含化學前體或其它化學物質。單克隆抗體本文所使用的術語"單克隆抗體"是指單種分子組成的抗體分子製備物。單克隆抗體表現出對於特定抗原決定基的單一結合特異性和親和力。因此，術語"人單克隆抗體"是指表現出單一結合特異性的抗體，其具有來自或基於人生殖系免疫球蛋白序列或者來自完全合成序列的可變區和恆定區。製備單克隆抗體的方法是無關的。天然存在本文所使用的術語"天然存在"在用於客體時，是指客體可以在自然界中被發現。例如，在能夠從自然界中的來源分離的生物體中存在，並且還未被人在實驗室中有目的地修飾的多肽或多聚核苷酸序列是天然存在的。核酸分子本文所使用的術語"核酸分子"，是指核苷酸的聚合物形式，並且包括RNA、cDNA、基因組DNA的正義鏈和反義鏈和合成形式和上述的混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或這兩種類型的核苷酸中的任一種的修飾形式。該術語還包括DNA的單鏈和雙鏈形式。另外，多聚核苷酸可以包括天然存在和被修飾核苷酸的每一種或者兩種，其被天然存在和/或非天然存在的核苷酸鍵所連接在一起。正如本領域技術人員容易接受的，12核酸分子可以被化學或生物化學修飾，或者可以包含非天然或衍生的核苷酸鹼基。這些修飾包括例如標記、甲基化、使用類似物取代一個或者多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾例如中性鍵(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電鍵(硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸掛部(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、垸基化劑和被修飾的鍵(例如(X異頭核酸等)。上述術語還為了包括任何拓撲構型，包括單鏈、雙鏈、部分雙螺旋、三螺旋、髮夾式、環形和掛鎖式構型。還包括合成分子，其模擬多聚核苷酸通過氫鍵和其它化學相互作用與指定序列結合的能力。這些分子是本領域中己知的，並且包括例如肽鍵取代分子骨架中磷酸酯鍵的分子。除非特別說明，提到核酸序列包括其互補物。因此，提到具有特定序列的核酸分子，需要理解成包括具有其互補序列的互補鏈。互補鏈也是有用的，例如用於反義治療、雜交探針和PCR引物。可操作連接術語"可操作連接"是指通常被物理連接並且相互之間功能上有聯繫的兩個或者多個核酸序列元件。例如，如果啟動子能夠啟動或調節編碼序列轉錄或表達，則啟動子被可操作連接到編碼序列，在這種情況中編碼序列需要被理解為在啟動子的"控制"下。調理活性"調理活性，，是指調理素(通常是結合分子例如抗體或血清補體因子)與病原體表面結合的能力，其通過特異性的抗原識別(在抗體時)或者通過表面結合分子的催化作用(例如由於表面結合抗體的提高的C3b沉積)。由於吞噬細胞上的識別受體對調理素的特異性識別(在抗體本身是調理素時為Fc受體，在補體是調理素時為補體受體)，被調理病原體的吞噬作用被增強。某些細菌，特別是由於存在莢膜而抵抗吞噬作用的莢膜細菌在包被調理素抗體時，變得對吞噬細胞(例如嗜中性粒細胞和巨噬細胞)非常有吸引力，並且從血流13中以及被感染器官中清除它們的速率被顯著提高。可以以任何常規的方式檢測調理活性(例如調理素吞噬細胞殺傷測定)。藥物上可以接受的賦形劑"藥物上可以接受的賦形劑"的意思是任何惰性材料，其與活性分子例如藥物、藥劑或結合分子組合用於製備適合的或者便利的劑型。"藥物上可以接受的賦形劑"是以所採用的劑量和濃度對接受者無毒，並且與包含藥物、藥劑或結合分子的製劑的其它成分兼容的賦形劑。特異性結合本文所使用的術語"特異性結合"，關於結合分子(例如抗體)與其結合配偶體(例如抗原)的相互作用，其意思是取決於特定結構(例如結合配偶體上的抗原決定簇或抗原決定基)的存在的相互作用。換句話說，即使在結合配偶體出現在其它分子的混合物或生物體中時，抗體也優先結合或識別結合配偶體。結合可以是共價相互作用或非共價相互作用或其二者結合所介導的。用另外一種方式表達，術語"特異性結合"的意思是與抗原或其片段免疫特異性地結合，並且不與其它抗原免疫特異性地結合。根據例如放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、BIACORE或本領域中已知的其它測定確定的，與抗原免疫特異性結合的結合分子可以與其它肽或多肽以較低親和力結合。與抗原免疫特異性結合的結合分子或其片段可以與相關的抗原交叉反應。優選，與抗原免疫特異性結合的結合分子或其片段不與其它抗原交叉反應。置換本文所使用的"置換"表示分別用不同的胺基酸或核苷酸替換一個或者多個胺基酸或者核苷酸。治療有效量術語"治療有效量"指在本文中所定義的結合分子的量，其有效地阻止、14改善和/或治療由於腸球菌(五^eracocc^)感染所引起的病症。治療術語"治療"是指治療性治療以及預防性或防治性措施以治癒或停止或者至少延遲疾病進展。需要治療的包括己經患有由於腸球菌(五"/eracoccw)感染所引起的疾病的，以及需要預防腸球菌(^^raco"w)感染的。從腸球菌感染中部分或完全恢復的對象也需要治療。預防包括已知或者減少腸球菌C&7feracoccw》的擴散，或者抑制或者減少與腸球菌(五"&racoccw)感染相關的一種或者多種症狀的發作、發生或進展。載體術語"載體"表示第二核酸分子能夠被插入以被引入到宿主中的核酸分子，在該宿主中將會複製所述第二核酸分子，並且在某些情況中會表達所述第二核酸分子。換句話說，載體能夠轉運己經被連接的核酸分子。克隆以及表達載體被在本文所使用的"載體"所包括。載體包括但不限於質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)以及從噬菌體或植物或動物(包括人)病毒衍生的載體。載體包含被所期望宿主識別的複製起始點，以及在表達載體的情況中包含啟動子和宿主識別的其它調節區。通過轉化、轉染或者通過利用病毒進入機制，將包含第二核酸的載體引入到細胞中。某些載體能夠在被引入的宿主內自動複製(例如具有細菌複製起始點的載體能夠在細菌內複製)。其它載體能夠在引入到宿主內後，整合到宿主的基因組內，這樣隨同與宿主基因組一起複製。
發明內容本發明提供了人結合分子，其能夠特異性結合腸球菌，並且表現出針對腸球菌的殺傷和/或抑制生長的活性。本發明還涉及編碼人結合分子至少結合區的核酸分子。本發明還提供了本發明的人結合分子在預防和/或治療患有腸15球菌(五Weracoccw力感染或有發生腸球菌(五"&racoccw)感染風險的對象中的應用。除此以外，本發明還涉及本發明的人結合分子在診斷/檢測腸球菌C&7feracoccws)中的應用。發明詳述在本發明的第一方面中，包括能夠特異性結合腸球菌(五Mferacoccw)種的結合分子。優選，所述結合分子是人結合分子。優選，本發明的結合分子表現出針對腸球菌(五加erococcm)種的殺傷活性。在進一步的方面中，本發明的結合分子能夠特異性地結合至少兩種不同的腸球菌C&^wwc^)種和/或具有針對至少兩種不同腸球菌(^7teracoccw)種的殺傷活性。優選，本發明的結合分子能夠特異性地結合至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種不同的腸球菌C&7feracoccw)種，和/或針對至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種不同的腸球菌CE"teracocc^)種具有殺傷活性。本發明的結合分子能夠特異性結合和/或具有殺傷活性的腸球菌C&^racocow)禾中選自由驢腸球菌CE.os/"/)、鳥腸球菌(五.av&m)、鉛黃腸球菌(￡.cowe/i/7"v附)、盲腸腸球菌CE.cecorww)、而f久腸球菌(五.co/w附&ae)、殊異腸球菌(E.tfo/"^、耐久腸球菌(五.^ra"力、糞腸球菌(五/aecfl//》、屎腸球菌C&y^ec/wm)、黃色腸球菌CE./avesce"力、鵓X鳥腸球菌CE.ga〃/"an/w)、五.g7./vws、/zaemopeo;/(ii^、海氏腸球菌CE./n'rae)、病臭腸球菌(五.wa/oiiora似力、摩拉糹隹亞月5王求菌(五.附on3v/e"s/s)、蒙氏月l(球菌(五.附wm/",)、E/a〃e"s、/orc/""^、類鳥腸球菌(五.戸eWom^m)、棉子糖腸球菌(Era/mwM力、鼠腸球菌(E.ra"/)、角軍糖腸球菌(五.^cc/wo/;yricws)、殺魚腸球菌(￡.sen'o//c^a)、孤立腸球16菌(￡.so/ton'w力、硫磺色腸球菌(E^//www)、絨毛腸球菌(五.w7/oram)所組成的組，其中糞腸球菌(E/^o^)和屎腸球菌(五./"^"w)是優選的種。在一個實施方式中，本發明的結合分子能夠特異性結合一個腸球菌(五Weracoccw)種內的不同菌株並針對一個腸球菌(^^eracocc^)種內的不同菌株具有殺傷活性。在另一個實施方式中，本發明的結合分子甚至能夠特異性結合和/或針對至少一種其它的革蘭氏陽性細菌和/或革蘭氏陰性細菌具有殺傷活性，包括但不限於A組鏈球菌；釀膿鏈球菌0S^^tococcw5p_yrage"e》、B組鏈球菌；無乳鏈球菌(5^e;tococcz^aga/ac"ae)、米勒氏f連球菌(5^e;tococcwsmz.〃en')、月巿炎鏈球菌(及re/7tococcaspwewwow'ae)、草綠色f連球菌(KzW(ifl7wW^tococc/)、變異鏈球菌(&邵tococcus羅to"力、金黃色葡萄球菌OSto//^/ococa^aw廠ew)、表皮葡萄5求菌(&a//zy/ococcwse/z.cfemn.cfa)、白喉豐幹菌(Co/^"e6ac&n'Mmc^/^/2er/ae)、潰瘍棒狀木幹菌(Coo^eZacfen'wmw/ceram1)、假結核棒狀桿菌(CV3r少"eZac&廠/MW/^eM^fo/M6e/rM/as7、)、傑氏棒狀豐幹菌(Cbr少"eZ"cfer/wm乂e汰e/w,w)、結月莫乾燥棒狀桿菌(C。o^^a"en-w附xeraw》、j叚白喉棒狀桿菌(Co，由cter/腦戸ew(ioc^滅en'"c薩)、炭疽桿菌(5製7/"5a"Arac&)、蠟樣芽胞桿菌(Sac說^cwe附)、單核細胞增多性李司忒氏菌(Z/Wm》ww"oc_ytog￡"&s)、產氣莢膜梭菌(C7oWrfcz.ww/er力'/"gera)、破傷風梭菌(C7oWrWMW^/am〕、肉毒梭菌(C7oWnWwm6o加""ww)、艱難梭菌(C7o^n'd,wm(i驕"7e)、結核桿菌(綺co6acte"'應fw6e職/os^)、麻風分枝桿菌(腳cc^fl"e〃.ww/eprae)衣氏方文線菌(」c""owyces/srae/")、星形女又卡菌(7VorcorWatw&ra/cfes)、巴西女又卡菌(jVorcara/a6raa7/e似/s)、大月Ii桿菌C&c/zen'c/2faco/z〕、奇異變形桿菌(屍ratewsm/ra&7/力、普通變形菌(Prato^vw/gani)、月巿炎克氏木幹菌(尺/e6wW/ajwewmow'ae)、傷寒沙門菌(5"a/mo"e〃"/)^/zz')、副傷寒沙門菌(&z/mo"e〃a;^ra/>p/n')A,B&C、腸炎沙門氏菌(5b/wo"e//ae"&nY/ofo)、豬霍舌L沙門氏菌(Sa/wo"e〃ac/w/erae-ra/力、委鬼爾肖沙17l、，氏菌(S。/wo"e〃"v/廠c/2。w)、鼠i^寒》少r，氏—菌CSW/mo"e〃a(yp/7/附wWw附)、痢疾志賀氏菌(幼!'ge/Za辦seWen'ae)、鮑氏志賀菌(幼&6//06oyt/"')、弗累克斯訥氏桿菌OS72/ge//0！/7ex"en')、索氏志賀菌(57z/ge〃aso""e/)、綠月農木幹菌(屍sew(iowowasaeragzVzosa)、鼻疽4叚單胞菌(i^ewt/omo"oswa〃e/)、霍舌L弧菌^'6n'oc/zo/erae)、副溶血性弧菌^n'o;"ra/2"e/wo/盧/cM力、創傷弧菌(F/6n'ovw/mycw力、溶藻弧菌(a/g/"o/^/cw)、幽門彎曲桿菌(Cam/y/o6acfer屍y/on〕、幽門螺旋桿菌(He/Zco￡>acferp_y/oW)、空腸彎曲桿菌(Camp_y/oiac&rj'ejwm')、脆弱扁擬木幹菌(5"ctera/(iesyhag7'fe)、奈瑟雙球菌(iVe&sen-ago"o/r/zoe<3￡)、月畝膜炎奈瑟氏菌(iVe/jsen'a附e"/"g"/d/》、茅佔月莫炎布蘭漢氏球菌C6ra"/w肌e〃acafarr/z"/")、f荒感嗜血木幹菌(Z/aemo;^z71^z'"/7t/ew加e)、杜克雷氏嗜血桿菌(//<0^附0;/7//2<iwcre"〕、百日咳博代氏桿菌(^orafe&〃apeWwsw'力、流產布魯氏桿菌Cgrwce〃aa6oWus)、荒產布魯氏桿菌CBrwce〃aa6oW^)、馬爾它布魯氏桿菌C6rwce〃(3me/Zfem^)、"耆月巿性軍團病桿菌(丄eg/o"e〃"_p"￡wmo/7/z//a)、梅毒螺旋體(7>e/o"ew<3一/油m)、品它病密螺旋體(r邵匿麵cara&鵬)、鉤端螺旋體(丄epto一ra/Werrog。似)、雙曲鉤端螺旋體(丄印fcw;z'ra^y7exa)、回歸熱螺旋體(Bo7re//arecw〃ewto)、博氏疏螺旋體(萬o;re"(36wrgdor/en')、肺炎支原體肺炎(綺cop/oywa/wewwowz》e)、伯納特氏柯克斯氏體(Code〃aZwr打e報)、沙眼衣原體(C7am;^'afrac/zomafe)、鸚鵡熱衣原體(C/aw;^/a戸/加c/)和肺炎衣原體(Ckm;^:;wwmomV^)。本發明的結合分子能夠特異性結合腸球菌以及任選地有生存能力的、活的和/或有傳染性的或者以失活/減毒形式的其它革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌。使細菌失活/減毒的方法是本領域中公知的，包括但不限於抗生素處理、UV處理、甲醛處理等。本發明的結合分子還能夠特異性結合腸球菌(和其它革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌)的一種或者多種片段，例如尤其是來自腸球菌的一種或者多種蛋白質和/或來自腸球菌的(多)肽或者一種或者多種重組製備的腸球菌蛋18白質和/或多肽。對於腸球菌感染的治療和/或預防的方法，結合分子能夠特異性結合腸球菌的表面可接近蛋白質。對於診斷目的，結合分子還能夠特異性結合不在腸球菌表面存在的蛋白質。能夠在GeneBank數據文庫、EMBL數據文庫和/或其它數據文庫中發現各種腸球茵0&^racocc附)種和茵株的核苷酸和/或胺基酸序列。在各種數據文庫中發現這些序列是本領域技術人員的公知技術。或者，本發明的結合分子還能夠特異性結合其它的腸球菌分子，包括但不限於抑制吞噬細胞吞入的表面因子；增強它們在吞噬細胞中存活的因子；裂解真核細胞膜的侵襲素；破壞宿主組織或以其它方式引發疾病症狀的外毒素；多糖；其它細胞壁組分，例如磷壁酸、脂膜酸、核糖醇、肽聚糖、五甘氨酸寡肽、iV-乙醯葡糖胺、7V-乙醯胞壁酸、l乙醯氨基半乳糖糖醛酸、N-乙醯巖藻糖胺、N-乙醯氨基葡萄糖糖醛酸、N-乙醯氨基甘露糖醛酸、O-乙醯葡萄糖氨、胞壁酸、氨基半乳糖糖醛酸、巖藻糖胺、氨基葡萄糖糖醛酸、氨基甘露糖醛酸鼠李糖、氨基己糖、己糖、曲二糖、磷酸甘油、核糖醇磷酸酯以及任何這些組分之間的連接單元。在另一個實施方式中，本發明的結合分子能夠特異性結合上述蛋白質和/或其它分子的片段，其中所述片段至少包括本發明結合分子所識別的抗原決定簇。本文所使用的"抗原決定簇"是能夠以充分高親和力與本發明的結合分子結合、形成可檢測抗原結合分子複合物的基團(moeity)。本發明的結合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，例如多克隆或單克隆抗體，或者所述結合分子可以是抗原結合片段包括但不限於Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、雙價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、二聚抗體、三聚抗體、四聚抗體、以及包含至少足以提供特異性抗原結合腸球菌或其片段的免疫球蛋白片段的(多)肽。在一個優選的實施方式中，本發明的結合分子是人單克隆抗體。19本發明的結合分子能夠以非分離或分離的形式使用。此外，本發明的結合分子能夠被單獨使用，或者在包含至少一種本發明結合分子(或其變體或片段)的混合物中被使用。換句話說，這些結合分子能夠被組合使用，例如包含兩種或者更多種本發明結合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結合分子能夠被組合在單次治療中，以達到期望的預防、治療或診斷效果，但可替換的，具有相同活性的結合分子也能夠被組合在單次治療中以達到期望的預防、治療或診斷效果。任選地，所述混合物還包含至少一種其它的治療劑。優選，所述治療劑例如抗生素可以用於腸球菌感染的預防和/或治療。通常，本發明的結合分子可以以低於0.2*10—4]\4、1.0*10—5M、1.0*10—6M、1.0*10—7M，優選低於1.0*1(T8M，更優選低於1.0*10—9M，更優選低於1.0*10-0M，甚至更優選低於1,(m0-'〗M，特別地低於1.0*10-12M的親和常數(Kd值)與它們的結合配偶體(即腸球菌或其片段)結合。對於抗體同種型，親和常數會變化。例如，IgM同種型的親和力結合是指至少大約1.0*1(T7M的結合親和力。例如可以使用表面等離子體共振(例如使用BIACORE系統(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,瑞典))對親和常數進行測量。本發明的結合分子可以結合可溶形式(例如樣品中或懸浮液中)的腸球菌或其片段，或者可以結合連接或附著到載體或基質(例如微量滴定板、膜和珠等)上的腸球菌或其片段。