用於檢測磺胺類藥物的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒的製作方法

2023-11-02 21:12:22 1

專利名稱：用於檢測磺胺類藥物的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種能識別磺胺類藥物的單克隆抗體和一種用於檢測磺胺類藥物的酶聯免疫分析方法(ELISA)與試劑盒。
背景技術：
磺胺類藥物是一類化學合成抗菌藥，為畜禽抗感染治療中的重要藥物之一。由於不遵守休藥期，造成了磺胺類在可食性動物組織中殘留，這對人類健康造成嚴重威脅。研究表明體內殘留過多的磺胺藥可能引起過敏反應，容易引起耐藥菌的產生等。因此，如何控制磺胺類殘留仍然是當前亟待解決的問題，有關部門規定了動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留限量為ΙΟΟμ g/kg。磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法、儀器法、免疫法。微生物法敏感性差，耗時較長，且易受到其他抗生素的幹擾；儀器法靈敏度高，特異性強，已逐漸成為殘留分析主流方法，但是主要用於藥物的確證，而且儀器昂貴，要求有技術的檢測人員，不適用廣泛推廣；免疫分析法是以抗原抗體結合反應為原理，在簡化前處理和分析過程、降低檢測成本方面具有特殊意義，特別是酶聯免疫測定法的出現和使用，大大提高了殘留分析的效率， 已經迅速發展成為大量樣品的快速篩選方法。酶聯免疫方法是基於對藥物有識別能力的抗體。磺胺類藥物抗體的製備主要是針對單個的磺胺類藥物，通過N4端芳香氨基與載體蛋白連接，暴露出NI端不同的R基團， 例如製備磺胺喃唳、磺胺喹惡啉等藥物的抗體。當保留磺胺類藥物的共同結構對氨基苯磺醯胺不變，在NI端通過R基團連接載體蛋白，免疫後卻沒有得到對常用磺胺類藥物敏感的抗體。Sheth和Sporns(1991)合成了具有磺胺噻唑衍生物結構的半抗原,得到的多克隆抗體對9種磺胺藥物的IC5tl值低於5mg/L。Assi (1992)又合成了具有偶氮基團的磺胺吡啶衍生物，得到的多克隆抗體對7種磺胺的IC5tl值低於10mg/L。Muldoon (1999)採用N-磺胺-4-氨基苯甲酸-載體蛋白複合物免疫小鼠，得到的單克隆抗體對磺胺硝苯，磺胺吡啶和磺胺噻唑的IC5tl分別為I. 41,22. 8、322μ g/L。Cliquet (2003)採用了氨苯磺胺直接和蛋白相連，獲得的抗體效價較低，只能識別合成的半抗原，對原型藥物沒有結合。Franek(2006) 為了得到族特異性的抗體，合成了幾種單環和雙環半抗原分子，由雙環抗原得到的抗體建立的直接ELISA方法對15種磺胺藥物的IC5tl低於100 μ g/L。Zhang (2006)使用兩種磺胺母核結構的半抗原連接蛋白，得到的多克隆抗體，在直接競爭ELISA方法中，11種磺胺藥在 ΙΟΟμ g/L以下有50%抑制率。Adrian (2009)獲得的多克隆抗體，能夠在MRL水平以下，同時檢測牛奶中10種磺胺類藥物。可見，現有酶聯免疫法在磺胺類藥物殘留檢測的應用主要是針對單個磺胺類藥物，商品化試劑盒較多，而磺胺類藥物種類多，如果能夠建立一種同時檢測多個磺胺類藥物殘留的酶聯免疫方法，將大大減少工作量，更有應用價值。目前，國內外對磺胺類藥物多殘留免疫方法的研究大多處於實驗室階段，建立的ELSIA方法大多數基於多克隆抗體，變異性較大，不夠穩定，製備的單克隆抗體親和力較差，對大多數磺胺類藥物識別能力不夠。

發明內容
本發明的第一個目的在於提供一種能識別多種磺胺類藥物的單克隆抗體。本發明的第二個目的是利用該單克隆抗體，建立一種能用於磺胺類藥物檢測的酶聯免疫方法。本發明的第三個目的是提供適用於磺胺類藥物檢測的試劑盒。本發明的第四個目的是提供所述單克隆抗體在製備檢測磺胺類藥物的酶聯免疫試劑盒中的應用。本發明的第五個目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在檢測動物組織磺胺類藥物殘留中的應用。本發明通過以下技術方案實現一種能識別磺胺類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC NO C201148的雜交瘤細胞4E5所分泌的。