基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法
2023-11-02 22:34:32 1
基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法，本發明本發明針對ORF1基因就PCV1和PCV2的ORF1閱讀框同源性高達86%進行核酸疫苗研究，可刺激動物機體產生相應高水平的抗體，體現出很強的特異性，針對PCV1和PCV2引發豬的感染和傳播，通過兩種病毒類似的閱讀框對兩種病毒起到防控效果，可達到安全和有效的效果。
【專利說明】基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其是一種基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法。
【背景技術】
[0002] 豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV)為圓環病毒科（Circoviridae)圓環病毒 屬成員，單股環狀DNA病毒，為已知的最小動物病毒之一。根據基因組和抗原性的差異，分 為PCVl和PCV2兩種基因型（或血清型），其中PCVl至今未發現有致病性，PCV2則被認定 是導致仔豬斷奶後多系統衰竭徵（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS) 的主要病原。PCV2常與細小病毒（PPV)、豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV)、豬肺炎支原 體、偽狂犬病毒（PRV)混合感染，造成豬的免疫失敗。PCVl和PCV2的基因組包含有2個主 要的開放閱讀框，即ORFl和0RF2,病毒的主要結構蛋白由0RF2編碼，ORFl基因編碼Rep和 較小的^兩種與複製有關的蛋白。將體外表達的ORFl編碼蛋白與表達粒細胞-巨噬細 胞集落刺激因子（GM2CSF)的真核表達質粒聯合免疫豬群，能起到抵抗PCV2攻擊的作用，這 提示針對ORFl基因編碼蛋白的抗體可能具有中和病毒的作用。PCVl與PCV2的ORFl閱讀 框同源性高達86%，目前大多數報導稱PCVl無致病性，但已有報導稱其可引起繁殖障礙，豬 圓環病毒的免疫程序已經很成熟，但其帶來的經濟損失卻持續增加，可以很好的解釋PCVl 的存在對PCV2的致病性有促進作用。
[0003] 目前，國內外對於PCV2基因工程疫苗包括PCV2亞單位疫苗和重組PCV2活載體疫 苗。Cap蛋白是PCV2的主要結構蛋白和免疫保護性抗原，能刺激動物機體產生針對PCV2 的特異性免疫應答，是研製PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。常用於PCV2亞單位 疫苗生產的表達系統主要是昆蟲細胞杆狀病毒表達系統。其中重組PCV2活載體疫苗又包 括PCV2病毒活載體疫苗和PCV2細菌活載體疫苗。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是：提供一種基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法，它所製備或的 疫苗能有效預防PCVl及PCV2的感染與傳播，可達到很好的免疫效果，而不產生致病性，並 體現出很強的特異性，以克服現有技術的不足。
[0005] 本發明是這樣實現的：基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法，包括如下步驟 1) 將豬圓環病毒II型ORFl基因進行PCR擴增，豬圓環病毒II型ORFl基因具有如序列 表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，擴增條件為：PCR體系總體積50 μ L，其中CldH2O 為 37 μ L，IOXPCR Buffer 5 μ L，dNTP LO μ L，上下遊引物各 LO μ L，DNA 模板 4.0 μ L， Taq酶1.0 yL;擴增程序為：94°C預變性3min;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸 I. 5min，共進行30個循環；最後延伸72°C IOmin ;上遊引物的序列為Primer F 5' -CGGGT ACCATGCCCAGCAAGAAGAATG-3'，下遊引物的序列為 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITT CATATGGAA-3;； 2) 將擴展獲得的PCR產物與pMD18-T載體連接，將連接產物轉化入大腸埃希氏菌DH5a 感受態細胞，在37°C下培養12 h，挑取上述白色菌落，接種到含有氨苄青黴素的2XYT液體 培養基中，在37°C振蕩培養過夜至混濁，提取質粒並進行酶切鑑定； 3) 將重組質粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進行KpnI和XmaI雙酶切，回收純化 目的片段，將二者用T4 DNA連接酶於16°C連接過夜，連接產物轉化至大腸埃希氏菌DH5a 感受態細胞，用試劑盒提取質粒並進行KpnI和XmaI雙酶切，用試劑盒提取獲得陽性重組質 粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，並進行雙酶切及PCR鑑定； 4) 真核構建體系為：目的DNA片段8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA ligase0.5yL、10XT4 DNA ligase buffer I. 5 μ L、滅菌 ddH20 3· O μ L，總體積 15. O μ L ; 5) 培養並收穫處於指數生長期的ΡΚ-15細胞，用胰蛋白酶消化後用6 mL營養液懸浮細 胞；然後取6孔細胞培養板，加 I mL上述細胞懸液和I mL生長液，放入37°C 5%C02恆溫 培養箱培養24 h，使細胞達709Γ80%融合時進行轉染，參照Lipofecttamine TM2000試劑說 明書進行重組質粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl轉染試驗；在培養箱中培養48h，檢測轉染水平， 同時設置轉染空質粒pEGFP-Cl和不轉染質粒的細胞作為對照。