載體或基質可以是由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、硝化纖維素或特氟隆等製成的。這些支持物的表面可以是實心的或者多孔的，並且可以是任何便利形狀的。此外，結合分子可以結合純化/分離或非純化/非分離形式的腸球菌。本發明的結合分子表現出殺傷活性。這裡所表示的殺傷活性包括但不限於調理活性或任何其它提高/增大/增強吞噬作用和/或吞噬細胞殺傷細菌(例如腸球菌)的活性；固有(殺傷)活性，例如降低或抑制細菌生長或者直接殺傷20細菌；提高細菌對抗生素處理的敏感性；或其任意組合。例如，調理活性可以根據這裡所描述的進行測量。測量調理活性的替換測定被描述在例如分子克隆和臨床實驗室免疫學手冊(ManualofMolecularandClinicalLaboratoryImmunology),第7版中。測量其它所提到的活性的測定也是已知的。在一個優選實施方式中，本發明的結合分子包含至少一個CDR3區，優選重鏈CDR3區，其包含選自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:15、SEQIDNO:21、SEQIDNO:27、SEQIDNO:33、SEQIDNO:39、SEQIDNO:45、SEQIDNO:51、SEQIDNO:57、SEQIDNO:196、SEQIDNO:202、SEQIDNO:220、SEQIDNO:226、SEQIDNO:232、SEQIDNO:238、SEQIDNO:244、SEQIDNO:250、SEQIDNO:256、SEQIDNO:262、SEQIDNO:268、SEQIDNO:274、SEQIDNO:280、SEQIDNO:286、SEQIDNO:292、SEQIDNO:298、SEQIDNO:304、SEQIDNO:310、SEQIDNO:316、SEQIDNO:322、SEQIDNO:328、SEQIDNO:334、SEQIDNO:340和SEQIDNO:346所組成的組的胺基酸序列。本發明結合分子的CDR區顯示在表11中。根據Kabat等人(1991)的CDR區被描述在《免疫學興趣蛋白質序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)中。在一個實施方式中，結合分子可以包含2個、3個、4、5或甚至本發明結合分子的全部六個CDR區。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包含重鏈，其包含選自由SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:211、SEQIDNO:213、SEQIDNO:395、SEQIDNO:397、SEQIDNO:399、SEQIDNO:401、SEQIDNO:403、SEQIDNO:405、SEQIDNO:407、SEQIDNO:409、SEQIDNO:411、SEQIDNO:413、SEQIDNO:415、SEQIDNO:417、SEQIDNO:419、21SEQIDNO:421、SEQIDNO:423、SEQIDNO:425、SEQIDNO:427、SEQIDNO:429、SEQIDNO:431、SEQIDNO:433、SEQIDNO:435、禾口SEQIDNO:437所組成組的胺基酸序列的可變重鏈。在進一步的實施方式中，本發明的結合分子包含輕鏈，其包含選自由SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:雨、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:439、SEQIDNO:441、SEQIDNO:443、SEQIDNO:445、SEQIDNO:447、SEQIDNO:449、SEQIDNO:451、SEQIDNO:453、SEQIDNO:455、SEQIDNO:457、SEQIDNO:459、SEQIDNO:461、SEQIDNO:463、SEQIDNO:465、SEQIDNO:467、SEQIDNO:469、SEQIDNO:471、SEQIDNO:473、SEQIDNO:475、SEQIDNO:477、SEQIDNO:479和SEQIDNO:481所組成組的胺基酸序列的可變輕鏈。表12詳細說明了本發明結合分子的重鏈和輕鏈可變區。本發明的另一個方面包括本文所限定結合分子的功能變體。如果變體能夠與親代人結合分子競爭特異性結合腸球菌(或其它革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌)或其片段，則分子被認為是本發明結合分子的功能變體。換句話說，在功能變體仍能夠結合腸球菌或其片段時。優選，功能變體能夠競爭特異性結合至少兩種(或者更多種)不同的親代人結合分子所特異性結合的腸球菌(^7teracoccM)種或其片段。此外，如果它們具有針對腸球菌、優選針對至少兩種(或者更多種)親代結合分子表現出殺傷活性的腸球菌(E她腦occ—種的殺傷活性，則分子被認為是本發明結合分子的功能變體。在另一個實施方式中，本發明結合分子的功能變體還針對其它革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌具有殺傷活性。功能變體包括但不限於在初級結構序列上基本類似但包含例如在親代結合分子中未發現的體外或體內化學和/或生物化學修飾的衍生物。這些修飾包括尤其是乙醯化、醯基化、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂類或脂類衍生物的共價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白質水解處理、磷酸化等。或者，功能變體可以是本發明中所定義的功能變體，與親代結合分子相比，其包含包含一個或者多個胺基酸置換、插入、缺失或其組合的胺基酸序列。此外，功能變體可以包含在氨基端和/或羧基端的平截。與親代結合分子相比，本發明的功能變體可以具有相同或者不同，更高或者更低的的結合親和力，但仍能夠結合腸球菌或其片段。例如，與親代結合分子相比，本發明的功能變體可以具有提高的或降低的與腸球菌或其片段的結合親和力。優選，可變區(包括但不限於框架區、高變區特別是CDR3區)的胺基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區包含3個高變區，其包括3個CDR以及多個保守區(所謂的框架區(FR))。高變區包括來自CDR的胺基酸殘基以及來自高變環的胺基酸殘基。與本文所限定的親代人結合分子相比，旨在落在本發明範圍內的功能變體具有至少大約50%-大約99°/。，優選至少大約60°/。-大約99%，更優選至少大約70%-大約99%，甚至更優選至少大約80%-大約99%,最優選至少大約90%-大約99%，特別地至少大約95%-大約99%，特別地至少大約97%-大約99%的胺基酸序列同源性。本領域技術人員已知的計算機運算法則，例如尤其是Gap或Bestfit都可以用於優選將需要比較的胺基酸序列進行比對，以及用於限定類似或者相同的胺基酸殘基。通過本領域中公知的分子生物學方法改變親代結合分子或其部分能夠獲得功能變體，包括但不限於錯誤傾向性PCR方法、寡聚核苷酸定向誘變、位點定向誘變以及輕鏈和/或重鏈改組。在一個實施方式中，本發明的功能變體針對腸球菌具有殺傷活性。與親代結合分子相比，殺傷活性可以相同，或者更高或更低。此外，所述具有殺傷活性的功能變體可以具有適合腸球菌控制的其它活性。其它活性是上面所提到23的。此後，如果使用使用術語(人)結合分子，則這還包括(人)結合分子的功能變體本發明提供了一組可以利用的人單克隆抗體，其具有針對至少兩種不同的腸球菌(^zferacoccw)種的每一種的至少一種菌株以及針對至少一種金黃色葡萄球菌CStop/^/ococcMflwe^)至少一種菌株具有調理吞噬殺傷活性。本發明的抗體包括本文所公開抗體CR5140(SEQIDNO:395+439)、CR5157(SEQIDNO:397+441)、CR6016(SEQIDNO:88+108)、CR6043(SEQIDNO:90+110)、CR6050(SEQIDNO:401+445)、CR6078(SEQIDNO:96+116)、CR6087(SEQIDNO:211+215)、CR6089(SEQIDNO:213+217)、CR6241(SEQIDNO:98+118)、CR6252(SEQIDNO:100+120)、CR6388(SEQIDNO:421+465)、CR6389(SEQIDNO:423+467)、CR6396(SEQIDNO:425+469)、CR6402(SEQIDNO:427+471)、CR6409(SEQIDNO:429+473)、CR6415(SEQIDNO:431+475)、CR6421(SEQIDNO:433+477)或CR6429(SEQIDNO:435+479)任一種的可變區以及包含與其具有至少80%、優選至少90%、更優選至少95%相同性的可變區的抗體。優選完整抗體的序列與本文所公開的抗體具有至少80%、更優選至少90%、仍更優選至少95%的相同性。這些抗體全部顯示具有針對至少兩種不同腸球菌(五WeracoccM)種(包括糞腸球菌(E/flecafo)和屎腸球菌(五./aec/wm))的調理吞噬殺傷活性。令人吃驚地，這些抗體還對金黃色葡萄球菌(S.www)有反應(菌株502，對於某些抗體(CR6252、CR6425、CR6421)，還顯示它們還對金黃色葡萄球菌(S.awm^)的Numan菌株以及表皮葡萄球菌(S.ep^e/mVfc)菌株RP62A有反應)，因此具有廣泛的特異性和治療用途的廣泛潛力。這些抗體不結合金黃色葡萄球菌(5*.ww)的LTA，其中LTA是金黃色葡萄球菌(S.m^ew)細胞壁的主要成分之一。在某些實施方式中，因此，本發明的抗體不特異性結合金黃色葡萄球菌(S.m/Mw)的LTA。本發明還提供了組合物，其24包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種或更多種本發明的人單克隆抗體。當然，根據常規方法，基於本文所公開的抗體序列，可以製備更高親和力突變體或者具有其它有利性質的突變體。如果重鏈和輕鏈可變區與本文所公開抗體可變區序列具有至少80%、優選至少90%、仍更優選至少95%的相同性，則這些改進的抗體也被包括在本發明的範圍內。在進一步的方面中，本發明包括免疫綴合物，即包含至少一個本文所定義的結合分子並且還包含至少一個標籤(例如尤其是可檢測基團/劑)的分子。本發明還設計的是本發明免疫綴合物的混合物，或者至少一種本發明免疫綴合物和其它分子(例如治療劑或另一種結合分子或免疫綴合物)的混合物。在進一步的實施方式中，本發明的免疫綴合物可以包含多於一個標籤。這些標籤相互之間可以是相同的，或者不同的，並且可以被非共價結合/偶聯到結合分子上。這些標籤也可以通過共價鍵直接結合/偶聯到人結合分子上。或者，標籤可以通過一個或者多個連接化合物結合/偶聯到結合分子上。將標籤偶聯到結合分子上的技術對於本領域技術人員是公知的。本發明免疫綴合物的標籤可以是治療劑，但它們也可以是可檢測基團/劑。適合在治療和/或預防中的標籤可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、其它能夠增強吞噬或免疫刺激的結合分子。可以在診斷上使用包含可檢測試劑的免疫綴合物，以例如檢測對象是否感染了腸球菌(^wfera"co^)種，或者檢測腸球菌感染的發生或進展，作為臨床測試程序的一部分例如用於確定給定治療方案的功效。然而，它們也可以用於其它檢測和/或分析和/或診斷目的。可檢測基團/劑包括但不限於酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、正電子發射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為檢測和/或分析和/或診斷目的，用於標記結合分子的標籤依賴於所使用的具體檢測和/或分析和/或診斷技術和/或方法，例如尤其是(組織)樣品的免疫組織化學染色、流式細胞儀檢測、掃描雷射細胞儀檢測、螢光免疫測定、酶聯免疫25吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、生物測定(例如細胞吞噬測定)、Western印跡應用等。用於檢測/分析/診斷技術和/或本領域已知方法的適當標記是本領域技術人員的公知技術。此外，本發明的人結合分子或免疫綴合物也可以結合到固體支持物上，其中所述固體支持物特別地可以用於腸球菌或其片段的體外免疫測定或者純化。這些固體支持物可以是多孔的或者無孔的、平面的或者非平面的。本發明的結合分子可以與標記物序列(例如輔助純化的肽)融合。例子包括但不限於六組氨酸標籤、血凝素(HA)標籤、myc標籤或flag標籤。或者，抗體可以偶聯到第二抗體上以形成抗體雜偶聯物(heteroconjugate)。在另一個方面中，本發明的結合分子可以被偶聯/附著到一個或者多個抗原上。優選，這些抗原是被給藥所述結合分子-抗原偶聯物的對象的免疫系統所識別的抗原。這些抗原可以是相同的，但也可以是相互之間不同的。附著抗原和結合分子的偶聯方法是本領域中公知的，並且包括但不限於使用交聯劑。本發明的結合分子將結合腸球菌，並且附著到結合分子的抗原會啟動T細胞對偶聯物的強大攻擊，這會最終導致破壞腸球菌。在通過直接偶聯或間接偶聯(例如通過連接物)化學地製備免疫綴合物之後，可以將免疫綴合物製備為包含本發明結合分子和適當標籤的融合蛋白。可以通過本領域中已知的方法製備融合蛋白，例如通過構建包含與編碼適當標籤的核酸序列符合閱讀框的編碼結合分子的核苷酸序列的核酸分子，接著表達所述核酸分子而重組製備。本發明的另一個方面是提供了一種核酸分子，其編碼至少一種本發明的結合分子、功能變體或免疫綴合物。這些核酸分子能夠被用作克隆目的的中間物，例如在上述的親和力成熟化(affinitymaturation)過程中。在優選的實施方式中，所述核酸分子是被分離或純化的。本領域技術人員能夠理解這些核酸分子的功能變體也旨在成為本發明的一部分。功能變體是使用標準的遺傳密碼子能夠被直接翻譯的核酸序列，以提供與從親代核酸分子翻譯的胺基酸序列一致的胺基酸序列。優選，核酸分子編碼包含CDR3區(優選重鏈CDR3區)的結合分子，其包括選自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:15、SEQIDNO:21、SEQIDNO:27、SEQIDNO:33、SEQIDNO:39、SEQIDNO:45、SEQIDNO:51、SEQIDNO:57、SEQIDNO:196、SEQIDNO:202、SEQIDNO:220、SEQIDNO:226、SEQIDNO:232、SEQIDNO:238、SEQIDNO:244、SEQIDNO:250、SEQIDNO:256、SEQIDNO:262、SEQIDNO:268、SEQIDNO:274、SEQIDNO:280、SEQIDNO:286、SEQIDNO:292、SEQIDNO:298、SEQIDNO:304、SEQIDNO:310、SEQIDNO:316、SEQIDNO:322、SEQIDNO:328、SEQIDNO:334、SEQIDNO:340和SEQIDNO:346所組成組的胺基酸序列。在進一步的實施方式中，核酸分子編碼包含本發明結合分子的2個、3個、4個、5個或者甚至全部6個CDR區的結合分子。在另一個實施方式中，核酸分子編碼包含重鏈的結合分子，其中所述重鏈含優選自由SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:211、SEQIDNO:213、SEQIDNO:395、SEQIDNO:397、SEQIDNO:399、SEQIDNO:401、SEQIDNO:403、SEQIDNO:405、SEQIDNO:407、SEQIDNO:409、SEQIDNO:411、SEQIDNO:413、SEQIDNO:415、SEQIDNO:417、SEQIDNO:419、SEQIDNO:421、SEQIDNO:423、SEQIDNO:425、SEQIDNO:427、SEQIDNO:429、SEQIDNO:431、SEQIDNO:433、SEQIDNO:435和SEQIDNO:437所組成組的胺基酸序列的可變重鏈。在另一個實施方式中，核酸分子編碼包含輕鏈的結合分子，其中所述輕27鏈包含選自由SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:439、SEQIDNO:441、SEQIDNO:443、SEQIDNO:445、SEQIDNO:447、SEQIDNO:449、SEQIDNO:451、SEQIDNO:453、SEQIDNO:455、SEQIDNO:457、SEQIDNO:459、SEQIDNO:461、SEQIDNO:463、SEQIDNO:465、SEQIDNO:467、SEQIDNO:469、SEQIDNO:471、SEQIDNO:473、SEQIDNO:475、SEQIDNO:477、SEQIDNO:479和SEQIDNO':481所組成組的胺基酸序列的可變輕鏈。本發明的另一個方面是提供載體，即核酸構建體，其包含一個或者多個根據本發明的核酸分子。載體可以衍生自質粒，例如尤其是F、Rl、RPl、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌體例如X噬菌體、類X噬菌體、M13噬菌體、Mu噬菌體、PI噬菌體、P22噬菌體、QP噬菌體、T-偶數噬菌體、T-奇數噬菌體、T2噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體等；植物病毒。載體可以用於克隆和/或表達本發明的結合分子，並且甚至可以用於基因治療目的。