上述雜交瘤細胞4E5，保藏在位於湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO C201148o所用的免疫原是由半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯製備的。進一步，本發明提供了一種適用於磺胺類藥物檢測的酶聯免疫方法，該方法包括免疫原、包被原和抗體的製備以及樣品的處理和檢測等步驟，具體如下(I)將半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到免疫原；(2)將半抗原磺胺嘧啶(H3)與卵清蛋白(OVA)偶聯得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCC NO C201148的雜交瘤細胞4E5 ；(4)用保藏號為CCTCC NO C201148的雜交瘤細胞4E5製備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體(如酶標板)；(6)將待測樣品用磷酸鹽緩衝液(PBS，pH8-9)提取，離心後取上清，得到待測物；(7)對步驟￠)的待測物進行酶聯免疫檢測，步驟(6)磷酸鹽緩衝液(pH8_9)的配製方法為準確稱取KH2PO4 O. 41g, K2HPO4 5. 59g加雙蒸水至1000mL。本發明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規的其他試劑組合，製成了能檢測多種磺胺類藥物的酶聯免疫試劑盒，結合上述酶聯免疫方法，實現了對多種磺胺類藥物的酶聯免疫檢測。本發明的有益效果是(I)本發明製備的單克隆抗體能夠識別16種磺胺類藥物，現有技術中還沒有抗體能識別相同種類的藥物；(2)本發明建立的酶聯免疫方法可以同時檢測16種磺胺類藥物的殘留，提高了磺胺類藥物的檢測效率，方法適用範圍廣；(3)本發明涉及的樣品處理方法簡便，易操作，而且回收率高，準確度和精密度好。


圖I為本發明的技術路線圖。圖2為本發明的以磺胺二甲嘧啶為標準品的間接競爭ELISA反應標準曲線，X軸為磺胺二甲嘧啶(SM2)標準溶液濃度對數值，Y軸為磺胺二甲嘧啶標準品溶液的光密度值除以「零」孔光密度值
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明。實施例I免疫原和包被原的製備免疫原的製備準確稱取半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)60mg，N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 34mg，I，3-二環己基碳二亞胺(DCC) 45mg，加入N，N-二甲基甲醯胺(DMF)l. 5mL溶解， 磁力攪拌下，於4°C反應18小時，過濾除去沉澱，濾液用於連接蛋白。取牛血清白蛋白IOOmg溶解於IOmL的PBS緩衝液，在磁力攪拌下，將上述濾液ImL 逐滴加入到蛋白溶液中，4°C反應21小時。將反應液裝入透析袋中，於PBS緩衝液中透析3 天，每6h更換一次透析液，即得偶聯物H1-BSA，作為免疫原用。包被原的製備依據上述免疫原製備步驟，將Hl換成磺胺嘧啶(H3)，BSA換成 0VA,即得偶聯物H3-0VA，作為包被原用。實施例2單克隆抗體的製備雜交瘤細胞的製備參照薛慶善《體外培養的原理與技術》(科學出版社2001年版)中的方法以實施例I製備的偶聯物Hl-BSA為免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序採用一次基礎免疫及數次加強免疫。首次免疫時用與等體積的弗氏完全佐劑乳化的含 IOOyg免疫原的蛋白乳液注射於小鼠的頸背部皮下進行基礎免疫，以後每隔15天用弗氏不完全佐劑乳化的含ΙΟΟμ g免疫原的蛋白乳液進行加強免疫。從免疫三次起，每次免疫後第8天採尾血，分離血清，間接ELISA法檢測血清抗體效價。免疫合格的小鼠(效價高、靈敏度好)停止免疫以備融合。在融合前3天(最好與上次免疫相隔3周以上)給免疫合格的小鼠腹腔注射含 IOOyg免疫原的蛋白溶液(不加佐劑)，強化免疫。根據骨髓瘤細胞的計數結果，取3 5 X IO7個骨髓瘤細胞與免疫脾細胞混合(比例為I : 10 5 : 10)。1500r/分鐘離心5 分鐘，將離心管上清倒盡後，倒扣在吸水紙上，控幹水滴。