聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法及其應用的製作方法
2023-11-03 05:58:42 2
專利名稱：聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於病毒學、分子生物學和生物製品領域，尤其是一種聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法及其應用。
背景技術：
聖路易斯腦炎病毒屬於黃病毒科，黃病毒屬，1933年在美國聖路易、堪薩斯和密蘇裡等地約發生3000多例聖路易斯腦炎病毒感染，於死亡病人腦中分離到此病毒而得名。聖路易斯腦炎病毒是有包膜的線性單股正鏈RNA病毒，基因組RNA約為111Λ，病毒顆粒為圓形，大小約40 60 nm。通常，聖路易斯腦炎病毒的結構蛋白中，C蛋白構成病毒核衣殼，M 蛋白、E蛋白為病毒的包膜蛋白。PrM蛋白是膜蛋白M的前體，除具有抗原功能區外，還有助於E蛋白的正確摺疊及穩定。E蛋白位於病毒顆粒的脂質雙層中，構成病毒顆粒表面的突起，含有多種B細胞和T細胞抗原表位，是聖路易斯腦炎病毒的主要保護性抗原。因此，prM 蛋白和E蛋白成為研究聖路易斯腦炎的重要靶標。聖路易斯腦炎作為嚴重損害人類健康的病原微生物，具有高度傳染性，一經流行將引發巨大社會恐慌，因此，研製快速高效的診斷試劑並找到一種有效的疫苗對於防止聖路易斯腦炎感染無疑具有重要意義。儘管相關的研究工作在不少實驗室開展，但由於聖路易斯腦炎病毒的高度傳染性，其病原體研究必須在P3級實驗室中進行，這也極大的限制了對聖路易斯腦炎病毒的進一步了解。病毒樣顆粒由於類似真實的病毒顆粒結構並不具有感染性使之成為用於聖路易斯腦炎病原體研究的安全的替代模型；其效果優於基於單個病毒蛋白的免疫學檢測方法已得到證明，因此病毒樣顆粒的研製成功對於烈性病毒診斷試劑的研製具有顯著價值；同時， 病毒樣顆粒代表一類特殊的亞單位疫苗，相比之下，它們更容易被機體免疫系統識別，並以一個更接近真實構象的形式呈遞病毒抗原，因而是一個非常好的疫苗候選物。病毒樣顆粒是模擬真實病毒顆粒結構的一種高效的亞單位疫苗，並且不含有感染性的病毒遺傳物質； 實際上，病毒樣顆粒完全沒有RNA或DNA病毒的基因組成分，只是具有滅活病毒或減毒活疫苗病毒顆粒衣殼的真實構象，因而沒有病毒毒力回復或病毒基因重組或重配的可能。因此，作為一種很有發展前景的疫苗候選物和安全的病毒研究替代模型，對於聖路易斯腦炎病毒這樣的病原體研究和預防控制無疑具有更為重要的意義。開發一種方便、可靠的血清診斷方法來檢測受感染個體血清內的抗聖路易斯腦炎病毒抗體不僅有利於臨床病毒病的診斷，而且對於感染流行病學都具有重要的意義。在血清學免疫檢測如EIA中使用細菌表達蛋白作為抗原存在較多潛在缺點。例如，在將大腸桿菌裂解液作為抗原用於免疫測試時會造成患者血清與大腸桿菌蛋白的非特異性交叉反應性(Purdy 等，1992，Archives of Virology, 123335-349)。另外，已經證明，膜糖蛋白上的一些抗原和免疫原性表位與構象高度相關，在大腸桿菌中表達的糖蛋白喪失了免疫原性和抗原性。此外，信號肽在外源蛋白質的表達中具有重要作用，不僅能引導外源蛋白質的分泌表達，還與蛋白質或其新生肽鏈在細胞內的全方位的定位有關。
發明內容
為解決現有技術存在的問題，本發明一種聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法， 該方法具體為
1)選取GenBank資料庫中聖路易斯腦炎病毒HiAbard的基因序列、基因序列序列號為 EU566860，進行聖路易斯腦炎病毒基因的合成，獲得重組質粒；
2)重組質粒轉染哺乳動物細胞^3T，轉染的細胞收穫後進行瞬時表達分析；
3)通過相應的純化方法獲得相應的表達蛋白，並形成聖路易斯腦炎病毒樣顆粒。進一步，所述步驟1)中PCR方法進行聖路易斯腦炎病毒基因的合成，該PCR方法具體為
1)設計用於信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下遊引物，外源信號肽上遊引物JF: 5，CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下遊引物 JR 5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上遊引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3，和下遊引物 MER :5，CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，；
2)以劃線部分分別為BamHI和)(h0 I酶切位點，以信號肽和SLEV-ME基因為模板，通過融合PCR擴增JME基因全長；