包含可操作連接到一個或者多個表達調節核酸分子的一個或者多個本發明核酸分子的載體也被本發明所覆蓋。載體的選擇取決於所遵循的重組方法以及所使用的宿主。可以通過例如尤其是磷酸鈣轉染、病毒侵染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體轉染或電穿孔實現在宿主細胞中引入載體。載體可以自主複製，或者可以與它們整合的染色體共同複製。優選，載體包含一個或者多個選擇標記物。正如本領域技術人員所公知的，標記物的選擇可以依賴於所選擇的宿主細胞，並且這對於本發明不是至關重要的。它們包括但不限於卡那黴素、新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、Zeocin、來自單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、來自小鼠的二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發明還覆蓋了包含可操作連接到一個或者多個編碼可以用於分離人結合分子的蛋白質或肽的核酸分子的一個或者多個編碼上述人結合分子的核酸分子。這些蛋白質或肽包括但不限於穀胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白質、金屬結合多聚組氨酸、綠色螢光蛋白、螢光素酶和(3-半乳糖苷酶。包含一個或者多個拷貝的上述載體的宿主是本發明另外的主題。優選，所述宿主是宿主細胞。宿主細胞包括但不限於哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或者細菌來源的細胞。細菌細胞包括但不限於來自革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌的細胞，例如埃希氏菌C^c^n'c/z/a)屬的某些種如大腸桿菌(五.co//)，和假單胞菌(屍W^/OWO"OJ)。在真菌細胞組中，優選使用酵母細胞。通過使用酵母菌株例如尤其是畢赤氏酵母CP/cW。；^to&)、釀酒酵母(&cc/^om;;c"cerev/5/M)和多形漢遜酵母(i^arae柳/a/0fym0/7/za)可以實現在酵母中的表達。此外，昆蟲細胞(例如來自果蠅和Sf9的細胞)能夠用作宿主細胞。除了這些，宿主細胞可以是植物細胞，例如尤其是來自農作物植物(如林業植物)的細胞，或者來自提供食物和原材料的植物(如穀類植物)或者藥用植物的細胞，或者來自觀賞植物的細胞，或者來自球花農作物的細胞。通過已知的方法製備轉化的(轉基因)植物或者植物細胞，例如農桿菌介導的基因轉移、葉盤轉化、聚乙二醇誘導DNA轉移的原生質體轉化、電穿孔、超聲法、微注射或者生物射彈(bolistic)基因轉移。另外，適當的表達系統可以是杆狀病毒系統。在本發明中優選使用哺乳動物細胞的表達系統，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞或者Bowes黑色素瘤細胞。哺乳動物細胞提供了具有與哺乳動物來源的天然分子最類似的翻譯後修飾的表達蛋白質。由於本發明解決可以為人給藥的分子，因此特別優選完全人的表達系統。因此，甚至更優選，宿主細胞是人細胞。人細胞的例子尤其是HeLa、911、AT1080、A549、293和HEK293T細胞。在優選的實施方式中，人生產細胞以可表達形式包含編碼腺病毒E區的核酸序列的至少功能部分。在更優選的29實施方式中，所述宿主細胞衍生自人視網膜，並被包含腺病毒E1序列的核酸永生化(immortalized)的宿主細胞，例如911細胞或在1996年2月29日以保藏號96022940保藏在歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，CAMR,Salisbury,WiltshireSP4OJQGreatBritain並以商標PER.C6⑧(PER.C6⑧是CrucellHollandB.V.的註冊商標)上市的細胞系。為了該應用的目的，"PER,C6"是指以保藏號96022940保藏的細胞，或其祖細胞(ancestor)、保藏細胞的祖細胞的上遊或下遊以及後代的傳代細胞，以及任何前述細胞的衍生物。可以根據本領域中公知的方法進行在宿主細胞中製備重組蛋白質。使用以商標PER.C6⑧銷售的細胞作為感興趣蛋白質的製備平臺已經被描述在WO00/63403中，本文中將其公開內容通過參照整體併入。製備本發明結合分子的方法是本發明另外的一部分。該方法包括步驟a)在有益於表達結合分子的條件下培養根據本發明的宿主；和b)任選地，回收表達的結合分子。可以從無細胞提取物回收但優選從細胞培養基中回收表達的結合分子或免疫綴合物。上述製備方法也可以用於製造本發明結合分子和/或免疫綴合物的功能變體。從無細胞提取物或培養基中回收蛋白質(例如結合分子)的方法是本領域技術人員公知的。通過上述方法能夠得到的結合分子、功能變體和/或免疫綴合物也可以是本發明的一部分。或者，在宿主中(例如宿主細胞中)表達之後，可以通過傳統的肽合成儀或者在使用來自本發明DNA分子的RNA核酸的無細胞翻譯系統中，合成製備本發明的結合分子和免疫綴合物。能夠通過上述合成製備方法或無細胞翻譯系統獲得的結合分子和免疫綴合物也是本發明的一部分。在另一個實施方式中，本發明的結合分子也能夠在轉基因哺乳動物、非人的哺乳動物例如尤其是兔、山羊或牛中製備本發明的結合分子，並分泌到例如其奶中。在另外一個可替換的實施方式中，本發明的結合分子，優選特異性結合30腸球菌或其片段的結合分子，可以是由表達人免疫球蛋白基因的轉基因非人哺乳動物產生的，例如轉基因小鼠或兔。優選，轉基因非人哺乳動物具有包含編碼全部或者部分上述人結合分子的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。可以使用純化的或富集的腸球菌或其片段的製品對轉基因非人哺乳動物進行免疫。免疫非人哺乳動物的方案是本領域中被充分建立的。參見《使用抗體實驗室手冊》(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),編輯E.Harlow禾卩D,Lane(1988)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork;禾B《免疫學當前方案》(CurrentProtocolsinImmunology)編輯J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober(2001)，JohnWiley&SonsInc.,NewYork,通過參照將其公開內容併入本文。免疫方案常常包括多次免疫，使用或者不使用佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，但也可以包含裸DNA免疫。在另一個實施方式中，人結合分子是由來自轉基因動物的B細胞或漿細胞產生的。在另一個實施方式中，人結合分子是由雜交瘤產生的，其中雜交瘤是通過從上述轉基因動物獲得的B細胞與永生化細胞融合而製備的。可以從上述轉基因非人哺乳動物獲得的B細胞、漿細胞和雜交瘤以及可以從上述轉基因哺乳動物、B細胞、漿細胞和雜交瘤獲得的人結合分子也是本發明的一部分。在進一步的方面中，本發明提供了一種鑑定特異性結合至少兩種不同的細菌生物體的結合分子(例如人結合分子，例如人單克隆抗體或其片段)或者編碼所述結合分子的核酸的方法，所述方法包括步驟(a)在適合結合的條件下，在可複製遺傳包裝體的表面上，將結合分子的收集物與第一細菌生物體接觸；(b)至少一次選擇與所述第一細菌生物體結合的可複製遺傳包裝體(replicablegeneticpackage);(c)任選地，從不結合所述第一細菌生物體的可複製遺傳包裝體分離結合所述第一細菌生物體的可複製遺傳包裝體，在適合結合的條件下，將所分離的可複製遺傳包裝體與第二細菌生物體接觸，並至少一次選擇結合第二細菌生物體的可複製遺傳包裝體；和(d)從不結合第一和/或第二細菌生物體的可複製遺傳包裝體分離並回收結合第一和/或第二細菌生物體的可複製遺傳包裝體。當然，擴展到第三以及更多細菌生物體的上述方法也是本發明的一部分。本發明的另一部分是鑑定特異性結合腸球菌種的結合分子例如人結合分子(例如人單克隆抗體或其片段)、或者編碼這類結合分子的核酸分子的方法。這類方法包括與上述相同的步驟。本文中所使用的可複製遺傳包裝體可以是原核或真核的，包括細胞、孢子、酵母、細菌、病毒、(細菌)噬菌體、核糖體和多核糖體。優選的可複製遺傳包裝體是噬菌體。結合分子，例如單鏈Fv被展示在可複製遺傳包裝體上，即它們附著到可複製遺傳包裝體外表面上的基團或分子上。可複製遺傳包裝體是可篩選單元，其包含連接到編碼結合分子的核酸分子上的待篩選的結合分子。核酸分子應當能夠在體內(例如載體)或者體外(例如通過PCR、轉錄和翻譯)複製。體內複製可以是自動的(對於細胞)，在宿主因子的輔助下(對於病毒)或者在宿主細胞和輔助病毒的輔助下(對於噬粒(phagemid))進行的。展示結合分子收集物的可複製遺傳包裝物是通過將編碼待展示外源結合分子的核酸分子引入到可複製遺傳包裝體的基因組而形成的，以形成與從可複製遺傳包裝體的外表面正常表達的內源蛋白質的融合蛋白。融合蛋白的表達、轉運到外表面以及包裝導致從可複製遺傳包裝體的外表面展示外源結合分子。可以使用活的和仍然有感染性或失活的細菌生物體進行本發明方法中的選擇步驟。可以通過本領域技術人員公知的細菌滅活方法進行細菌生物體的滅活，例如尤其是使用低pH即pH4處理6小時-21天；使用有機溶劑/去汙劑處理，即將有機溶劑和去汙劑(TritionX-100或吐溫-80)加入到細菌中；UV/光輻照；Y-射線輻照；和使用相關抗生素處理。測試細菌生物體是否仍是活的、具有感染性和/或能存活或者部分或全部失活的方法是本領域技術人員公知的。在上述方法中所使用的細菌生物體可以是未分離的，例如存在於32被感染個體的血清和/或血液中。所使用的細菌微生物也可以在適當的培養基(例如羊血瓊脂)上於37。C培養過夜後被分離為獨立的集落。在一個實施方式中，在接觸可複製遺傳包裝體時，第一和/或第二細菌生物體是在懸浮液中。或者，在發生接觸時，它們也可以偶聯到載體上。在另一個實施方式中，第一和第二細菌生物體來自不同的細菌科，例如第一細菌來自革蘭氏陰性細菌，第二細菌來自革蘭氏陽性細菌。通過這種方式可以發現能夠特異性結合革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的結合分子。第一和第二細菌生物體都可以是腸球菌。在一個實施方式中，第一和第二細菌菌株是來自相同細菌種例如腸球菌(五wferacocc"力種的不同菌株，例如糞腸球菌(Ey^cafc)和屎腸球菌(五./aec/ww)。通過這種方法，能夠發現能夠特異性結合一個種內不同菌株的種特異性結合分子。在另一個實施方式中，第一和第二細菌生物體各是不同腸球菌(5Weracoco^)種的成員，例如第一和第二腸球菌O&^raco"w勻種選自由糞腸球菌CE./aeca/z》和屎腸球菌(五./^c/"w)所組成的組。通過這種方法，能夠發現可以特異性結合一種細菌屬內的不同細菌種的結合分子。或者，可以在存在細菌生物體的碎片(例如細胞膜製備物、已經被酶處理以除去蛋白質(例如使用蛋白酶K)的細胞膜製備物、已經被酶處理以除去碳水化合物部分的細胞膜製備物(例如使用過碘酸鹽))、重組蛋白或多糖時進行選擇歩驟。在另一個實施方式中，可以在存在一種或者多種來自細菌生物體的蛋白質或(多)肽、包含這些蛋白質或(多)肽的融合蛋白質等時，進行選擇步驟。也可以將這些蛋白質的胞外暴露部分用作選擇材料。在使用之前，活的或者滅活細菌生物體或其片段可以被固定到適當的材料。或者，使用懸浮液中的活細菌或滅活的細菌。在一個實施方式中，可以對來自細菌生物體的不同材料進行選擇。例如，第一輪選擇可以對懸浮液中的活細菌或滅活細菌生物體進行，而第二輪和第三輪選擇可以分別對重組細菌蛋白質和多糖進33所構思的。在一個選擇/淘選步驟中，也可以使用不同的細菌材料。在進一步的方面中，本發明提供了在選擇步驟中所使用細菌生物體是來自細菌的相同或不同生長時期(例如延遲期、對數期、穩定期或死亡期)的方法。通過該方法，可以發現例如時期特異性的抗細菌結合分子。例如，第一細菌生物體可以是穩定期的糞腸球菌OE./^M&)，而第二細菌生物體則是對數期的糞腸球菌，或者，第一細菌生物體可以是延遲期的糞腸球菌(E/^cato)，而第二細菌生物體則是延遲期的屎腸球菌(五./a"/"rn)。其它的組合也在本領域技術人員的公知技術範圍內。在更進一步的方面中，本發明提供了獲得特異性結合至少兩種不同細菌生物體的結合分子或編碼這類結合分子的核酸分子的方法，其中該方法包括步驟a)進行上述鑑定結合分子的方法；和b)從所回收的可複製遺傳包裝體分離結合分子和/或編碼所述結合分子的核酸分子。對可複製遺傳包裝體表面上所述結合分子的收集可以是收集scFv或Fab。一旦使用上述鑑定結合分子或者編碼結合分子的核酸的方法，已經建立或鑑定了新的scFv或Fab，則可以從細菌或噬菌體分離編碼scFv或Fab的DNA，並使用標準的分子生物學技術進行組合以製備編碼二價scFv或者具有期望特異性的完整人免疫球蛋白(例如IgG、IgA或IgM)的構建體。這些構建體可以被轉染到適當的細胞系內，並可以製備完整的人單克隆抗體(參見Huls等人，1999;Bod等人，2000)。正如前面所提到的，優選的可複製遺傳包裝體是噬菌體。用於鑑定和獲得(人)結合分子(例如(人)單克隆抗體)的噬菌體展示方法目前是本領域技術人員充分建立的方法。它們被描述在例如美國專利No.5,696,108;Burton禾口Barbas，1994;deKruif等人，1995b;以及《噬菌體展示實驗室手冊》(PhageDisplay:ALaboratoryManual).編輯CFBarbas,DRBurton,JKScott禾口GJSilverman(2001)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork中。所有這些參考文獻被以其整體引入。為了構建噬菌體展示文34庫，將人單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因的收集物表達在細菌噬菌體的表面，優選絲狀噬菌體顆粒，例如以單鏈Fv(scFv)或者以Fab的形式(參見Kruif等人，1995b)。通常表達抗體片段的噬菌體的大文庫包含超過1.0*109個抗體特異性，並且可以被從免疫或者未免疫個體的B淋巴細胞中表達的免疫球蛋白V區進行組裝。在本發明具體的實施方式中，結合分子的噬菌體文庫，優選scFv噬菌體文庫是從分離自細胞的RNA製備的，其中所述細胞是從已經被針對細菌進行接種、近期被針對無關病原體進行接種、近期患有慢性或急性細菌感染(例如腸球菌感染)的個體獲得的，或者是從健康個體獲得的。可以從尤其是骨髓或外周血(優選外周血淋巴細胞)或者從分離的B細胞或者甚至從B細胞的亞群分離RNA。對象可以是被針對細菌進行接種的動物，或者患有細菌感染或者曾經患有細菌感染的動物。優選，動物是已經被針對細菌進行接種、或者患有或曾經患有慢性細菌感染或急性細菌感染的人對象。優選，所述人對象剛從細菌感染中恢復。或者，可以從已經在體外被部分組裝的免疫球蛋白可變區構建噬菌體展示文庫，以在文庫中引入額外的抗體多樣性(半合成文庫)。例如，體外組裝的可變區在對於抗體特異性重要的分子區域(例如CDR區)中含有大量合成產生的、隨機或部分隨機的DNA。可以從文庫選擇對於細菌(例如腸球菌)具有特異性的噬菌體抗體，其通過將細菌或其材料暴露於噬菌體文庫，以能夠結合表達對細菌或其材料具有特異性的抗體片段的噬菌體。通過清洗可以除去未結合的噬菌體，並將洗脫的結合噬菌體用於感染大腸桿菌(五.co")細菌和後續傳代。通常需要多輪選擇和傳代，以充分富集特異性結合細菌或其材料的噬菌體。如果需要，則在將噬菌體文庫暴露於細菌或其材料之前，可以首先通過將噬菌體文庫暴露於非目標材料(例如不同科、種和/或菌株的細菌或，者處於不同生長期的細菌或者這些細菌的物質)，將噬菌體文庫進行扣除。這些扣除細菌或其物質可以結合到固相上，或者可以在懸浮液中。也可35以對噬菌體進行選擇用於結合複合抗原，例如細菌蛋白質或(多)肽的複合混合物，其任選地被補充細菌多糖或其它細菌材料。表達一種或者多種蛋白質或(多)肽的宿主細胞(例如腸球菌)也可以用於選擇目的。使用這些宿主細胞的噬菌體展示方法可以被擴展和改進，這通過在篩選過程中加入過量的包含非目標分子或與目標類似但不一致的非目標分子而扣除不相關的結合物，進而大大提高了發現相關結合分子的機會。當然，可以在使用細菌生物體或其材料進行篩選之前、過程中或之後進行扣除。該處理被稱作Mabstract⑧處理(Mabstract⑧是CrucellHollandB.V.的註冊商標，同樣參見美國專利No.6,265,150，通過參照將其併入)。在另一個方面中，本發明提供了一種獲得結合分子的方法，其中所述結合分子潛在地針對細菌生物體(優選至少兩種不同的細菌生物體)具有殺傷活性，其中所述方法包括步驟(a)進行前述獲得特異性結合至少兩種不同細菌生物體的結合分子或編碼這類結合分子的核酸分子的方法；以及(b)確定分離的所述結合分子是否針對細菌生物體(優選針對至少兩種不同的細菌生物體)具有殺傷活性。確認結合分子是否具有殺傷活性(例如調理活性)是本領域中公知的(參見例如《分子和臨床實驗室免疫學手冊》(ManualofMolecularandClinicalLaboratoryImmunology),第7版)。在進一步的實施方式中，還對結合分子進行測試任何其它的活性。其它有用的活性是上面所提到的。在進一步的方面中，本發明涉及針對至少2種、優選至少3種或更多種不同的細菌生物體(例如腸球菌)具有殺傷活性、並且通過上述方法能夠獲得的結合分子。包含結合分子的藥物組合物也是本發明的一個方面，其中所述藥物組合物還包含至少一種藥物上可以接受的賦形劑。藥物上可以接受的賦形劑是本領域技術人員公知的。