基於可調諧雷射的sted超分辨顯微鏡的製作方法
2023-11-02 21:27:02 1
基於可調諧雷射的sted超分辨顯微鏡的製作方法
【專利摘要】本發明涉及顯微鏡【技術領域】，提供的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡包括激發光單元、損耗光單元、第一二色鏡和掃描成像單元；激發光單元包括第一可調諧雷射光源；損耗光單元包括第二可調諧雷射光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片；掃描成像單元包括第二二色鏡、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、針孔透鏡和光電倍增管。本發明採用可調諧雷射光源作為STED超分辨顯微鏡中的激發光光源和損耗光光源，由於激發光波長和損耗光波長均可以根據需要進行調節設置，對於給定的螢光染料，可以找到適合的激發光波長和損耗光波長，擴大了STED超分辨顯微鏡的適用範圍。
【專利說明】基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡
【技術領域】
[0001]本發明涉及顯微鏡【技術領域】，尤其是涉及一種基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡。
【背景技術】
[0002]超分辨光學顯微術對生物醫學和材料學等領域的研究具有革命性的推動作用，其研究進展在很多科學領域內都產生了深遠的影響。超分辨光學顯微術由於實現方法不同，出現了多種類型:受激福射損耗(Stimulated Emission Depletion,STED)顯微術是建立在雷射共聚焦顯微術基礎上的一種光學超分辨顯微術，是首先提出也是最直接地客服光學衍射極限的遠場光學顯微術，相對於其它類型的超分辨顯微術，其成像速度相對較快，能夠對活細胞進行成像，在生物醫學研究中可以探測更精細的結構，也為材料科學領域研究提供了新手段。
[0003]在STED顯微成像系統中需要兩種雷射照明，一種雷射在物鏡焦點處形成近似艾利分布的光斑，對螢光物質進行激發，使得螢光物質發出螢光，這種照明雷射為激發光?』另一種在物鏡焦點處形成中央光強為零的圓環形光斑，使位於圓環上處於激發態的螢光物質損耗掉，不再發射螢光，只有位於圓環形焦斑中央暗區的螢光物質才能產生螢光，由於中央暗區的直徑遠小於衍射極限，故可獲得超越光學分辨極限的圖像。
[0004]給定波長的激發光只能用來激發吸收峰值位於該波長附近的螢光染料，給定波長的損耗光只能用來退激發螢光發射波長紅端和該損耗光波長接近的螢光染料，激發光波長、損耗光波長和螢光染料的吸收發射波長要匹配。目前的STED顯微成像系統多是採用固定波長的激發光或損耗光，這樣一來適合的螢光染料數量就很有限，能夠觀察的生物組織也就很有限；採用雙色或多色STED可以同時對兩種或多種螢光染料進行激發，擴大了系統的適用範圍，但即使採用雙色或多色STED也只是很有限地擴大了系統的適用範圍，實際生物學實驗中螢光染料千差萬別，有限的幾個激發光波長或損耗光波長不能滿足要求。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是:提供一種基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，激發光波長和損耗光波長均可以根據需要進行調節設置，擴大了 STED超分辨顯微成像系統的適用範圍。
[0006]本發明的技術方案是:
[0007]一種基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，其特徵在於，包括激發光單元、損耗光單元、第一二色鏡和掃描成像單元；
[0008]所述激發光單元包括第一可調諧雷射光源；所述損耗光單元包括第二可調諧雷射光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片，第二可調諧雷射光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片沿第二可調諧雷射光源的發光光路依次設置；所述掃描成像單元包括第二二色鏡、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、針孔透鏡和光電倍增管，掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡沿第二二色鏡的反射光路依次設置，針孔透鏡和光電倍增管沿第二二色鏡的透射光路依次設置；
[0009]所述第一二色鏡用於連接激發光單元和損耗光單元，第一二色鏡對激發光單元出射的激發光進行透射，對損耗光單元出射的損耗光進行反射；經第一二色鏡透射後的激發光和反射後的損耗光共同入射至第二二色鏡；第二二色鏡對入射的損耗光和激發光進行反射；
[0010]所述激發光單元中的第一可調諧雷射光源發出的激發光波長可根據需要進行設置，激發光單元出射的激發光經第一二色鏡透射、第二二色鏡反射、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第一光斑，所述第一光斑用於激發樣本中的螢光物質從而產生突光；
[0011]所述損耗光單元中的第二可調諧雷射光源發出的損耗光波長可根據需要進行設置，半玻片用於改變入射損耗光的偏振方向，渦旋相位片用於在損耗光光束中引入0-2 π的渦旋相位分布，四分之一波片用於將損耗光由線偏光轉為圓偏光，損耗光單元出射的損耗光經第一二色鏡、第二二色鏡、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第二光斑；所述第一光斑和第二光斑重疊；