3)凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進行BamHI、 Xho I雙酶切，膠回收後T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化DH5 α，挑取單克隆菌落，擴菌提取重組質粒。進一步，所述擴增條件為先於95°C、5 min，然後 95°C、30s，65°C、30 s，72°C、3 min,擴增 35 個循環，72°C、IOmin0進一步，所述步驟2)中重組質粒轉染哺乳動物細胞四31的具體步驟為轉染前18-24小時接種細胞到T25細胞瓶中；將IOug質粒加入Iml無血清培養基中，再加入20ulPEI，室溫孵育IOmin;倒掉舊的培養基，用無血清培養基洗兩遍；加2ml培養基， 370C /5%C02孵育3小時後補加2ml培養基，72小時後進行瞬時表達分析。進一步，所述步驟3)中純化方法具體為
1)將所述轉染的細胞收穫物經反覆凍融及超聲破碎；
2)將上清和破碎細胞離心去除細胞碎片；
3)將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；
4)收集上清，100KD超濾濃縮後加PBS離心緩衝液重複超濾濃縮；
5)棄去上清，PBS重懸；
6)用10%-60%的連續性蔗糖梯度離心；
7)離心分層後，逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA 通過E蛋白單克隆抗體或聖路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，獲得聖路易斯腦炎病毒樣顆粒。一種以聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的細胞為抗原建立的間接免疫螢光檢測方法，具體為收集轉染設定時間後的細胞，用預冷的IxPBS清洗細胞，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾乾，用冷丙酮進行固定，加入稀釋的抗SLEV抗體37度孵育設定時間，漂洗液洗滌；加入異硫氰酸螢光素標記的山羊抗小鼠IgG室溫結合；漂洗液洗滌後於螢光顯微鏡下觀察。一種以純化的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的蛋白印跡檢測方法，具體為
1)裂解的蛋白行SDS-PAGE後轉膜；
2)封閉將膜放入可密封的塑膠袋中，加入適量的TBS配置的脫脂奶封閉液中，室溫封閉設定時間；
3)抗體的結合用TBS配置的脫脂奶稀釋純化的抗SLEV鼠單克隆抗體作為一抗，將 PVDF膜與稀釋好的抗體室溫搖床孵育設定時間；
4)洗去未結合的抗體用TBS-T漂洗濾膜；
5)二抗的結合用TBS配置的脫脂奶稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌後的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫搖床孵育設定時間後，將膜用TBS-T洗滌；
6)DAB顯色用TBS洗滌膜，去除磷酸和Tween 20，將膜放入DAB底物顯色液中顯色， 注意觀察顯色情況，至棕色條帶出現時終止反應，照相後避光保存。進一步，所述步驟1)具體為 a取樣品進行SDS-PAGE ；
b當電泳結束時，用蒸餾水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2張3匪濾紙和一張PVDF濾膜，使其大小與凝膠大小相適應；
d.先將濾紙浸入轉移緩衝液中，至少平衡15min，PVDF膜需進行前處理，置於100%甲醇中浸溼約5min將膜激活，再用轉移緩衝液漂洗2次；
e.半乾轉移儀下面的電極是陽極，故在轉移緩衝液中按從下至上的順序排列濾紙一轉移膜一凝膠一濾紙(可在膜的右上角切一標記，以標記膜的正反面)，各層之間應避免留有氣泡；
f.將其置入半乾轉移儀中，膠側置負極，膜側置正極；
g.通電轉移根據凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，電轉移45min ；
h.轉移結束後，斷開電源並拔下插頭，從上到下拆卸轉移裝置，逐一掀去各層，凝膠可移至盛有考馬斯亮藍染色液的託盤中進行染色，以便檢查蛋白轉移是否完全，PVDF膜用於下一步實驗。一種以聖路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的檢測聖路易斯病毒抗體的間接 ELISA法，具體為
1)包被抗原將純化的蛋白抗原用ELISA包被液稀釋，反應板每孔加100ul，4°C冰箱過
夜；
2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置:3min，反覆三次，最後將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3 )加 15 % FBS 封閉液 200u 1，37 °C 放置 2h ；