根據本發明的藥物組合物可以還包含至少一種其它的治療劑。適當的治療劑劑對於本領域技術人員也是公知的。在進一步的方面中，本發明提供了組合物，其包含至少一種本發明的結36合分子(優選人單克隆抗體)，至少一種其功能變體，至少一種本發明的免疫綴合物或其組合。此外，這些組合物可以包含尤其是穩定化分子，例如白蛋白或聚乙二醇或鹽。優選，所使用的鹽是保持結合分子所需生物活性而不會產生任何不期望毒性作用的鹽。如果必要，本發明的人結合分子可以被包覆在材料中或者包覆在材料上，以保護它們免於酸或其它可能使結合分子失活的天然或非天然條件的影響。在進一步的方面中，本發明提供了包含至少一種本發明所定義的核酸分子的組合物。這些組合物可以包含水溶液，例如含有鹽(例如NaCl或上述鹽)、去汙劑(例如SDS)和域其它適當組分的水溶液。此外，本發明涉及藥物組合物，其包含至少一種本發明的結合分子例如人單克隆抗體(或其功能片段或變體)、至少一種本發明的免疫綴合物、至少一種本發明的組合物或其組合。本發明的藥物組合物還包含至少一種藥物上可以接受的賦形劑。在一個實施方式中，藥物組合物可以包含兩種或者多種針對細菌生物體例如腸球菌(五"&racoccw)種的殺傷活性的結合分子。在一個實施方式中，這些結合分子在組合使用時表現出協同殺傷活性。換句話說，這些組合物包含至少兩種具有殺傷活性的結合分子，其特徵在於這些結合分子協同作用於殺傷細菌生物體例如腸球菌(五"ferococc^)種。本文所使用的術語"協同"的意思是在組合使用時結合分子的組合效果大於在單獨使用時它們的相加作用。協同發揮作用的結合分子可以結合所述細菌生物體的相同或不同片段上的不同結構。在一個實施方式中，在殺傷細菌生物體中協同發揮作用的結合分子也可以能夠協同殺傷其它細菌生物體。計算協同性的方法是通過組合指數。組合指數(CI)的概念己經被Chou和Talalay，1984所描述。兩種或者更多種具有協同活性的結合分子具有不同的發揮作用的模式。例如，第一結合分子可以具有調理活性，而第二結合分子具有另一種提高/增大/增強吞噬的活性，37或者第一結合分子可以具有固有(殺傷)活性，例如降低或抑制細菌生長或直接殺傷細菌，而第二結合分子提高細菌對抗生素處理的敏感性。需要理解其它的組合也是本文所期望的。本發明的藥物組合物還可以包含至少一種其它的治療、預防和/或診斷劑。優選，所述藥物組合物包含至少一種其它預防和/或治療劑。優選，所述其它治療和/或預防試劑是能夠預防和/或治療細菌(例如腸球菌感染)和/或由於這類感染所引起病症的藥劑。治療和/或預防劑包括但不限於抗菌劑。這些藥劑可以是結合分子、小分子、有機或無機化合物、酶、多聚核苷酸序列、抗微生物肽等。目前用於治療感染細菌感染(例如腸球菌感染)的患者的其它藥劑是抗生素(例如萬古黴素、壁黴素)、包含青黴素或萬古黴素和氨基糖甙或舒巴克坦的協同組合、盤尼西林(包括廣譜盤尼西林)、碳青黴烯類、大環內酯類、喹諾酮、四環素、氯黴素、達帕託黴素、利奈唑胺、奎奴普丁/達福普汀。這些可以與本發明的結合分子聯合使用。能夠預防和/或治療細菌感染或在實驗期由於這類感染所引起病症的藥劑也可以用作本發明中的其它治療和/或預防劑。在用於人之前，能夠在適當的動物模型系統中對本發明的結合分子或藥物組合物進行測試。這些動物模型系統包括但不限於鼠敗血症和腹膜炎模型、大鼠敗血症和心內膜炎模型和兔心內膜炎模型。通常，在製造和儲存條件下，藥物組合物必須是無菌和穩定的。本發明的結合分子、免疫綴合物、核酸分子或組合物能夠是以粉末形式用於在傳輸之前或傳輸時，在適當的藥物上可以接受的賦形劑內重建。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液的情況中，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)，其產生活性成分加來自之前其無菌過濾溶液的任何額外所需成分的粉末。或者，本發明的結合分子、免疫綴合物、核酸分子或組合物可以是在溶38液中，並且可以加入適當的藥物上可以接受的賦形劑，並且/或者在傳輸之前或傳輸時進行混合以提供單位劑量的可注射形式。優選，在本發明中所使用的藥物上可以接受的賦形劑是適合高藥物濃度，並且能夠維持適當的流動性，並且如果必要則能夠延遲吸收。藥物組合物最佳給藥路線的選擇將受到許多因素的影響，包括組合物內活性分子的物理化學性質、臨床情況的緊急性和活性分子的血漿濃度與期望治療效果的關係。例如，如果必要，本發明的結合分子能夠通過使用保護結合分子免於快速釋放的載體製備，例如控釋配方，包括植入物、透皮貼劑和微囊遞送系統。尤其可以使用生物可降解、生物兼容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。此外，可以必要的是將結合分子包覆或共同給藥預防人結合分子失活的材料或化合物。例如，可以在適當的載體中(例如脂質體或稀釋劑中)為對象給藥結合分子。給藥的路線可以分成主要兩類，口服和經腸胃外給藥。優選的給藥路線是靜脈內給藥。口服劑型可以被配製為例如藥片、片齊!」、錠劑、水懸浮液或油懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳劑、硬膠囊、軟明膠膠囊、糖漿或酏劑、藥丸、糖衣丸、液體、凝膠或眾液。這些製劑可以包含藥物上可以接受的賦形劑(包括但不限於惰性稀釋劑)、粒化劑和崩解劑、粘結劑、潤滑劑、防腐劑、著色劑、調味劑或甜味劑、植物油或礦物油、溼潤劑和增稠劑。本發明的藥物組合物還可以被配製成用於腸胃外給藥。用於腸胃外給藥的製劑可以是尤其是含水或不含水等滲無菌無毒注射或灌注溶液或懸浮液的形式。這些溶液或懸浮液可以包含以所採用的劑量和濃度對受體無毒的試劑，例如l，3-丁二醇、Ringer氏溶液、Hank氏溶液、等滲氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部麻醉劑、防腐劑、緩衝液、粘性或溶解性提高劑、水溶性抗氧化劑、油溶性抗氧化劑和金屬螯合劑。在進一步的方面中，本發明的結合分子例如人單克隆抗體(其功能片段和變體)、免疫綴合物、組合物或藥物組合物可以被用作藥物。因此，使用本發明結合分子、免疫綴合物、組合物或藥物組合物治療和/或預防細菌(革蘭氏陽性和域革蘭氏陰性)例如腸球菌感染的方法是本發明的另一部分。上述分子能夠尤其是被用於細菌感染的診斷、預防、治療或其組合。腸球菌所引起的重要臨床感染包括但不限於尿道感染、腹內感染、骨盆和軟組織感染菌血症、細菌型心內膜炎、憩室炎、腦膜炎、腹膜炎、骨髓炎、敗血性關節炎、膿腫、傷口感染和肺炎。它們適合治療還未接受治療的患有細菌感染的患者，以及己經接受過細菌感染治療或者正在接受細菌感染治療的患者。它們可以用於患者例如住院的嬰兒、早產兒、燒傷患者、年長的患者、免疫受損患者例如接受化療的患者、免疫抑制患者例如接受器官移植的患者、免疫缺陷患者、進行侵入式過程的患者以及衛生保健工人。每次給藥可以保護免於細菌生物體進一步感染持續高達3或4周，並且/或者將延遲與感染相關症狀的開始或進展。本發明的結合分子還可以提高現有抗生素治療的有效性，其通過提高細菌對抗生素的敏感性，可以刺激免疫系統通過調理素以外的方式攻擊細菌。這種激活可以導致長時間針對感染細菌的持續保護。此外，本發明的結合分子可以直接抑制細菌的生長，或者抑制感染過程中細菌存活所必需的毒力因子。上述分子或組合物可以結合其它診斷、預防和/或治療的其它分子而被採用。它們可以在體外、先體外後體內或體內應用。例如，本發明的結合分子如人單克隆抗體(或其功能變體)、免疫綴合物、組合物或藥物組合物可以與針對細菌生物體的疫苗(如果可利用)共同給藥。或者，也可以在給藥本發明的分子之前或者之後給藥所述疫苗。抗細菌劑還可以代替疫苗結合本發明的結合分子而被採用。適當的抗細菌劑是上面所提到的。通常以治療或診斷有效量在本發明的組合物和藥物組合物中配製這些40分子。或者，它們可以被分別配製和給藥。例如，可以全身性施用其它分子如抗細菌劑，而本發明的結合分子可以被鞘內或心室內施用。可以調整給藥方案以提供最佳的期望應答(例如治療應答)。適當的劑量範圍可以是例如0.1-100mg/kg體重，優選0.5-15mg/kg體重。此外，例如，可以給藥單次大丸劑，一段時間內可以給藥多次分開的劑量，或者可以優先根據治療狀況的危急情況所顯示的降低或提高劑量。優選，本發明的分子和組合物是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法是本領域中公知的。以與為本發明結合分子所設計相似的給藥方案給藥可以用於診斷、預防和/或治療的其它分子。如果單獨給藥其它分子，則它們可以在給藥患者本發明的一種或者多種人結合分子或藥物組合物之前(例如之前2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、4小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)，同時或者之後(例如之後2分鐘、5分鐘、IO分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、4小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)。通常在人類患者的臨床實驗中選擇出確切的給藥方案。在作為體內治療劑為人類給藥時，人結合分子和包含人結合分子的藥物組合物是特別有用的，並且通常是優選的，因為針對所給藥該抗體的受體免疫應答通常遠遠低於給藥單克隆鼠、嵌合或人源化結合分子所引起的免疫應答。另一方面，本發明涉及本發明的結合分子例如殺傷人單克隆抗體(其功能片段和變體)、免疫綴合物、核酸分子、組合物或藥物組合物在製備用於細菌(革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性)例如腸球菌感染的診斷、預防、治療或其組合的藥物中的應用。41之後，包含本發明的至少一種結合分子例如殺傷人單克隆抗體(其功能片段和變體)、至少一種免疫綴合物、至少一種核酸分子、至少一種組合物、至少一種藥物組合物、至少一種載體、至少一種宿主或其組合的試劑盒也是本發明的一部分。任選地，上述本發明的試劑盒的組分被包裝在適當的容器中，並標記，用於診斷、預防和/或治療指定的病症。上述組份可以被存儲在單位或多劑量容器中作為水溶液優選無菌水溶液，或者作為凍幹製劑優選無菌凍幹製劑用於重建。這些容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑料，並且可以具有無菌的存取口(例如該容器可以是具有皮下注射針頭能夠刺穿的塞子的靜脈溶液包或者小瓶)。試劑盒還可以包含更多的容器，其包含藥物上可以接受的緩衝液。還可以包括從商業和使用者角度優選的其它材料，包括其它緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器、一種或者多種適當宿主的培養基，並且可能包含甚至至少一種其它的治療、預防或診斷劑。與試劑盒相關，在治療、預防或診斷產品的商業包裝盒中通常可以包含說明書，其包含關於例如適應症、用法、劑量、製造、給藥、禁忌症和/或關於這些治療、預防或診斷產品的警告的信息。本發明的結合分子還可以用於包覆醫療設備或聚合物生物材料。本發明還涉及一種檢測樣品中細菌生物體(革蘭氏陽性和域革蘭氏陰性)的方法，其中該方法包括步驟(a)將樣品與診斷有效量的本發明結合分子(其功能片段和變體)或免疫綴合物接觸；和(b)確定所述結合分子或免疫綴合物是否特異性結合樣品的分子。優選，所述方法用於檢測樣品中的腸球菌C&7feraCOCCW"。該樣品可以是生物樣品包括但不限於來自被(潛在地)感染對象的血液、血清、尿液、組織或其它生物材料，或非生物樣品例如水、飲料等。被(潛在地)感染對象可以是人對象，但也可以是懷疑是這類細菌生物體攜帶者的動物，其中可以使用本發明的人結合分子或免疫綴合物測試所述細菌生物體的存在。可以首先對樣品進行操作，以使其更適合檢測的方法。操42作的意思尤其是對懷疑含有和/或含有細菌生物體的樣品以使得生物體分解成抗原組分例如蛋白質、(多)肽或其它抗原片段的方式進行處理。優選，在能夠在人結合分子和樣品中可能存在的細菌生物體或其抗原組分之間形成免疫複合物的條件下，將本發明的人結合分子或免疫綴合物與樣品接觸。接著通過適當的方法檢測並測量免疫複合物的形成，如果有的話，說明樣品中存在細菌生物體。這些方法包括尤其是同源和異源結合免疫測定例如放射性免疫測定(RIA)、ELISA、免疫螢光、免疫組織化學、FACS、BIACORE和Western印跡分析。優選的測定技術，特別是用於大規模臨床篩選患者血清和血液以及血液衍生產品的測定技術是ELISA和Western印跡技術。ELISA測試是特別優選的。為了用作這些測定中的試劑，本發明的結合分子或免疫綴合物被便利地結合到微孔板的內表面。本發明的結合分子或免疫綴合物可以直接結合到微孔板的內表面。然而，在加入本發明的結合分子或免疫綴合物之前，通過使用聚賴氨酸對孔進行預處理，可以達到本發明結合分子或免疫綴合物與孔的最大結合。此外，通過已知的方法，本發明的結合分子或免疫綴合物可以共價附著到孔上。通常，結合分子或免疫綴合物以0.01-100昭/ml的量用於塗敷，儘管也可以使用更高或者更低的量。接著，將樣品加入到塗有本發明結合分子或免疫綴合物的孔中。此外，本發明的結合分子可以用於鑑定細菌生物體例如腸球菌C&7feracoccw)的特異性結合結構。所述結合結構可以是蛋白質和/或多肽上的抗原決定基。它們能夠是線性的，也可以是結構和/或構型的。在一個實施方式中，可以通過PEPSCAN分析來分析結合結構(參見尤其是WO84/03564，WO93/09872,Slootstra等人，1996)。或者，包含來自細菌生物體的肽的隨機肽文庫可以被篩選能夠結合本發明結合分子的肽。所發現的結合結構/肽/抗原決定基可以用作疫苗，並用於診斷細菌感染。一旦蛋白質和/或多肽以外43的片段被結合分子結合，則可以通過質譜、高效液相色譜和核磁共振對結合結構進行鑑定。在進一步的方面中，本發明提供了一種對結合分子(或其功能片段或變體)進行篩選的方法，所述結合分子特異性結合與本發明的人結合分子所結合的抗原決定基相同的細菌生物體(革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性)如腸球菌C&7&rao)ccw"的抗原決定基，其中該方法包括步驟(a)將待篩選的結合分子、本發明的結合分子和細菌生物體或其片段接觸；(b)測量所篩選的結合分子是否能夠與本發明結合分子競爭與細菌生物體或其片段的特異性結合。在進一步的步驟中，可以確定能夠競爭與細菌生物體或其片段競爭特異性結合的所篩選結合分子是否具有殺傷活性例如調理活性。能夠與本發明的結合分子競爭與細菌生物體或其片段特異性結合的結合分子是本發明的另一部分。在上述的篩選方法中，"特異性結合相同的抗原決定基"還涉及特異性結合與本發明結合分子所結合抗原決定基實質上或基本上相同的抗原決定基。阻斷或者與本發明的結合分子競爭和細菌生物體結合的能力表明所篩選的結合分子結合細菌生物體上的抗原決定基或結合位點，其中所述細菌生物體上的抗原決定基或結合位點與本發明的結合分子所免疫特異性識別的細菌生物體上的結合位點結構上重疊。或者，這可以說明待篩選的結合分子結合與本發明的結合位點所免疫特異性識別的結合位點充分臨近的抗原決定基或者結合位點，以立體地或者以其它方式抑制本發明的結合分子與細菌生物體的結合。通常，通過抗原組合物即包含細菌生物體或其片段的組合物與參照結合分子即本發明的結合分子、以及待篩選的結合分子混合的測定，對競爭抑制進行檢測。通常待篩選的結合分子是過量存在的。基於ELISA和Western印跡的方案適合用於這些簡單的競爭性研究。通過使用種或同種型二抗，人們能夠僅檢測結合的參照結合分子，識別實質上相同抗原決定基的待篩選結合44分子的存在會降低其結合。在參照結合分子和任何待篩選結合分子(與種或亞型無關)之間進行結合分子競爭研究時，人們可以首先使用可檢測標記(例如生物素、酶、放射性或其它標記)對參照結合分子進行標記，以能夠進行後續鑑定。這些競爭測定所鑑定的結合分子("競爭結合分子"或"交叉反應結合分子")包括但不限於結合參照結合分子(即本發明的結合分子)所結合的抗原決定基或結合位點的抗體、抗體片段和其它結合劑，以及結合與參照結合分子所結合的抗原決定簇或結合位點充分臨近的抗原決定簇或結合位點的抗體、抗體片段和其它結合劑，用於發生待篩選的結合分子與參照結合分子之間的競爭結合。優選，本發明的競爭結合分子在過量存在時會抑制參照結合分子與所選擇目標種的特異性結合至少10%，優選至少25%，更優選至少50%，最優選至少75%-90%，或者甚至更高。鑑定與本發明的結合分子結合大約、實質上、基本上或者相同抗原決定基的一種或者多種競爭結合分子是簡單的技術問題。由於競爭結合分子的鑑定是通過與參照結合分子即本發明的結合分子相比確定的，因此可以理解實際上不總是需要確定參照結合分子結合以及競爭結合分子結合的抗原決定基來鑑定競爭結合分子，所述競爭分子結合與參照結合分子相同或基本上相同的抗原決定基。實施例為了描述本發明，提供下列實施例。這些實施例不是為了以任何方式限制本發明的範圍。實施例1便^^(併沐提欲遊iA^溝達^Fv蠻蘑沐展示文,賴於#透源遝活絲從年齡在25-50歲的報告最近革蘭氏陽性細菌感染的供體以及健康成人提取血液樣品。通過離心分離外周血白細胞，並將血清在-80'C下保存和冷45凍。使用調理吞噬殺傷測定(Huebner等人，1999)對供體血清篩選殺傷活性，並與正常兔血清進行比較。選擇來自吞噬活性高於正常血清的供者的血清用於產生噬菌體展示文庫。使用有機相分離和後續的乙醇沉澱從這些供體的外周血白細胞製備總RNA。將所得到的RNA溶解在無RNA酶的水中，並通過OD260nm檢測確定其濃度。之後，將RNA溶解成lOOng/pl的濃度。下一步，如下，將1嗎RNA轉化成cDNA:向lOpd總RNA中，加入13|ilDEPC-處理的超純水和1^1隨機六聚體(500ng/nl)，並在65'C加熱獲得的混合物5分鐘，並快速在溼冰上進行冷卻。