輕輕地敲擊管底，使管底細胞成糊狀，將其放置於37°C水浴中，將吸有O. 8mL預溫至37°C的50% PEG(購自Amersco)的ImL 刻度吸管插入到管底，60秒內緩緩加PEG到混合細胞上，邊加邊輕輕攪拌，加完後靜置90 秒，將離心管插到離心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL預溫至37°C的RPMI 1640基礎培養液(購自Hyclone)沿管壁緩緩加到融合細胞上，邊加邊輕輕晃動離心管，第I分鐘逐滴加入ImL (3秒/滴)，第2分鐘再加2mL，最後加完剩下的7mL (5分鐘內加完)。加完第一個IOmL後，接著沿管壁補加RPMI 1640培養基至50mL，加完後擰緊蓋，緩慢顛倒幾次，混勻。1500r/分鐘離心5分鐘，棄去上清，用含有飼養細胞的72mL HAT完全培養基輕輕將融合細胞攪拌重懸。將融合細胞懸液接種於96孔細胞培養板中，2滴/孔。一次融合可接種 5塊96孔細胞培養板，置於37°C 5% C02培養箱中培養。從融合當天算起為0d，前面3天儘量不要動細胞板，保持培養箱內環境穩定。第3天每孔補加I滴HAT完全培養基(購自Amersco)並觀察集落生長情況；第5天每孔吸出 1/2培養上清(100 μ L)，再加入I滴HT完全培養基(購自Amersco)；以後每隔3天同上法吸去1/2培養上清，換入HT完全培養基。根據細胞的生長情況，當細胞生長至佔孔底面積 1/4左右即可取細胞培養上清，以發明人製備的H3-0VA偶聯物為包被原，利用ELISA方法篩選出分泌磺胺類抗體的陽性細胞孔。對篩選出來的陽性細胞孔利用有限稀釋法連續3次克隆化,最終建立一株穩定分泌抗磺胺類抗體的雜交瘤細胞。對該雜交瘤細胞進行染色體計數，平均值為103. 3條，高於親本細胞的染色體數目(SP2/0骨髓瘤細胞的染色體平均數為 58條，脾細胞染色體為40條)，說明融合細胞的確是SP2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的雜交產物。申請人將該雜交瘤細胞命名為4E5，並於2011年6月29日送交位於湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC NO :C201148。腹水單抗製備與鑑定在接種前7天取Balb/c小鼠數隻，每隻小鼠腹腔注射
O.5ml弗氏不完全佐劑進行預處理。用RPMI 1640基礎培養基懸浮由保藏號為CCTCC NO: C201148的雜交瘤細胞4E5擴大培養的細胞，並將細胞數調至I X IO6個/mL，每隻小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動時採集腹水。按照文獻方法(朱立平，陳學清.免疫學常用實驗方法.北京人民軍醫出版社，2000)，純化獲得單克隆抗體。 採用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑑定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對本發明所得到的單克隆抗體進行亞型鑑定，結果為小鼠IgGl亞型。實施例3間接競爭ELISA檢測方法的建立3. I試劑配製碳酸鹽緩衝液(pH9. 6):準確稱取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超純水溶解， 定容至1000mL。洗滌液(pH7.4):準確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · Iffi2O 2. 90g, KC10. 20g，少量超純水溶解，加入Tween 20 0. 50mL，定容至1000mL。磷酸鹽緩衝液(ρΗ7·4):準確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KCl 0. 20g,少量超純水溶解，定容至IOOOmL0封閉液準確稱取卵清蛋白10. 00g，加入磷酸鹽緩衝液IOOOmL,攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。底物混合液準確吸取底物B液(購自武漢市飛遠科技有限公司)10mL，加入 100 μ L底物A液(購自武漢市飛遠科技有限公司)，混勻，現配現用。