4)拍幹後超淨颱風機吹乾；
5)加抗體小鼠抗SLEV抗體用封閉液1:200倍稀釋，反應板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih ；
6)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反覆三次；7)加辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG，每孔lOOul，37°C放置lh;
8)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反覆三次；
9)加底物加TMBlOOul，室溫暗處放置IOmin；
10)加終止液每孔50ul；
11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄450nm讀數。一種用於人體以預防聖路易斯腦炎病毒感染的疫苗，它含有所述聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的配伍組合。一種檢測聖路易斯腦炎病毒的試劑盒，將重組的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒作為抗原組分構成，用於SLEVIgG ELISA診斷試劑盒或SLEVIgM ELISA診斷試劑盒。本發明基於當前聖路易斯腦炎病毒的研究現狀和細胞已經用於重組蛋白大量生產的現實，建立通過這種哺乳動物細胞分泌表達聖路易斯腦炎病毒重組蛋白並使之裝配成病毒樣顆粒的方法將是非常有用的。該系統產生的重組蛋白具有天然蛋白的免疫學特性，且不含有聖路易斯腦炎病毒感染性基因組，可以作為更具代表性的抗原或者更有效的免疫原，從而應用於聖路易斯腦炎病毒的診斷、預防和治療工作中。
圖1為顯示HiAbard和Kern217毒株全基因組同源性分析結果； 圖2為顯示25株聖路易斯腦炎病毒E基因同源性分析結果；
圖3為顯示重組質粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鑑定結果；
圖4為顯示用於真核表達聖路易斯腦炎病毒蛋白而構建的重組質粒；
圖5A為正常細胞檢測結果；
圖5Β為轉染重組質粒P⑶NA5-SJME的檢測結果；
圖6為用聖路易斯腦炎病毒E單抗(millipore)進行Western印跡雜交；
圖7A為顯示細胞培養上清收穫物中病毒樣顆粒的電子顯微鏡照片；
圖7B為圖7A中C部放大圖。
具體實施例方式如圖1至圖7所示，圖1顯示HiAbard和Kern217毒株全基因組同源性分析結果， 兩個毒株的同源性為94. 3%，差異較小。圖2顯示25株聖路易斯腦炎病毒E基因同源性分析結果，不同毒株間，SE基因同源性為90. 2%-99. 7%不等，相對來說差異不大。圖3顯示重組質粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鑑定結果，泳道Ml為DNA分子量標記物，泳道1顯示BamH I和Bio I雙酶切重組質粒，泳道2顯示BamH I單酶切重組質粒 pcDNA5/FRT-SJME0圖4顯示用於真核表達聖路易斯腦炎病毒蛋白而構建的重組質粒。圖5A、5B顯示間接免疫螢光檢測蛋白表達結果，圖5A為正常細胞檢測結果， 圖5Β為轉染重組質粒P⑶NA5-SJME的檢測結果。圖6為用聖路易斯腦炎病毒E單抗(millipore)進行Wfestern印跡雜交。泳道1 為蔗糖密度梯度超速離心純化後共表達聖路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白的細胞收穫物沉澱物樣品；泳道2顯示蔗糖密度梯度超速離心純化後共表達聖路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白的細胞培養上清液沉澱物樣品；泳道3為正常的四31~細胞；泳道M為蛋白質分子量標記物。圖中箭頭所指A部表示相應蛋白帶膜蛋白E。圖7Α顯示細胞培養上清收穫物中病毒樣顆粒的電子顯微鏡照片，這些顆粒是膜蛋白(Μ和E蛋白)在細胞中共表達而產生並分泌到上清的。圖7Β為圖7Α中B部放大圖，該空心顆粒表面具有釘狀突起，為在哺乳動物細胞中表達的Μ、E蛋白共同裝配形成。)