接著，向混合物中加入8)il5X第一鏈緩衝液，2|ildNTP(均為10mM)、2jJDTT(O.lM)、2^1RNA酶抑制劑(40U/pl)和2^SuperscriptIIIMMLV反轉錄酶(200U/pl)，在室溫下溫育5分鐘，並在5(TC下溫育1小時。通過熱失活終止該反應，即在75'C下溫育混合物15分鐘。使用DEPC處理的超純水將所獲得的cDNA產品稀釋成20(^1的終體積。將所獲得cDNA產品稀釋液的50倍稀釋溶液(在10mMTris緩衝液)的OD260nm用於確定cDNA濃度。對於每個供體，使用5-10(xl稀釋的cDNA產品作為使用特異性寡聚核苷酸PCR擴增免疫球蛋白Y重鏈家族和ic或入輕鏈序列的模板引物(參見表1-7)。另外，對於一個供體，進行免疫球蛋白^重鏈家族和k或、輕鏈序列的PCR擴增。在50^1終體積的20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、1.5mMMgCl2、250pMdNTP和1.25單位Taq聚合酶中，除了稀釋的cDNA產物外，PCR反應混合物還包含25pmo1正義引物和25pmol反義引物。在溫度為96'C的熱蓋熱循環儀中，將所得到的混合物快速熔化2分鐘，接著進行30個下列的循環在96'C下30秒，在55i:或60°C下30秒，在72。C下60秒。最後，將樣品在72。C下溫育10分鐘，並冷藏在4'C下直到以後使用。在第一輪擴增中，將18種輕鏈可變區正義引物(12種用於？i輕鏈(參見表1;在使用之前將HuVLlA-Back、HuVLIB-Back和HuVL1C-Back正義46引物混合成等摩爾，以及HuVL9-Back和HuVLlO-Back正義引物)，6種用於k輕鏈(參見表2))的每一種與反義引物組合，其中所述反義引物識別C-k恆定區被稱作HuCK-FOR5'-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3，(參見SEQIDNO:121)或C-人恆定區HuCL2隱FOR5，-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3,(參見SEQIDNO:122)和HuCL7-FOR5，-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3，(參見SEQIDNO:123)(在使用之前，將HuCL2-FOR和HuCL7-FOR反義引物混合成等摩爾)，這得到了15種大約650鹼基對的產品。在瓊脂糖凝膠上純化，並使用Qiagen凝膠提取柱從凝膠分離這些產物。將1/10的每種分離的產物用於與上述同樣的PCR反應中，其使用18種正義引物，這樣將每種X輕鏈正義引物與三種K區特異性反義引物的一種進行組合，並將每種k輕鏈正義引物與五種區特異性反義引物(參見表3;在使用之前將HuVLlA-Back-SAL、HuVLIB-Back-SAL和HuVLlC-Back-SAL正義引物混合成等摩爾，以及HuVL9-Back-SAL和HuVL10-Back-SAL正義引物)的一種組合。在第二輪擴增中所使用正義引物是與在第一輪擴增中所使用的引物相同的引物，但延伸有限制位點(參見表3)，以能夠在噬菌體展示載體PDV-C06中定向克隆(參見SEQIDNO:124)。這得到了57種大約400鹼基對的產物，其匯集成如圖4所示，以維持文庫內不同J區段和輕鏈家族的天然分布，並且不會過分體現或者不能充分體現某些家族。使用QiagenPCR純化柱純化所匯集的產物。在下一步中，使用Sail和Notl將3嗎匯集的產物和100jigPDV-C06載體進行消化，並從凝膠上進行純化。之後如下在16"進行連接過夜。向500ngPDV-C06載體中加入35ng、70ng或140ng匯集的產物，總體積為50pl連接混合物，其包含50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、10mMDTT、lmMATP、25昭/mlBSA和2.5^1T4DNA連接酶(400U/V1)。通過苯酚/氯仿萃取，接著氯仿萃取和乙醇沉澱純化連接混合物，這些方法是本領域技術人員公知的。將所獲得的DNA溶解在50^110mM47Tris-HClpH8.5中，並根據製造商的用戶手冊(Stratagene)將每種連接混合物或者2jil電穿孔入40^1TGI感受態大腸桿菌(Eco//)。在37。C下，將轉化體培養在被補充50pg/ml青黴素和4.5%葡萄糖的2TY瓊脂上過夜。對集落進行計數以確定插入比例的最佳載體。如上從最佳比例的連接混合物，將多份^l或者2pl進行電穿孔，並將轉化體在37"C下培養過夜，通常產生大約107個集落。通過從瓊脂平板上刮轉化體，獲得輕鏈可變區的(子)文庫。直接將該(子)文庫用於使用QiagenTMQIAFilterMAXIprep試劑盒進行質粒DNA製備。以與前面對輕鏈區所描述的相似兩輪PCR程序和相同的反應參數，從相同的cDNA製備物擴增重鏈免疫球蛋白序列，前提是使用在表5和6中所列的引物。使用一組八種正義方向的引物(參見表5;在使用之前，HuVHlB/7A-Back和HuVHlC-Back正義引物被混合成等摩爾)進行第一輪擴增，其中每種引物均與被稱作HuCIgG的IgG特異性恆定區反義引物5'-GTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT-3'(SEQIDNO:125)組合，這產生了7種大約650鹼基對的產物。對於一個供體，使用被稱作HuCIgM的IgM特異性恆定區反義引物5'-TGGAAGAGGCACGTTCTTTTCTTT-3'(SEQIDNO:126)代替引物HuCIgG。在瓊脂糖凝膠上純化，並使用Qiagen凝膠提取柱從凝膠分離這些產物。將1/10的每種分離的產物用於與上述同樣的PCR反應中，其使用8種正義引物，這樣每種重鏈正義引物與四種JH區特異性反義引物(參見表6;在使用之間，將HuVHlB/7A-Back-Sfi和HuVHlC-Back-Sfi正義引物混合成等摩爾)之一組合。在第二輪中所使用的正義引物與第一輪擴增所使用的引物相同，但延伸有限制位點(參見表6)，以能夠在輕鏈(亞)文庫載體中定向克隆。這得到了28種大約400鹼基對的產物，並匯集如表7所示以維持文庫內不同J區段和重鏈家族的天然分布，並且不會過分體現或者不能充分體現某些家族。使用QiagenPCR純化柱純化48所匯集的產物。接著使用Sfil和Xhol對3嗎純化的產物進行消化，並使用與上面對輕鏈(亞)文庫所描述的相同連接程序和體積，連接在也被相同限制性酶切割的輕鏈(亞)文庫載體中。根據以上對輕鏈(子)文庫所描述的，也進行連接混合物純化和所得到最後文庫的後續轉化。所有細菌，通常大約io7個，被收穫在2TY培養基中，其包含50(ig/ml青黴素和4.5%葡萄糖，並與甘油混合成15(v/v)%，在-8(TC冷凍成1.5ml—份。根據下面所描述的進行每個文庫的回收和選擇。各種文庫被命名為GPB-05-M01、GPB-05-G01、GPB-05-G02、GPB-05-G03、GPB-05-G04和GPB-05-G05。根據之前在國際專利申請WO2005/118644中所描述的，使用與上述程序類似的方法構建另外兩個文庫RAB-03-G01和RAB-04-G01。實施例2便厲A記憶5激應凝攻遊i^4廬廣沐展示t庫從正常健康供體、康復中的供體或者被接種的供體，通過靜脈穿刺使用EDTA抗凝血試管收集外周血。使用PBS將血液樣品(45ml)稀釋兩次，並將每份30ml置於10mlFico11-Hypaque(Pharmacia)之下，並在900xg，室溫下無停頓地離心20分鐘。小心地除去上清液至剛好在包含淋巴細胞和血小板部分的上方。下一步，小心取出該層(大約10ml)，並轉移到新的50ml管中，使用40mlPBS清洗3次，在室溫下400xg離心10分鐘以除去血小板。將所得到的包含淋巴細胞的沉澱重懸浮在包含2%PBS的RPMI培養基中，並通過細胞計數來確定細胞數目。使用CD24、CD27和表面IgM作為分離轉換記憶B細胞和IgM記憶B細胞的標記物，對大約1X1S個淋巴細胞染色進行螢光細胞分選。野外模式(YieldMold)的BectonDickinsonDigitalVantage設備組被用於物理記憶B細胞分選和分離。淋巴細胞被限制為來自FSC/SSC窗口的小緊密群。接著從原始B細胞(CD24+ZCD27-)和記憶T細胞(CD24-ZCD27+)分離記憶B細胞(CD24+ZCD27+)。在下一步中，通過使用IgM表達，IgM記憶B細胞(IgM+)被從轉換記憶B細胞(IgM-)分離。在該步驟中，IgM記憶B細胞和轉換記憶B細胞被分選在分開的樣品試管中。將每群的lxlS-lxl(^個細胞收集在DMEM/50^FBS中，在完成分選之後，它們均被在400xg下離心10分鐘。接著根據實施例1所描述的方法，將所分選的IgM記憶B細胞用作構建文庫的起始材料，其在第一輪擴增重鏈免疫球蛋白序列中使用引物HuCIgM。各種文庫被命名為MEM-05-M01、MEM-05-M02、MEM-05-M03、MEM-05-M04、MEM-05-M05、MEM_05-M06、MEM-05-M07、MEM-05-M08、MEM-05-M09和MEM畫05-M10。實施例3遂荼潔帶錄弄絲錄^應球慮遊卓鍩i^^虔遊鑕蘑沐使用抗體噬菌體展示文庫、通常的噬菌體展示技術以及MAbstract⑧技術對抗體片段進行選擇，其主要描述在美國專利No.6,265,150和描述在WO98/15833中(均作為參照被併入本文)。所使用的抗體噬菌體文庫是根據實施例1所描述製備的篩選的供體文庫，以及根據實施例2所描述製備的IgM記憶文庫。在WO02/103012(通過參照併入本文)所描述的方法和輔助噬菌體被用於本發明。為了鑑定識別腸球菌的噬菌體抗體，使用懸浮液中的活細菌或者被固定在免疫管中的細菌進行噬菌體選擇實驗。所使用的菌株被描述在表8中。從選擇中分離所有的噬菌體抗體，其中在至少一個步驟中，使用懸浮液中的糞腸球菌(￡./^^//力12030。開始使用固定的糞腸球菌(五./"eca&)12030從選擇中分離被稱作SC05-159和SC05-166的抗體，但後面也用懸浮液中的糞腸球菌(五./"ec"/的12030進行分離。如下進行使用懸浮液中細菌的選擇。將細菌在37。C下培養在血瓊脂平板上過夜，並刮進包含2%BSA或2%ELK的PBS中，濃度為5xl(^個細菌/ml，50在室溫下溫育30分鐘。在封閉緩衝液(PBS中的2°/。ELK或2。/。BSA)對一份噬菌體文庫(大約1013cfti，使用CT輔助噬菌體進行擴增的(參見WO02/103012))在室溫下封閉0.5-2小時。將被封閉的噬菌體文庫加入到被封閉的細菌懸浮液中得到lml的總體積，並在室溫下直立轉子(end-over-endrotor)(5rpm)中溫育2小時。在室溫下對懸浮液以6800xg離心3分鐘，並棄掉上清液。使用包含0.05(v/v)。/。吐溫-20的緩衝液對細菌清洗3-8次，接著使用封閉緩衝液3-8次，以除去未結合的噬菌體。通過與lml0.1M的三乙胺在室溫下直立轉子(5rpm)中溫育7分鐘，將結合的噬菌體從抗原洗脫。在室溫下將懸浮液在1700xg下離心3分鐘，接著將上清液與0.5ml1M的Tris-HClpH7.5混合以中和pH。將該混合物用於感染5ml己經在37'C生長到OD600nm為大約0.3的XL1-Blue大腸桿菌(五.coZ/)培養物。接著，在室溫下3200xg將混合物離心10分鐘，並將細菌沉澱重懸浮在0.5ml2-胰蛋白腖酵母提取物(2TY)培養基中。將所得到的細菌懸浮液分在兩塊補充四環素、青黴素和葡萄糖的2TY瓊脂平板上。在37。C將平板溫育過夜之後，從平板上刮下集落並用於製備富集的噬菌體文庫，基本上是根據DeKruif等人(1995a)和WO02/103012所描述的。簡言之，將刮下的細菌用於接種包含青黴素、四環素和葡萄糖的2TY培養基，並在37"C下培養成OD600nm為大約0.3。加入CT輔助噬菌體，並使其感染細菌，之後，將培養基換為包含青黴素、四環素和卡那黴素的2TY。在3(TC下繼續溫育過夜。第二天，通過離心從2TY培養基除去細菌，之後，使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl將培養基中的噬菌體沉澱。最後，將噬菌體溶解在2ml具有P/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，過濾除菌，並用於下一輪選擇。如下進行使用固定在免疫管中的細菌的選擇。將細菌在37。C在血瓊脂平板上培養過夜，並刮進碳酸鹽緩衝液內，濃度為5xl(f個細菌/ml。將2ml加入到MaxiSorpNunc-ImmunoTube(Nunc)中，並在4。C下直立轉子(5rpm)內溫育過夜。倒空試管，並使用PBS清洗3次。將該管和一份噬菌體文庫(大約1013cfb，使用CT輔助噬菌體進行擴增的(參見WO02/103012))室溫下在封閉緩衝液(PBS中2%ELK、2%BSA或1。/。補體素(Protifar))中進行封閉0.5-2小時。倒空管，並加入封閉的噬菌體文庫，將試管在室溫下直立轉子(5rpm)內溫育2小時。使用包含0.1(v/v)。/。吐溫-20的PBS清洗5-15次，接著使用PBS5-15次以除去未結合的噬菌體。通過在室溫下直立轉子(5rpm)內與1.5ml的0.1M三乙胺或50mM甘氨酸-HCl，pH2.2溫育10分鐘，將結合的噬菌體從抗原洗脫。將所洗脫的噬菌體與0.5ml1MTris-HClpH7.5混合以中和pH。根據上面對使用懸浮液中細菌進行選擇的描述，進行後續侵染XL1-Blue大腸桿菌(E"//)，以及製備富集的噬菌體文庫。通常，在分離單獨噬菌體抗體之前，進行兩輪選擇。可以對相同的細菌菌株進行兩次選擇，或者可以順序使用不同的菌株。在第二輪選擇之後，將單獨的大腸桿菌(五.co/Z)集落用於製備單克隆噬菌體抗體。基本上，將單獨的集落培養到對數期，並使用CT或VCSM13輔助噬菌體進行感染，之後進行噬菌體抗體生產過夜。對所產生的噬菌體抗體進行PEG/NaCl-沉澱和過濾除菌，並在ELISA中進行測試與根據前述所製備腸球菌(五"teracoccw)的結合。實施例4厲微特灘辨微朦微鵬緣"在ELISA中對上述篩選中所獲得的被選擇單鏈噬菌體抗體確認腸球菌的特異性結合活性，g卩，結合根據前述所製備一種或者多種腸球菌菌株的結合活性。將在50(^150mM碳酸鹽緩衝液，pH9.6中的2.5xlS個細菌塗布到MaXiSorpTMELISA平板上過夜。作為陰性對照，塗布均在PBS(pH7.4)中的複合抗原2%ELK和1%BSA。使用含有0.1(v/v)。/。吐溫-20的PBS對孔進行清洗，並使用含有2%ELK的300plPBS在室溫下封閉至少一個小時。將所52選擇的單鏈噬菌體抗體在等體積含有2%ELK的PBS中溫育15分鐘，以獲得封閉的噬菌體抗體。將平板倒空，並向孔中加入封閉的單鏈噬菌體抗體。在室溫下進行溫育1小時，並在含有0.1(v/v)n/。吐溫-20的PBS對平板進行清洗，使用偶聯到過氧化物酶的抗M13抗體檢測結合的噬菌體抗體。使用光譜儀檢測492nm處的吸收。作為對照，同時進行相同的程序，而不是用單鏈噬菌體抗體，陰性對照是針對西尼羅病毒包膜蛋白(SC04-374)的單鏈噬菌體抗體。如表9所示，所選擇被稱作SC05-140、SC05-157、SC05-159、SC05-166、SC05-179、SC05-187、SC06掘、SC06-043、SC06-049、SC06-050、SC06-071、SC06-077、SC06畫078、SC06-079、SC06-086、SC06-087、SC06-089、SC06-092、SC06-191、SC06-195、SC06-198、SC06-241、SC06-242、SC06-246、SC06-252、SC06-388、SC06-389、SC06-396、SC06-402、SC06-409、SC06-415、SC06-421、SC06-429和SC06-432的噬菌體抗體特異性結合糞腸球菌(五./aecafc)12030。除了SC05-140和SC06-421之外，所選定的噬菌體抗體都不展示與陰性對照抗原ELK和BSA的任何可檢測結合。實施例5應微淳雜"Fv遊鑑定從所選擇特異性單鏈噬菌體抗體(scFv)克隆質粒DNA，並根據標準技術確定核苷酸序列。被稱作SC05-140、SC05-157、SC05-159、SC05-166、SC05-179、SC05-187、SC06掘、SC06-043、SC06-049、SC05-050、SCO6-071、SC06-077、SC06-078、SC06-079、SC06-086、SC06-087、SC06-089、SC06-092、SC06-191、SC06-195、SC06-198、SC06-241、SC06畫242、SC06-246、SC06-252、SC06-388、SC06-389、SC06畫396、SC06-402、SC06畫409、SC06-415、SC06-421、SC06-429和SC06-432的scFv的核苷酸序列(包括用於克隆的限制位點)分別被顯示在SEQIDNO:350、SEQIDNO:352、SEQIDNO:61、53SEQIDNO:63、SEQIDNO:354、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:356、SEQIDNO:73、SEQIDNO:358、SEQIDNO:75、SEQIDNO:360、SEQIDNO:362、SEQIDNO:206、SEQIDNO:208、SEQIDNO:364、SEQIDNO:366、SEQIDNO:368、SEQIDNO:370、SEQIDNO:77、SEQIDNO:372、SEQIDNO:374、SEQIDNO:79、SEQIDNO:376、SEQIDNO:378、SEQIDNO:380、SEQIDNO:382、SEQIDNO:384、SEQIDNO:386、SEQIDNO:388、SEQIDNO:390和SEQIDNO:392中。