[0012]所述樣本中的螢光物質發出的螢光經物鏡收集後經筒鏡、掃描透鏡透射和掃描振鏡反射，入射進第二二色鏡，並被第二二色鏡透射後經針孔透鏡被光電倍增管收集。
[0013]下面對上述技術方案進一步解釋:
[0014]所述第一二色鏡對激發光單元出射的激發光具有高透射率，對損耗光單元出射的損耗光具有高反射率；第二二色鏡對入射的損耗光和激發光具有高反射率，對激發光激發產生的螢光具有高透射率。
[0015]所述第一光斑為艾裡斑狀光斑；
[0016]所述第二光斑為麵包圈狀光斑，光斑的中央位置光強接近為零而周圍環狀區域光強較高。
[0017]所述艾裡斑狀光斑和麵包圈狀光斑重疊，使位於艾裡斑外圍區域上處於螢光發射態的螢光分子被損耗光退激發，不再產生螢光。
[0018]在所述光電倍增管和針孔透鏡之間設有針孔，所述針孔位於針孔透鏡的焦點處；所述樣本中的螢光物質發出的螢光經過針孔透鏡聚焦在針孔處，透過針孔的螢光被光電倍
增管收集。
[0019]本發明的優點是:
[0020]本發明採用可調諧雷射光源作為STED超分辨顯微鏡中的激發光光源和損耗光光源，由於激發光波長和損耗光波長均可以根據需要進行調節設置，對於給定的螢光染料，可以找到適合的激發光波長和損耗光波長，擴大了 STED超分辨顯微鏡的適用範圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明實施例提供的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡結構示意圖。
[0022]其中:基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡100、激發光單元110、第一可調諧雷射光源111、損耗光單元120、第二可調諧雷射光源121、半玻片122、渦旋相位片123、四分之一波片124、第一二色鏡130、掃描成像單元140、第二二色鏡141、掃描振鏡142、掃描透鏡
143、筒鏡144、物鏡145、針孔透鏡146、針孔147、光電倍增管148、樣本200。【具體實施方式】
[0023]請參考圖1。圖1中標有單箭頭的光路為雷射傳播光路；標有雙箭頭的光路為突光傳播光路。
[0024]實施例:基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡100包括激發光單元110、損耗光單元120、第一二色鏡130和掃描成像單元140。
[0025]激發光單兀110包括第一可調諧雷射光源111,該第一可調諧雷射光源111發出的激發光波長可根據需要進行設置。
[0026]損耗光單元120包括第二可調諧雷射光源121、半玻片122、渦旋相位片123和四分之一波片124，它們分別沿第二可調諧雷射光源121的發光光路依次設置。第二可調諧雷射光源121發出的損耗光波長也可根據需要進行設置。其中，半玻片122用於改變入射損耗光的偏振方向，潤旋相位片123用於在損耗光光束中引入0-2 π的潤旋相位分布，四分之一波片124用於將損耗光由線偏光轉為圓偏光。
[0027]第一二色鏡130用於連接激發光單元110和損耗光單元120，對激發光單元110出射的激發光進行透射，對損耗光單元120出射的損耗光進行反射。在一優選實施例中，第一二色鏡130對激發光單元110出射的激發光具有高透射率，對損耗光單元120出射的損耗光具有高反射率。
[0028]掃描成像單元140包括第二二色鏡141、掃描振鏡142、掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145、針孔透鏡146和光電倍增管148，掃描振鏡142、掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145沿第二二色鏡141的反射光路依次設置，針孔透鏡146和光電倍增管148沿第二二色鏡141的透射光路依次設置。經第一二色鏡130透射後的激發光和反射後的損耗光共同入射至第二二色鏡141，第二二色鏡141對入射的損耗光和激發光進行反射。在一優選實施例中，第二二色鏡141對入射的損耗光和激發光具有高反射率。
[0029]激發光單元110出射的激發光經第一二色鏡130透射、第二二色鏡141反射、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射，在物鏡145焦面處形成第一光斑，該第一光斑用於激發樣本200中的螢光物質從而產生螢光，螢光經物鏡145收集後經筒鏡
144、掃描透鏡143透射和掃描振鏡142反射，入射進第二二色鏡141，並被第二二色鏡141透射後經針孔透鏡146被光電倍增管148收集，光電倍增管148探測螢光並將螢光轉換成電信號，在一優選實施例中，第二二色鏡141對激發光激發產生的螢光具有高透射率。損耗光單元120出射的損耗光經第一二色鏡130、第二二色鏡141、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射,在物鏡145焦面處形成第二光斑。第一光斑和第二光斑重疊。
[0030]在一優選實施例中，第一光斑為艾裡斑狀光斑；第二光斑為麵包圈狀光斑，光斑的中央位置光強接近為零而周圍環狀區域光強較高。艾裡斑狀光斑和麵包圈狀光斑重疊在一起，使位於艾裡斑外圍區域上處於突光發射態的突光分子被損耗光退激發，不再產生突光，從而減小了螢光的有效發射區域，實現光學超分辨成像。
[0031]在另一優選實施例中，在光電倍增管148和針孔透鏡146之間設有針孔147，針孔147位於針孔透鏡146的焦點處；樣本200中的螢光物質發出的螢光經過針孔透鏡146聚焦在針孔147處，透過針孔147的螢光被光電倍增管148收集。[0032]本實施例工作討稈如下:
[0033]如圖1所示，第一可調諧雷射光源111發出激發光光束，經第一二色鏡130透射、第二二色鏡141反射、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射後，在物鏡145焦面處形成一個艾裡斑分布的光斑，用於激發樣本200中的螢光物質從而產生螢光；第二可調諧雷射光源121發出的損耗光光束經半玻片122、渦旋相位片123、四分之一玻片124後，經第一二色鏡130、第二二色鏡141、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射，在物鏡145的焦面處形成一個麵包圈形的光斑，光斑的中央位置光強接近為零而周圍環狀區域光強較高。激發光在物鏡145焦面處形成的艾裡斑狀光斑和損耗光在物鏡145焦面處形成的麵包圈狀光斑重疊在一起，使得位於艾裡斑外圍區域上處於螢光發射態的螢光分子被損耗光退激發，不再產生螢光，從而減小了螢光的有效發射區域，實現光學超分辨成像。樣本200中的螢光物質發出的螢光經物鏡145收集後經過筒鏡144和掃描透鏡143，之後被掃描振鏡142反射，入射進入第二二色鏡141，被第二二色鏡141透射，經過針孔透鏡146聚焦在針孔147處，透過針孔147的螢光被光電倍增管148收集。
[0034]本發明採用可調諧雷射光源作為STED超分辨顯微鏡中的激發光光源和損耗光光源，由於激發光波長和損耗光波長均可以根據需要進行調節設置，對於給定的螢光染料，可以找到適合的激發光波長和損耗光波長，擴大了 STED超分辨顯微鏡的適用範圍。
[0035]當然本發明的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡還可具有多種變換及改型，並不局限於上述實施方式的具體結構。總之，本發明的保護範圍應包括那些對於本領域普通技術人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
【權利要求】
1.一種基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，其特徵在於，包括激發光單元、損耗光單元、第一二色鏡和掃描成像單元； 所述激發光單元包括第一可調諧雷射光源；所述損耗光單元包括第二可調諧雷射光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片，第二可調諧雷射光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片沿第二可調諧雷射光源的發光光路依次設置；所述掃描成像單元包括第二二色鏡、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、針孔透鏡和光電倍增管，掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡沿第二二色鏡的反射光路依次設置，針孔透鏡和光電倍增管沿第二二色鏡的透射光路依次設置； 所述第一二色鏡用於連接激發光單元和損耗光單元，第一二色鏡對激發光單元出射的激發光進行透射，對損耗光單元出射的損耗光進行反射；經第一二色鏡透射後的激發光和反射後的損耗光共同入射至第二二色鏡；第二二色鏡對入射的損耗光和激發光進行反射； 所述激發光單元中的第一可調諧雷射光源發出的激發光波長可根據需要進行設置，激發光單元出射的激發光經第一二色鏡透射、第二二色鏡反射、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第一光斑，所述第一光斑用於激發樣本中的螢光物質從而產生突光； 所述損耗光單元中的第二可調諧雷射光源發出的損耗光波長可根據需要進行設置，半玻片用於改變入射損耗光的偏振方向，渦旋相位片用於在損耗光光束中引入0-2 π的渦旋相位分布，四分之一波片用於將損耗光由線偏光轉為圓偏光，損耗光單兀出射的損耗光經第一二色鏡、第二二色鏡、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第二光斑；所述第一光斑和第二光斑重疊； 所述樣本中的螢光物質發出的螢光經物鏡收集後經筒鏡、掃描透鏡透射和掃描振鏡反射，入射進第二二色鏡，並被第二二色鏡透射後經針孔透鏡被光電倍增管收集。
2.根據權利要求1所述的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，其特徵在於，所述第一二色鏡對激發光單元出射的激發光具有高透射率，對損耗光單元出射的損耗光具有高反射率；第二二色鏡對入射的損耗光和激發光具有高反射率，對激發光激發產生的螢光具有高透射率。
3.根據權利要求1所述的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，其特徵在於，所述第一光斑為艾裡斑狀光斑； 所述第二光斑為麵包圈狀光斑，光斑的中央位置光強接近為零而周圍環狀區域光強較聞。
4.根據權利要求3所述的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，其特徵在於，所述艾裡斑狀光斑和麵包圈狀光斑重疊，使位於艾裡斑外圍區域上處於螢光發射態的螢光分子被損耗光退激發，不再產生螢光。
5.根據權利要求1所述的基於可調諧雷射的STED超分辨顯微鏡，其特徵在於，在所述光電倍增管和針孔透鏡之間設有針孔，所述針孔位於針孔透鏡的焦點處；所述樣本中的螢光物質發出的螢光經過針孔透鏡聚焦在針孔處，透過針孔的螢光被光電倍增管收集。
【文檔編號】G01N21/64GK103698309SQ201310732247
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】張運海, 昌劍 申請人:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所