終止液準確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。3. 2方陣滴定法採用方陣滴定法初步選擇包被原濃度和抗體稀釋度。使用碳酸鹽緩衝液將H3-0VA 包被原倍比稀釋成32、16、8、4、2、1、0. 5,0. 25 μ g/mL,從第一至第八行依次橫向加入96 孔酶標板，4°C過夜；洗滌3次，拍幹，加入封閉液250μ L，37°C封閉2小時；洗滌3次，拍幹，單克隆抗體使用磷酸鹽緩衝液倍比稀釋成I : 1000、1 2000,1 4000,1 8000、 I 16000、I 32000、I 64000、I 128000、I 256000，從第一至第八列依次縱向加入96孔酶標板加入酶標板，37°C孵育30分鐘；洗滌3次，拍幹，各孔加入用磷酸鹽緩衝液 I 5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(簡稱二抗，以下所指二抗均為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體，購自武漢飛羿生物技術有限公司)100yL，37°C孵育30分鐘；洗滌4次，拍幹，各孔加入底物混合液100 μ L，避光顯色15分鐘；加入終止液 50 μ L ;用自動酶標儀在450nm波長處測定光密度值(0D值)。方陣滴定結果見表1，初步選擇幾個OD值接近2. 0，且相鄰兩孔OD值有較大變化的包被濃度及對應的抗體稀釋度組合。 結果表明，可選擇以下包被原濃度和抗體稀釋度組合(8，64000)和(4，32000)。表I單克隆抗體方陣滴定
權利要求
1.一種能識別磺胺類藥物的單克隆抗體，其特徵在於，它是由保藏號為CCTCC NO: C201148的雜交瘤細胞4E5所分泌的。
2.權利要求I所述的雜交瘤細胞4E5，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為 CCTCC NO C201148o
3.包含權利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，該試劑盒是檢測磺胺類藥物的酶聯免疫試劑盒。
5.一種檢測磺胺類藥物的酶聯免疫方法，包括免疫原、包被原、抗體的製備以及樣品的處理和檢測，其步驟如下(1)將半抗原磺胺二甲嘧啶與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原；(2)將半抗原磺胺嘧啶與卵清蛋白偶聯得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細胞融合與篩選得到保藏號為CCTCCNO C201148的雜交瘤細胞4E5 ；(4)用保藏號為CCTCCNO C201148的雜交瘤細胞4E5製備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6)將待測樣品用PH8-9的磷酸鹽緩衝液提取，離心後取上清，得到待測物；(7)對步驟￠)的待測物進行酶聯免疫檢測。
6.權利要求I所述的單克隆抗體在製備檢測磺胺類藥物的酶聯免疫試劑盒中的應用。
7.權利要求3或4所述的試劑盒在檢測動物組織磺胺類藥物殘留中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種能識別磺胺類的特異性單克隆抗體，本發明的單克隆抗體是由雜交瘤細胞4E5所分泌的，該雜交瘤細胞保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOC201148。本發明還公開了特異性單克隆抗體、包被原、免疫原的製備方法和酶聯免疫檢測方法及酶聯免疫分析檢測試劑盒。與現有技術相比，本發明製備得到的單克隆抗體可識別多種磺胺類藥物，本發明的酶聯免疫檢測方法及試劑盒具有簡便、快速、靈敏、準確等優點。
文檔編號G01N33/543GK102608318SQ20121004519
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者劉振利, 周琪, 彭大鵬, 戴夢紅, 潘源虎, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛, 黃玲利 申請人:華中農業大學