被稱作SC05畫140、SC05-157、SC05-159、SC05-166、SC05-179、SC05-187、SC06-016、SC06-043、SC06-049、SC05-050、SC06-071、SC06-077、SC06-078、SC06-079、SC06-086、SC06-087、SC06-089、SC06-092、SC06畫191、SC06-195、SC06-198、SC06-241、SC06-242、SC06畫246、SC06-252、SC06-388、SC06-389、SC06-396、SC06-402、SC06-409、SC06-415、SC06-421、SC06-429和SC06-432的scFv的胺基酸序列被分別顯示在SEQIDNO:351、SEQIDNO:353、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:355、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:357、SEQIDNO:74、SEQIDNO:359、SEQIDNO:76、SEQIDNO:361、SEQIDNO:363、SEQIDNO:207、SEQIDNO:209、SEQIDNO:365、SEQIDNO:367、SEQIDNO:369、SEQIDNO:371、SEQIDNO:78、SEQIDNO:373、SEQIDNO:375、SEQIDNO:80、SEQIDNO:377、SEQIDNO:379、SEQIDNO:381、SEQIDNO:383、SEQIDNO:385、SEQIDNO:387、SEQIDNO:389、SEQIDNO:391禾QSEQIDNO:393中。表10和11分別顯示了特異性結合腸球菌的scFv的VH和VL基因相同性(參見TomlinsonIM，WilliamsSC,IgnatovitchO,CorbettSJ,WinterG,V-BASES叫uenceDirectory.CambridgeUnitedKingdom:MRCCentreforProteinEngineering(1997))禾口CDR序列。實施例6A歷遂雍遊貧厲球蘑卓鏈Fv賴建全乂^疫球歪^分齊乂卓克廣貧應球蘑貧鉤通過限制性消化，被稱作SC05-140、SC05-157、SC05-159、SC05-166、SC05-179、SC05-187、SC06-016、SC06-043、SC06-049、SC05-050、SC06-071、SC06-077、SC06-078、SC06-079、SC06畫086、SC06-087、SC06-089、SC06-092、SC06-191、SC06-195、SC06-198、SC06-241、SC06-242、SC06-246、SC06-252、SC06-388、SC06-389、SC06-396、SC06-402、SC06-409、SC06-415、SC06-421、SC06-429和SC06-432的scFv的重鏈和輕鏈可變區被直接克隆，在IgG表達載體pig-C91l-HCyl(參見SEQIDNO:127)、plg-C909-Oc(參見SEQIDNO:128)和pIg-C910-CX(參見SEQIDNO:129)中表達。通過使用酶SfiI和XhoI的限制性酶切，將被稱作SC05-140、SC05-157、SC05-159、SC05畫166、SC05-179、SC05-187、SC06-016、SC06-043、SC06-049、SC05-050、SC06-071、SC06-077、SC06-078、SC06-079、SC06陽086、SC06-087、SC06-089、SC06-092、SC06-191、SC06-195、SC06-198、SC06-241、SC06-242、SC06-246、SC06-252、SC06-388、SC06畫389、SC06-396、SC06-402、SC06-409、SC06-415、SC06-421、SC06-429和SC06-432的scFv的重鏈可變區克隆到載體pIg-C911-HCYl中。通過使用酶SalI、Xhol和Notl的限制性消化，將被稱作SC06-016、SC06-050、SC06-077、SC06-086、SC06-191、SC06-241、SC06-396和SC06-429的scFv的輕鏈可變區克隆到載體plg-C909-Cic中。通過使用酶Sall、Xhol和Notl的限制性消化，將被稱作SC05-140、SC05-157、SC05陽159、SC05-166、SC05-179、SC05-187、SC06陽043、SC06-049、SC06-071、SC06-078、SC06-079、SC06-087、SC06畫089、SC06-092、SC06-195、SC06-198、55SC06-242、SC06-246、SC06畫252、SC06-388、SC06-389、SC06-402、SC06-409、SC06-415、SC06-421禾nSC06-432的scFv的輕鏈可變區克隆到載體plg-C910-C人中。之後，根據本領域技術人員已知的標準方法對核苷酸序列進行確認。將所得到的編碼抗腸球菌人IgGl重鏈的表達pgG105-140C911、pgG105畫157C911、pgG105-159C911、pgG105-166C911、pgG105-179C9U、pgG105-187C911、pgG106-016C911、pgG106-043C911、pgG106-049C911、pgG106-050C911、pgG106-071C9U、pgG106-077C911、pgG106-078C911、pgG106隱079C9U、pgG106-086C911、pgG106-087C911、pgG106-089C911、pgG106-092C911、pgG106-191C911、pgG106-195C911、pgG106-198C911、pgG106-0241C911、pgG106-242C911、pgG106-246C911、pgG106-252C911、pgG106-388C911、pgG106-389C911、pgG106-396C911、pgG106-402C911、pgG106-409C9U、pgGl06-415C911、pgG106-421C911、pgG106-429C911和pgG106-432C911，以及編碼抗腸球菌人Ig輕鏈的pgG105-140C910、pgG105-157C910、pgG105-159C910、pgG105-166C910、pgG105-179C910、pgG105-187C910、pgG106-016C909、pgGl06-043C910、pgG106-049C910、pgG106陽050C909、pgG106-071C910、pgG106-077C909、pgG106-078C910、pgG106-079C910、pgG106-086C909、pgG106-087C910、pgG106-089C910、pgG106-092C910、pgG106-191C909、pgG106-195C910、pgG106陽198C910、pgG106-0241C卯9、pgG106畫242C910、pgG106-246C910、pgG106-252C910、pgG106-388C910、pgG106-389C910、pgG106陽396C909、pgG106-402C910、pgG106-409C910、pgG106-415C910、pgGl06-421C910、pgG106-429C909、和pgG106-432C910在293T細胞中瞬時組合表達，並獲得包含人IgGl抗體的上清。被稱作CR5140、CR5157、CR5159、CR5166、CR5179、CR5187、CR6016、CR6043、CR6049、CR6050、C細71、CR6077、C膽78、C膽79、56CR6086、CR6087、CR6089、CR6092、CR6191、CR6195、CR6198、CR6241、CR6242、CR6246、CR6252、CR6388、CR6389、CR6396、CR6402、CR6409、CR6415、CR6421、CR6429和CR6432的抗體的重鏈的核苷酸序列被分別表示在SEQIDNO:394、SEQIDNO:396、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:398、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:400、SEQIDNO:93、SEQIDNO:402、SEQIDNO:95、SEQIDNO:404、SEQIDNO:406、SEQIDNO:210、SEQIDNO:212、SEQIDNO:408、SEQIDNO:410、SEQIDNO:412、SEQIDNO:414、SEQIDNO:97、SEQIDNO:416、SEQIDNO:418、SEQIDNO:99、SEQIDNO:420、SEQIDNO:422、SEQIDNO:424、SEQIDNO:426、SEQIDNO:428、SEQIDNO:430、SEQIDNO:432、SEQIDNO:434和SEQIDNO:436中。被稱作CR5140、CR5157、CR5159、CR5166、CR5179、CR5187、CR6016、CR6043、CR6049、CR6050、CR6071、CR6077、CR6078、CR6079、CR6086、CR6087、CR6089、CR6092、CR6191、CR6195、CR6198、CR6241、CR6242、CR6246、CR6252、CR6388、CR6389、CR6396、CR6402、CR6409、CR6415、CR6421、CR6429和CR6432的抗體的重鏈的胺基酸序列被分別表示在SEQIDNO:395、SEQIDNO:397、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:399、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:401、SEQIDNO:94、SEQIDNO:403、SEQIDNO:96、SEQIDNO:405、SEQIDNO:407、SEQIDNO:211、SEQIDNO:213、SEQIDNO:409、SEQIDNO:411、SEQIDNO:413、SEQIDNO:415、SEQIDNO:98、SEQIDNO:417、SEQIDNO:419、SEQIDNO:100、SEQIDNO:421、SEQIDNO:423、SEQIDNO:425、SEQIDNO:427、SEQIDNO:429、SEQIDNO:431、SEQIDNO:433、SEQIDNO:435和SEQIDNO:437中。57被稱作CR5140、CR5157、CR5159、CR5166、CR5179、CR5187、CR6016、CR6043、CR6049、CR6050、CR6071、CR6077、CR6078、CR6079、CR6086、CR6087、CR6089、CR6092、CR6191、CR6195、CR6198、CR6241、CR6242、CR6246、CR6252、CR6388、CR6389、CR6396、CR6402、CR6409、CR6415、CR6421、CR6429和CR6432的抗體的輕鏈的核苷酸序列分別被表示在SEQIDNO:438、SEQIDNO:440、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:442、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:444、SEQIDNO:113、SEQIDNO:446、SEQIDNO:115、SEQIDNO:448、SEQIDNO:450、SEQIDNO:214、SEQIDNO:216、SEQIDNO:452、SEQIDNO:454、SEQIDNO:456、SEQIDNO:458、SEQIDNO:117、SEQIDNO:460、SEQIDNO:462、SEQIDNO:119、SEQIDNO:464、SEQIDNO:466、SEQIDNO:468、SEQIDNO:470、SEQIDNO:472、SEQIDNO:474、SEQIDNO:476、SEQIDNO:478和SEQIDNO:480中。被稱作CR5140、CR5157、CR5159、CR5166、CR5179、CR5187、CR6016、CR6043、CR6049、CR6050、CR6071、CR6077、CR6078、CR6079、CR6086、CR6087、CR6089、CR6092、CR6191、CR6195、CR6198、CR6241、CR6242、CR6246、CR6252、CR6388、CR6389、CR6396、CR6402、CR6409、CR6415、CR6421、CR6429和CR6432的抗體的輕鏈的胺基酸序列分別被表示在SEQIDNO:439、SEQIDNO:441、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:443、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:445、SEQIDNO:114、SEQIDNO:447、SEQIDNO:116、SEQIDNO:449、SEQIDNO:451、SEQIDNO:215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:453、SEQIDNO:455、SEQIDNO:457、SEQIDNO:459、SEQIDNO:118、SEQIDNO:461、SEQIDNO:463、SEQIDNO:120、SEQIDNO:465、SEQIDNO:467、SEQIDNO:469、SEQIDNO:471、SEQIDNO:473、SEQIDNO:475、SEQIDNO:477、SEQIDNO:479和SEQIDNO:481中。本領域技術人員能夠根據Kabat等人(1991)在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest中所描述的，確定上述抗體的重鏈和輕鏈的可變區。這些抗體的可變區被提供在表12中。基本上根據上面對scFv所描述的，通過ELISA確認人抗腸球菌IgGl抗體與腸球菌結合的能力；除了下列IgGl之外，以5g/ml的濃度對IgGl進行測定以1.6g/ml測定CR6191，以3.1g/ml測定CR6195,以4.1g/ml測定CR6198，以2.7g/ml測定CR6241，以2.6g/ml測定CR6246,以3.0g/ml測定CR6252。陰性對照是抗西尼羅病毒抗體(CR4374)。另外，對人抗腸球菌IgGl抗體測試它們與糞腸球菌(五w&racocc^./aec"^)和屎腸球菌0&7^ococcws./aedwm)的不同臨床分離物結合的能力(參見表13)。如果與單獨實驗中陰性對照的數值相比，單獨實驗中的數值為至少3倍，則抗體被認為結合分離物。表13中的陰性對照的數值是6次實驗的平均值。除了CR5157、CR5179、CR6016、CR6043、CR6050、CR6246、CR6388、CR6409和陰性對照外的所有抗體都特異性結合糞腸球菌(￡"feracocc"&/"eca//"12030，除了CR5157、CR6016、CR6043、CR6050、CR6241、CR6242、CR6246、CR6388和CR6409外的所有IgGl結合多於一種臨床分離物。抗體CR5187、CR6049、CR6396、CR6402和CR6421結合所測試的所有糞腸球菌(￡wferacoccw./aec"/&)菌株，和兩種屎腸球菌(五"terococc肌y^ec/,)菌株。或者，使用標準程序製備並純化多批超過lmg的每種抗體。實施例7通過源湮存蠻殺傷M定檢,應球蘑特弄絲/gG遊沐井源邀存蠻活性進行調理吞噬測定以對針對腸球菌臨床分離物12030的抗腸球菌人IgGl的殺傷活性進行定量。將新提取的人血(10-30ml)與等體積的葡聚糖-肝素緩衝液(500ml蒸餾水內的4.5g葡聚糖，SigmaChemical,St.Louis;28.4mg肝素鈉)混合；並將該混合物在37"C溫育1小時。通過離心收集含有白細胞的上層，並通過將細胞沉澱懸浮在1(w/v)。/。的NH4Cl完成對殘餘紅細胞的等滲裂解。接著在含有15。/。胎牛血清的RPMI中對白細胞群進行清洗。將臺盼藍染色和血細胞計數器中的計數用於確定活的白細胞的濃度，並將最終的白細胞濃度調節到2xl(^個細胞/ml。使用或不使用加入到1001細菌(根據光譜將濃度調節到2xl0"個細胞/ml，並通過活菌計數來確認)，1001在RPMI中稀釋的抗腸球菌人IgGl，以及100l幼兔補體的1001白細胞懸浮液進行兩次吞噬測定。將反應混合物在37。C下轉子架(rotorrack)上溫育90分鐘；在時間0和90分鐘後提取樣品，稀釋在1。/。示蛋白腖(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)中，鋪到胰酶大豆瓊脂平板上。殺傷活性(％)被計算為在包含白細胞的樣品中存活的CFU平均數減去在不包含白細胞的樣品中存活的CFU平均數，並除以後者，而後乘以100。在兩次獨立的實驗中測試四種濃度的抗腸球菌人IgG1(2500、250、25、2.5ng/ml)。採用概率單位模型的順序回歸分析被用於計算測定中殺傷50%細菌所需要的濃度(參見表14)。實施例8i球^"錄,絲/gG在嵐^^i^^":^卞遊沐/^活絲將腸球菌的鼠敗血症模型(參見Hufhagel等人，2004)甩於對抗腸球菌人IgGl在從血流中清除腸球菌臨床分離物12030的能力進行定量。