[0006] 6)經擴增培養後，獲得的pEGFP-Cl- PCV2- ORFl質粒作為基於豬圓環病毒核酸疫 苗。
[0007] 本發明將針對PCVl的存在對PCV2的致病性有促進作用這一問題設計了疫苗，用 於預防並控制PCVl和PCV2對豬的感染，適用於對豬的免疫，為豬圓環病毒病的防治提供安 全有效的免疫產品，並減少對養豬業帶來的經濟損失。本發明安全性好，針對豬圓環病毒其 中一個重要的閱讀框展開研發，通過對豬制定合理的免疫程序，從而達到對豬圓環病毒病 的預防與控制，可達到很好的免疫效果，而不產生致病性；本發明針對ORFl基因就PCVl和 PCV2的ORFl閱讀框同源性高達86%進行核酸疫苗研究，可刺激動物機體產生相應高水平的 抗體，體現出很強的特異性；本發明針對PCVl和PCV2引發豬的感染和傳播，通過兩種病毒 類似的閱讀框對兩種病毒起到防控效果，有很好的科學性。
【專利附圖】
【附圖說明】 附圖1為本發明的流程圖。
【具體實施方式】
[0008] 本發明的實施例：基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法： 真核表達質粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1、胰蛋白腖、酵母提取物、氯化鈉、無內毒素質粒 抽提相關試劑等。
[0009] 包括如下步驟： 第一，引物的設計及合成 引物經登錄661161^111^(?^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)獲取3/?-321株（登錄號疋11747085)、 Vos_2689006 株（登錄號：EUM555I)、Ρ701-1 株（登錄號：FJ905468)、PCV2_HZ0 20l 株（登 錄號：AY-188355)和PCV2herd D株（登錄號：EU136720)序列，以Bioedit軟體比對選取保 守序列後經Primer Premier 5軟體設計豬圓環病毒II型ORFl基因（具有如序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列)通用引物；上遊引物的序列為Primer F 5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，，下遊引物的序列為 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA _3' ； 第二，最佳反應體系的確定 PCR 體系總體積 50yL，其中 ddH20 37yL，10XPCR Buffer 5yL，dNTP LOyL，上下 遊引物各I. 0μ L，DNA模板4. 0 μ L，Taq酶I. 0 μ L。擴增程序為：94°C預變性3min ;94°C 變性45s，55°C退火45s，72°C延伸1.5min，共進行30個循環；最後延伸72°C IOmin; 第三，最佳反應體系的確定 在50. 0 μ L的反應體系中，設定不同的引物濃度各0· 4pmol/ μ L、0. 6pmol/ μ L、 0· 8pmol/ μ L、I. 2pmol/ μ L、I. 6pmol/ μ L，不同的 dNTP 濃度 0· 2nmol/ μ L、0. 3nmol/ μ L、 0· 4nmol/ μ L、0. 5nmol/ μ L、0. 6nmol/ μ L，以最適退火溫度對 Mycoplasma mycoides cluster與Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因部分序列克隆質粒等量混合模板進 行擴增，以確定最佳的反應體系； 第四，PCV2-0RF1基因的克隆 PCR產物於1%瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的條帶的凝膠，參照DNA膠回收試劑盒 說明書回收PCR產物，用常規方法與PMD18-T載體連接；將連接產物轉化入大腸埃希氏菌 DH5a感受態細胞，37°C培養12 h，挑取上述轉化平皿中的白色菌落，接種到含有氨苄青黴 素的2 X YT液體培養基中，37°C振蕩培養過夜至混濁，提取質粒並進行酶切鑑定，篩選出陽 性並進行測序； 第五，真核質粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl的構建 重組質粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進行KpnI和XmaI雙酶切，回收純化目的 片段，將二者用T4 DNA連接酶於16°C連接過夜，連接產物轉化至大腸埃希氏菌DH5a感受 態細胞，試劑盒提取質粒並進行KpnI和XmaI雙酶切，酶切正確，試劑盒提取獲得陽性重組 質粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，進行雙酶切及PCR鑑定，並送公司測序驗證。其中真核構建 體系為：目的 DNA 片段 8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA IigaseO. 5μ L、10XT4 DNA Iigase buffer I. 5 μ L、滅菌 ddH20 3· 0 μ L，總體積 15. 0 μ L ; 第五，真核質粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl體外培養 培養並收穫處於指數生長期的PK-15細胞，用胰蛋白酶消化後用6 mL營養液懸浮細 胞。然後取6孔細胞培養板，加 I mL上述細胞懸液和I mL生長液，放入37°C 5% C02恆溫 培養箱培養24 h，使細胞達709Γ80%融合時進行轉染。