根據上面所述製備純化的被證明在體外針對腸球菌(五"ferco"w)具有殺傷活性的IgGl分子CR5159、CR5187、CR6016、CR6043、CR6049、CR6071、CR6089和CR6241以及針對腸球菌(五"^ro"w)不具有殺傷活性的一種陰性對照，除了CR6016和CR6241被以7.5mg/kg的劑量注射以外，都被以15mg/kg的劑量腹腔注射(在PBS中0.5-lml)到八隻BALB/c小鼠組中。此外，一組小鼠注射了PBS。在24小時後，通過對動物進行靜脈內接種6xl08CFU的腸球菌(五"^rocc船)菌株12030。四小時後，細菌攻擊的小鼠以相同劑量接受了第二次腹腔注射CR5159、CR5187、CR6016、CR6043、CR6049、CR6071、CR6089和CR6241。全身感染三天後，動物被安樂死，並通過心臟穿刺收集大約0.5ml血液。將血液樣品定量培養在腸球菌選擇性瓊脂培養基上；將稀釋在9001THB的IOOI血液鋪到平板上，一式兩份。在溫育過夜後，從平板上讀出CFU的數目，並乘以10以得到血液的CFU/ml。該數值與處死時循環系統中細菌的數目直接相關。該模型中的主要重點是接種後3天血液中腸球菌(五"fwcoccw)的CFU。如圖1所示，3天後，所有接受PBS或對照IgGl的動物在血液中具有>102CFU/ml的腸球菌，而中位數是大約103CFU/ml。相反所有接受抗腸球菌抗體的動物的組血液中均具有〈(^CFU/ml的腸球菌(五"fercocc^)。另夕卜，在除CR5187的所有情況中，中位數比對照的中位數低一個對數。一種抗體CR6089在測定中具有低於敏感性水平的中位數(10CFU/ml)，在8隻動物的6隻中，血液中沒有可以檢測到的細菌。以更低劑量使用的CR6016和CR6241仍然具有接近10CFU/ml血液的中位數，這表明它們具有高效力。非參數方差分析(Kruskal-Wallis)表明差異是高度顯著的(pO.OOl)。使用Mann-Whitney測試利用Bonferroni校正，在測試Igl和陰性對照IgGl之間進行成對比較。與對照抗體相比，抗體CR5159、CR5187、CR6043、CR6049、CR6089和CR6241都是顯著差異的(p0.05)，而在與對照抗體相比時，抗體CR6043和CR6071的中位數差異沒有達到顯著。實施例9為了確定名單中的抗體是否競爭結合相同的目標，開發了競爭ELISA。將腸球菌菌株12030在血瓊脂平板上劃線，並在37'C下溫育過夜。使用5ml50mM的碳酸鹽緩衝液(8體積的0.2MNa2CO3,17體積的NaHC03以及75體積的蒸餾水)將集落從平板上刮下，並在4000rpm離心3分鐘。將所得到的沉澱重懸浮在50(Hd碳酸鹽緩衝液中，再次離心，將沉澱重懸浮在500^1碳酸鹽緩沖液中。通過測量系列稀釋的細菌的OD600而確定細胞密度。將腸球菌菌株稀釋至密度為5xl(^個細胞/ml，並在4"C下在Nunc-ImmunoMaxisorpF96平板的每個孔塗布100nl(5xl08個細胞)過夜。接種後，使用PBS清洗3次，並在室溫下使用每孔300plPBS中的2(v/v)%ELK封閉1小時。在分別的試管中，將稀釋成亞飽和水平(根據上面ELISA所確定的)的每種scFv-噬菌體大量製備物(maxiprep)(如上製備)與25|il封閉緩衝液(PBS中4(v/v)%ELK)和在PBS中稀釋到10|ig/ml的50^1IgGl上清液進行混合。從孔中除去封閉溶液後，將IOOW混合物加入到每個孔中，並在室溫下溫育1小時。接著使用PBS/0.01(v/v)。/。吐溫對孔清洗3次，並使用PBS一次。清洗之後，每孔加入100^抗-M13HRP(在PBS中的2(v/v)%ELK內1:5000)，並在室溫下溫育60分鐘。對孔進行再次清洗，並通過向每個孔中加入10(^1OPD溶液使染色顯現。在5-10分鐘後，通過向每個孔中加入50^illM的H2SO4停止顯現反應，並在492nm下檢測OD。使用全部抗體和對照IgG14374重複實驗兩次。結果顯示抗體可以分成不同的幾組。由CR6089和CR6092構成的組A;由CR5157、CR5187、CR6043、CR6049、CR6388、CR6389、CR6396、CR6402、CR6409、CR6421和CR6429構成的組B;以及由CR5159、CR5166、CR6050、CR6077、CR6078、CR6086和CR6191構成的組C;其餘的抗體CR5140、CR5179、CR6016、CR607KCR6079、CR6087、CR6195、CR6198、CR6241、CR6242、CR6246、CR6252、CR6415和CR6432不與任何其它的抗體競爭結合。實施例10淑薪凝,殺纖定激微鄉麟柳好歸不麟微離—匈、屎厲球離/,.應，金貴色蕭萄球斷S.aw—雜遊沐,存藩絲為了確定抗腸球菌單克隆抗體名單的殺傷活性的寬度，測定上述所製備純化的幾批IgGl在上述調理吞噬殺傷活性測定中的殺傷活性。測試了另外的n型糞腸球菌(E/^ca/W菌株；兩種不同的屎腸球菌(E/^n'wm)臨床分離物740220和838970;以及金黃色葡萄球菌(S.awews)分離物502。根據無競爭結合能力和在調理吞噬殺傷測定中的效力，從最初名單中的34種抗體中選擇18種抗體。如表15所示，所選擇的名單顯示以兩種濃度2.5嗎/ml和0.025嗎/ml針對屎腸球菌(五./a"/w—的殺傷活性，不過CR5140、CR6016和CR6078的活性在最高濃度針對838970菌株也低於20%。除了一種抗體外，全部針對II型糞腸球菌CB./flecflto)菌株具有可測的活性，儘管18種抗體中有11種在所檢測的最高濃度時仍具有低於25%的活性。令人驚奇的是所有的抗體針對金黃色葡萄球菌(S.^^ei^)菌株502均具有殺傷活性，這說明抗體識別廣泛的交叉反應目標。我們測試是否所有抗體都結合金黃色葡萄球菌(S.aww力的脂磷壁酸質(LTA)，似乎這些抗體中沒有結合的。這些抗體中有3種(CR6252、CR6415和CR6421)被測試針對另一種金黃色葡萄球菌(S啤/i[y/。cocciwaw固s)菌株(Newman)，以及針對表皮葡萄球菌(5"to//2y/ococc^叩WermzVfe)菌株(RP62A)的調理吞噬殺傷活性，所測試的全部三種抗體都顯示針對這些不同金黃色葡萄球菌CStop/^/ococcw)種和菌株的殺傷活性。63表l:人^鏈可變區引物(正義)引物名稱引物核苷酸序列SEQIDNOHuVLlA-Back5'-CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC誦3'SEQIDNO:130HuVLB-Back5，-CAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3'SEQIDNO:131HuVLlC-Back5,-CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3，SEQIDNO:32HuVL2B-Back5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCC-3，SEQIDNO:133HuVL3A-Back5，-TCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3'SEQIDNO:134HuVL3B-Back5，-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3'SE(^IDNO:135HuVL4B-Back5'-CAGCYTGTGCTGACTCAATC-3'SE(5IDNO:136HuVL5-Back5'-CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3'SEQIDNO:37HuVL6-Back5，-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3'SEQIDNO:138HuVL7/8-Back5，-CAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3，SEQIDNO:139HuVL9-Back5'-CWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3'SEQIDNO:140HuVL10-Back5，-CAGGCAGGGCTGACTCAG-3'SEQIDNO:141表2:人k鏈可變區引物(正義)tableseeoriginaldocumentpage65ACGGAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3,HuVK5-Back-SAL5'扁TGAGCACACAGGTCGACGGAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3'SEQIDNO:152HuVK6-Back-SAL5，-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3，SEQIDNO:153HuJKl-FOR-NOT5，-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'SEQIDNO:154HuJK2-FOR-NOT5，-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'SEQIDNO:155HuJK3-F0R-N0T5，-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3'SECIDNO:156HuJK4-FOR-NOT5，-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3'SEQIDNO:157HuJK5-FOR-NOT5，-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3'SEQIDNO:158HuVLlA-Back-SAL5'-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3，SEQIDNO:159HuVLlB-Back隱SAL5,-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3，SEQIDNO:I60HuVLlC-Back-SAL5，-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTCGTGACGCAGCCGSEQIDNO:16tableseeoriginaldocumentpage67GGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'HuJL7-FOR-NOT5，-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3'SEQIDNO:173表4:根據瓊脂糖凝膠分析所確定的濃度，最終混合物中不同輕鏈產物的百分比正義引物反義引物產物百分比HuVLlA-Back-SAL+HuVLlB-Back-SAL+HuVLlC-Back-SALHuJLl-FOR-NOTL1J14.20%HuJL2/3-FOR-NOT1JJ28,40%HuJL7-FOR-NOTL1J31.40%HuVL2B-Back-SALHuJLl-FOR-NOTL2J13.00%HuJL2/3-FOR-NOTL2J26.00%HuJL7-FOR-NOTL2J31.00%HuVL3A-Back陽SALHuJLl-FOR-NOTL3J13.00%HuJL2/3-FOR-NOTL3J26.00%HuJL7-FOR-NO丁L3J31.00%HuVL3B-Back-SALHuJLl-FOR-NOTL4J10.30%HuJL2/3-FOR-NOTL4J20.60%HuJL7-FOR-NOTL4J30.10%HuVL4B-Back-SALHuJLl-FOR-NOTL5J10.30%HuJL2/3-FOR-NOTL5J20.60%HuJL7-FOR-NOTL5J30.10%歸L5-Back-SALHuJU-FOR-NOTL6J10.30%HuJL2/3-FOR-NOTL6J20.60%HuJL7陽FOR-NOTL6J3O.腦HuVL6-Back-SALHuJU-FOR-NOTL7J10.30%HuJL2/3-FOR-NOTL7J20.60%tableseeoriginaldocumentpage69歸K4-FOR-NOTK5J40.25%HuJK5-FO關OTK5J50.15%HuVK6-Back-SALHuJK-FOR-NOTK6J11.25%HuJK2-FOR-NOTK6J21.25%HuJK3-FOR-NOTK6J30.50%HuJK4-FOR-NOTK6J41.25%HuJK5-FOR-NOTK6J50.75%表5:人IgG重鏈可變區引物(正義)引物名稱引物核苷酸序列SEQIDNO諸H簡A-Back5'-CAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3'SEQIDNO:174HuVHlC-Back5,-SAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3'SEQIDNO:175HuVH2B-Back5，-CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3'SEQIDNO:76HuVH3A-Back5，-GAGGTGCAGCTGGTGGAG-3'SEQIDNO:177HuVH3C-Back5,扁GAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG-3，SEQIDNO:178HuVH4B-Back5，-CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG-3'SEQIDNO:179HuVH4C-Back5，-CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3'SEQIDNO:180歸H6A-Back5'-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3,SEQIDNO:181表6:延伸有Sfil/Ncol限制位點的人IgG重鏈可變區引物(正義)以及延伸有XhoI/BstEII限制位點的人IgG重鏈J區引物(反義)tableseeoriginaldocumentpage71GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3'HuJHl/2-FOR-XhoIB5'-GAGTCATTCTCGACTCGAGACRGTGACCAGGGTGCC-3'SEQIDNO:I卯歸H3-FOR-Xho5，陽GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCATTGTCCC-3'SE(3IDNO:191HuJ鵬-FOR-Xho5，-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3'SEQIDNO:92H函6-FOR-Xho5，-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3'SEQIDNO:193表7最終混合物中不同重鏈產物的百分比正義引物反義引物產:物百分比HuVHlB/7A-Back-Sfi+HuVHlC-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH1J12.5%HuJH3-FOR-XhoHU22.5%HuJH4/5-FOR-XhoH1J315.0%HuJH6-FOR-XhoH1J45.0%HuVH2B-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH2J10.2%HuJH3-FOR-XhoH2J20.2%H認4/5-FOR-XhoH2J31.2%HuJH6-FOR誦XhoH2J40.4%HuVH3A-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH3J12.5%HuJH3-FOR-XhoH3J22.5%HuJH4/5-FOR-XhoH3J315.0%HuJH6-FOR-XhoH3J45.0%HuVH3C-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH4J12.5%Hu加-FOR-XhoH4J22.5%HuJH4/5-FOR-XhoH4J315.0%HuJH6-FOR-XhoH4J45.0%HuVH4B-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH5J10.2%HuJH3-FOR-XhoH5J20.2%HuJH4/5-FOR-XhoH5J31.2%HuJH6-FOR-XhoH5J40.4%HuVH4C-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH6J12.0%HuJH3-FOR-XhoH6J22.0%HuJH4/5-FOR-XhoH6J312.0%HuJH6-FOR-XhoH6J44.0%HuVH6A-Back-SfiHuJHl/2-FOR-XhoIBH7J10.1%HuJH3-FOR陽XhoH7J20,1%HuJH4/5-FOR-XhoH7J30.6%HuJH6-FOR-XhoH7J40.2%表8用於選擇和篩選抗腸球菌單鏈(scFv)噬菌體抗體的腸球菌菌株tableseeoriginaldocumentpage74SC06-1950.6610.7890.0460.043SC06-980.9991.1690.0490.044SC06-2411.1070.1220.0520.045SC06-2420.840.0850.0430.043SC06-2460.5880.6360.0420.040SC06-2520.6380,3040.0440.039SC06-388l掘1.301ND0.040SC06-3891.3371.743ND0.038SC06-3960.6891.166ND0.067SC06-4021.5381.