參照Lipofecttamine TM2000試劑 說明書進行重組質粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl轉染試驗。在培養箱中培養48h，檢測轉染水 平，同時設置轉染空質粒pEGFP-Cl和不轉染質粒的細胞作為對照； 第七，基於豬圓環病毒核酸疫苗的研究及應用，動物性實驗如下： (1) 經擴增培養pEGFP-Cl- PCV2- ORFl後，製備大量無內毒素的pEGFP-Cl- PCV2-ORFl質粒，免疫小白鼠，監測小白鼠血清中PCV2-0RF1特異性抗體水平； (2) 5-6周齡小白鼠(購自貴陽醫學院）隨機分成3組，分別為生理鹽水空白組， pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核質粒試驗組，pEGFP-Cl空質粒試驗組； (3) 免疫程序為：相同部位肌肉注射，在首免前2d注射0. 25%普魯卡因100 μ 1/只，每 組質粒免疫劑量為100 μ g/只，於首免後間隔I4d加免一次； (4) 分別於首免後0、7、14、21、28、35d小鼠血清，用已建立的間接ELISA法測定血清中 ORFl抗體的水平；其中所建立的間接ELISA法抗原包被最佳濃度1. 5 μ g/ μ 1，血清最佳稀 釋度為1:10,二抗最佳工作濃度為1:1000 ; (5)PCV2-0RF1抗體陽性判定值為0. 231，pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核質粒刺激小鼠機 體產生抗體水平出現很高的陽性水平； 第八，臨床應用 pEGFP-Cl- PCV2- ORFl質粒接種免疫豬，監測其刺激豬產生的抗體水平，以驗證方法 的臨床應用性； 通過第一至第七步驟的比較及驗證，證實基豬圓環病毒核酸疫苗的研究及應用確實能 使小鼠機體產生抗豬圓環病毒的高抗體水平。
[0010] pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核質粒刺激小鼠機體產生抗體水平出現很高的陽性水 平，如表1 : 表1抗體檢測結果
【權利要求】
1. 一種基於豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法，其特徵在於：包括如下步驟 1) 將豬圓環病毒II型0RF1基因進行PCR擴增，豬圓環病毒II型0RF1基因具有如序 列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，擴增條件為：PCR體系總體積50 y L，其中ddH20 為 37 ii L，10XPCR Buffer 5 ii L，dNTP 1. 0 ii L，上下遊引物各 1. 0 ii L，DNA 模板 4. 0 ii L， Taq酶1.0 iiL;擴增程序為：94°C預變性3min;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸 1. 5min，共進行30個循環；最後延伸72°C lOmin ;上遊引物的序列為5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，下遊引物的序列為 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA-3，； 2) 將步驟1)中獲得的PCR產物在質量百分比為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的 條帶的凝膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，將PCR產物與pMD18-T載體連接，將連接 產物轉化入大腸埃希氏菌DH5 a感受態細胞，在37°C下培養12 h，挑取上述白色菌落，接種 到含有氨苄青黴素的2XYT液體培養基中，在37°C振蕩培養過夜至混濁，提取質粒並進行 酶切鑑定； 3 )將重組質粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進行Kpnl和Xmal雙酶切，回收純化目 的片段，將二者用T4 DNA連接酶於16°C連接過夜，連接產物轉化至大腸埃希氏菌DH5a感 受態細胞，用試劑盒提取質粒並進行Kpnl和Xmal雙酶切，用試劑盒(具體用什麼試劑盒？） 提取獲得陽性重組質粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，並進行雙酶切及PCR鑑定； 4) 真核構建體系為：目的DNA片段8iiL、pEGFP-Cl 2iiL、T4 DNA ligase0.5iiL、10XT4 DNA ligase buffer 1. 5 u L、滅菌 ddH20 3. 0 u L，總體積 15. 0 u L ; 5) 培養並收穫處於指數生長期的PK-15細胞，用胰蛋白酶消化後用6 mL營養液懸浮細 胞；然後取6孔細胞培養板，加1 mL上述細胞懸液和1 mL生長液，放入37°C濃度為5%的C02恆溫培養箱培養24 h，使細胞達709T80%融合時進行轉染，採用Lipofecttamine TM2000試 劑進行重組質粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1轉染試驗；在培養箱中培養48h，檢測轉染水平； 6) 將pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1經擴增培養後，獲得的pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1質粒作為 基於豬圓環病毒核酸疫苗。
【文檔編號】C12N15/66GK104353084SQ201410234838
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】王開功, 郭穎初, 周碧君, 文明, 程振濤 申請人:貴州大學