卯5ND0.126SC06-4090.876U390.0550.051SC06-4150.8891.5650.0440.049SC06-4213.1503.2700.6070,133SC06-4291.1012.4530駕0.043SC06-4320.8072.4010.0590.044平均陰性對照0.120.150.070.06ND的意思是未確定表10腸球菌(五"feracoccw)特異性單鏈scFv的數據名稱scFV核廿酸序列的SEQIDNO胺基酸序列的SEQID膨VH-位SVL-位置SC05-140350351(Vh1-121;VI138-243)Vh3(3-33)V13(3h-V2-14)SC05-157352353(Vh1-121;VI138-247)Vh5(5-51)VI1(〗c-Vl-〗6)SC05-1596162(Vh1-123;VI140-249)VH1(1-0VI1(lc-Vl-16)SC05-1666364(Vh1-133;VI150-259)VH1(1-18)V16(6a-Vl-22)SC05-179354355(Vh1-117;Vh3(3-11)V12(2e-Vl-03)tableseeoriginaldocumentpage76SC06-198370371(Vhl墨116;VI133-243)Vh4(4-b)VI1(le-V1-13)SC06-2417778(Vh1-118;VI135-241)VH3(3-30.3)VkI(L5-DPK5)SC06-242372373(Vh1-115;VI132-237)Vh4(4-59)V13(3h-V2-4)SC06-246374375(Vh1陽121;VI138-245)Vh3(3-53)V3(3h-V2-14)SC06-2527980(Vh1-115;VI132-241)VH3(3-23)VI1(lc-Vl-16)SC06-388376377(Vhl-U9;VI136-245)Vh5(5-51)VI2(2c-V-02)SC06-389378379(Vh1-121;VI138-245)Vh5(5-51)V13(31-V2-13)SC06-396380381(Vh1-121;VI138-245)Vh5(5-51)VkIII(A27-DPK22)SC06-402382383(Vh1-127;VI144-255)Vh5(5-51)V12(2e-Vl-03;)SC06-409384385(Vh1-122;VI139-249)Vh5(5-51)V12(2a2-Vl-04)SC06-415386387(Vh1-116;VI133-242)Vh3(3-09)VI2(2c-Vl-02)SC06-421388389(Vh1-120;VI137-246)Vh5(5-51)VI2(2c-Vl-02)SC06-429390391(Vhl-21;VI138-249)Vh5(5鄰VkII(A19/A03-DPK15)SC06-432392393(Vh1-120;VI137-246)Vh4(4-31)VI1(le-Vl-13)4舌號內顯示構成重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的胺基酸77表11腸球菌CE"feracocc""特異性單鏈scFv的CDR區數據名禾爾scFvHCDR1(SEQIDNO:)HCDR2(SEQIDNO:)HCDR3(SEQIDNO:)1XDR1(SEQIDNO:)LCDR2(SEQIDNO:)LCDR3(SEQIDNO:)SCO5-1402]8219220221222223SC05-J57224225226227228229SC05-:i5923456SC05-166789101112SC05-179230231232233234235SC05-187131415161718SC06掘192021222324SC06-043252627282930SC06-049313233343536SC06-050236237238239240241SC06-07]373839404142SC06-077242243244245246247SC06-078434445464748SC06-079248249250251252253SC06掘254255256257258259SC06-087194195196197198199SC06-089200201202203204205SC06-092260261262263264265SC06-191266267268269270271SC06-195272273274275276277SC06-198278279280281282283SC06-241495051525354SC06-242284285286287288289SC06-246290291292293294295SC06-252555657585960SC06-38829629729829930030178tableseeoriginaldocumentpage79(Vh1-119)(VI1-110)CR6079頓405(Vh1-116)448449(VI1-110)CR6086406407(Vh1-120)450451(VI1-107)CR6087210211(Vh1-122)214215(VI1-111)CR6089212213(Vh1-123)216217(VI-108)C膽92408409(Vh1-121)452453(VI1-111)CR6191410411(Vh1-120)454455(VI1-107)CR6195412413(Vh1-115)456457(VI1-110)CR619841445(Vh1-U6)458459(VI1-111)CR62419798(Vh1-118)17J8(VI1-107)CR6242416417(Vh1-115)460461(VI1-106)CR6246418419(Vh1-121)462463(VI1-108)CR625299100(Vh1-115)119120(VI1-110)CR6388420421(Vh1-119)464465(VI1-110)CR6389422423(Vh1-121)楊467(V1-108)CR6396424425(Vh-m)468469(VI1-108)CR6402426427(Vh1-127)470471(VI1-112)CR6409428429(Vh1-122)472473(VI1-111)CR6415430431(Vh1-116)474475(vii國no)CR6421432433(Vh1-120)476477(VI1-110)CR6429434435(Vh1-121)478479(VI1-112)CR6432436437(Vh1-120)480481(VI1-110)吋舌號內顯示構成重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的胺基酸表13根據ELISA所測得的人IgGl抗體針對不同糞腸球菌(五wtemcoccw/aecafe)和屎腸球菌(五meracoccws/aedwm)菌株的特異性結合活性tableseeoriginaldocumentpage81CR64152.2841.9100.1220.108U190.195CR64210.6930.8030.510.8220.4380.368CR64290.3020.437O.l卯0.4030.3470.185CR64320.3580.3640.3220.5000.216O.楊Averageneg.Ctrl0.110.130.090.130.120.07表14人IgGl抗體針對糞腸球菌CE"feracoccw/aecafc)菌株12030的體外調理吞噬殺傷活性抗體名稱提供50%細菌殺傷的抗體濃度(ng/ml)CR5140NDCR515720.7CR5159130CR516627.8CR5179312CR5187295CR60162.20CR60438.94CR60493794CR60505.82CR607112.4CR607754.7CR607810.5CR6079>10000CR608610.8CR608721.2C細893.67CR6092>麵0CR6191178CR6195>10000CR61984787CR62410.613CR6242NDCR6246>10000CR625229.2CR63880.64CR63890.33CR63964,71CR64021.00CR640936.6CR6415NDCR642121.6CR64291.2CR6432>10000ND的意思是未確定表15通過調理吞噬殺傷測定所測得的IgGl抗體的殺傷活性平均腸球菌和葡萄球菌殺傷活性(％)菌株II型740220838970502[ng/ml]250025250025250025250025IgGl抗體CR514014.97.772.244.111.92.366.444.9CR51572.34.064.814.527.79.748.727.0CR601615.74.666.917.93,21.759.032.3CR604330.016.163.615.721.12.850.521,3CR60507.55.849.418.833.18.159.028.2CR607843.224.960.425,64.61.539.212.8CR608754.44U58,830.3.34.716.026.512.3CR60897.36.360.419.432.27.432.88.2CR62416.54.373.544.848,518.338.29.6CR62529.86.974.643.643.25.546.519.7CR638850.822.654.818.047.27.351.834.1CR638910.57.756.830.837.719.335.416.7CR63966.82.936.69.430.95.237.613.1CR640239.024.957.921.036.412.920.86.0CR640946.027.664.536.9.25.03.746.918.4CR641516.912.256.624.235.319.642.420.4CR64215.32.964,314.035.721.044.921.5CR6429-0.1-1.258.75.743.512.336.512.6參考文獻BoelE，VerlaanS，PoppelierMJ，WesterdaalNA,VanStrijpJAandLogtenbergT(2000)，Functionalhumanmonoclonalantibodiesofallisotypesconstructedfromphagedisplaylibrary-derivedsingle-chainFvantibodyfragments.J.Immunol.Methods239:153-166。BurtonDRandBarbasCF(1994)，Humanantibodiesfromcombinatoriallibraries.Adv.Immunol.57:191-280。Chou,TCandPTalalay(1984)，Quantitativeanalysisofdose-effectrelationships:thecombinedeffectsofmultipledrugsorenzymeinhibitors.Adv.EnzymeRegul.22:27-55。DeKruifJ，TerstappenL,BoelEandLogtenbergT(1995a),Rapidselectionofcellsubpopulation-specifichumanmonoclonalantibodiesfromasyntheticphageantibodylibrary.Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:3938。DeKruifJ，BoelEandLogtenbergT(1995b),Selectionandapplicationofhumansingle-chainFvantibodyfragmentsfromasemi-syntheticphageantibodydisplaylibrarywithdesignedCDR3regions.J.MoLBiol.248:97-105。HuebnerJ,Y，Krueger\VA，MadoffLC，MartirosianG,BoisotS，GoldmannDA,KasperDL,TzianabosAOandPierGB(1999)，Isolationandchemicalcharacterizationofacapsularpolysaccharideantigensharedbyclinicalisolatesof五"ferococcws_/beca/handvancomycin-resistantEVzterococcus々ec/ww.Infect.Immun.67:1213-1219.HufoagelM,KochS，CretiR,BaldassarriLandHuebnerJ(2004),Aputativesugar-bindingtranscriptionalregulatorinanovelgenelocusin五她racocczw力ecafecontributestoproductionofbiofilmandprolongedbacteremiainmice.J.Infect.Dis.189:420-430。HulsG，HeijnenIJ,CuomoE，vanderLindenJ,BoelE,vandeWinkelJandLogtenbergT(1999),Antitumorimmuneeffectormechanismsrecruitedbyphage84display-derivedfullyhumanIgGlandIgAlmonoclonalantibodies.CancerRes.59:5778-5784。SlootstraJW，PuijkWC,LigtvoetGJ,LangeveldJP,MeloenRH(1996)，Structuralaspectsofantibody-antigeninteractionrevealedthroughsmallrandompeptidelibraries.Mol.Divers.1:87-96。權利要求1、一種人單克隆抗體，其特徵在於具有針對至少兩種不同腸球菌(Enterococcus)中每一種的至少一種菌株和針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的至少一種菌株的調理吞噬殺傷活性。2、根據權利要求1所述的人單克隆抗體，其中所述抗體選自包含本文所公開抗體CR5140、CR5157、CR6016、CR6043、CR6050、CR6078、CR6087、C細89、CR6241、CR6252、CR6388、CR6389、CR6396、CR6402、CR6409、CR6415、CR6421或CR6429中任一種抗體的可變區的抗體以及可變區與這些本文所公開抗體的可變區具有至少80%的相同性的抗體。3、根據權利要求1或2所述的人單克隆抗體，其特徵在於所述腸球菌C&7feracoccw。禾中包括糞腸球菌CE./aeca/^)和屎腸球菌OE./aec/ww)。4、一種免疫綴合物，其包含根據權利要求1-3中任一項所述的人單克隆抗體，所述免疫綴合物還包含至少一種標籤。5、一種核酸分子，其編碼根據權利要求1-3中任一項所述的人單克隆抗體。6、一種載體，其包含至少一種根據權利要求5所述的核酸分子。7、一種宿主細胞，其包含至少一種根據權利要求6所述的載體。8、一種製備根據權利要求1-3中任一項所述的人單克隆抗體的方法，其中所述方法包括步驟a)在適合表達所述人單克隆抗體的條件下，培養根據權利要求7所述的宿主細胞；以及任選地b)回收所表達的人單克隆抗體或功能變體。9、一種藥物組合物，其包含根據權利要求1-3中任一項所述的人單克隆抗體，或者根據權利要求4所述的免疫綴合物，所述藥物組合物還包含至少一種藥物上可以接受的賦形劑。10、根據權利要求9所述的藥物組合物，其還包含至少一種其它的治療劑。11、權利要求1-3中任一項所述的人單克隆抗體、權利要求4所述的免疫綴合物、或者權利要求9或10所述藥物組合物在腸球菌感染和/或葡萄球菌感染的診斷、預防、治療或其組合中的應用。全文摘要本發明提供了特異性結合腸球菌和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)並針對腸球菌和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有殺傷活性的人結合分子，編碼所述人結合分子的核酸分子，包含所述人結合分子的組合物，以及鑑定或製備所述人結合分子的方法。所述人結合分子能夠用於腸球菌(Enterococcus)所引起病症的診斷、預防和/或治療。文檔編號C07K16/12GK101460518SQ200780020712公開日2009年6月17日申請日期2007年6月5日優先權日2006年6月6日發明者C·A·德克呂夫,M·思羅斯比,R·A·克拉梅申請人:克魯塞爾荷蘭公司