本發明針對具有天然聖路易斯腦炎病毒免疫特性的重組聖路易斯腦炎病毒膜蛋白的生產方法和應用。本發明特別針對用於聖路易斯腦炎ELISA診斷試劑的製備及其間接免疫螢光檢測試劑的生產。本發明特別針對聖路易斯腦炎病毒感染的預防性疫苗的生產。本發明通過以哺乳動物細胞表達聖路易斯腦炎病毒重組蛋白以及共表達Μ、E蛋白的重組病毒樣顆粒進行實際舉例說明。這種舉例說明不限制本發明的使用範圍。本發明解決的技術問題是要將聖路易斯腦炎病毒PrM、E片段編碼區序列克隆到真核表達載體，轉染細胞，通過相應的純化方法獲得這些表達蛋白並可以形成相應病毒樣顆粒成分，以及這些重組蛋白及病毒樣顆粒的應用。本發明涉及製備衍生自聖路易斯腦炎病毒PrM、E片段基因組編碼區序列的重組病毒蛋白的方法，它通過將DNA插入表達載體，然後在宿主細胞中表達重組蛋白形成病毒樣顆粒。本發明生產的重組蛋白、病毒樣顆粒可用於對聖路易斯腦炎病毒進行臨床診斷。 可將重組蛋白，病毒樣顆粒置於聖路易斯腦炎病毒檢測試劑盒的配方中。提供下列實施例以進一步明確本發明，但並不限制本發明於這些實施例的個別事例。一包含引入外源信號肽的聖路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白基因編碼區序列的真核表達載體的構建(pcDNA5/FRT -SJME)
對GenBank資料庫中兩株聖路易斯腦炎病毒HiAbard和Kern217全基因組和25個毒株E基因進行比對，最終確定以HiAbard的基因序列(GenBank序列號為EU566860)進行聖路易斯腦炎病毒基因的合成。通過拼接PCR方法擴增帶有外源信號肽的prM-E基因，將其基因克隆至pcDNA5/ FRT載體，獲得重組質粒pcDNA5-SJME。具體步驟如下
設計用於信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下遊引物，外源信號肽上遊引物JF :5』 CGRRatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下遊引物 JR :5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上遊引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATC A 3，和下遊引物 MER :5，CCGctcRaRCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，，劃線部分分別為 BamH I和Bio I酶切位點，以信號肽和SLEV-ME基因為模板，通過融合PCR擴增JME基因全長。擴增條件先於95°C、5 min，然後95°C、30s，65°C、30 s，72°C、3 min，擴增35個循環， 72°C、IOmin。凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進行BamH I、 Xho I雙酶切，膠回收後T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化DH5 α，挑取單克隆菌落，擴菌提取質粒。二、重組質粒瞬時轉染細胞以前面構建引入信號肽的共表達聖路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白的重組質粒轉染哺乳動物細胞^3T，轉染的細胞收穫後進行瞬時表達分析。具體步驟如下
轉染前18-Μ小時接種細胞到Τ25細胞瓶中(密度>85%)；將IOug質粒加入Iml無血清培養基中，在加入20ulPEI (lmg/ml)，室溫孵育IOmin ；倒掉舊的培養基，用無血清培養基洗兩遍。加2ml (2%serum)培養基共3ml，37°C /5%C02孵育3小時後補加2ml (2%serum) 培養基，72小時後進行瞬時表達分析。三、聖路易斯腦炎病毒蛋白在細胞中的表達
在重組質粒瞬時轉染細胞的基礎上，建立了間接免疫螢光檢測轉染細胞病毒蛋白表達的鑑定方法，具體步驟如下
收集轉染後細胞，用預冷的IxPBS清洗細胞兩遍，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾乾，冷丙酮固定lOmin，加入稀釋的抗SLEV抗體(使用PBS 1 40稀釋)37度孵育1 h， 漂洗液洗滌5次，每次;3min;加入異硫氰酸螢光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG室溫結合40min(使用伊文思蘭1:50稀釋)。漂洗液洗滌5次後於螢光顯微鏡下觀察。四哺乳動物細胞表達聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的純化
細胞收穫物經反覆凍融及超聲破碎和細胞培養上清IOOOOrpm離心IOmin去除細胞碎片，將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾後，以IOOKD超濾管濃縮濃縮50000 rpm超速離心棄去上清，細胞重懸於約200ulPBS後，用10%-60%的連續性蔗糖梯度離心，離心分層後， 逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA通過E蛋白單克隆抗體或聖路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，是為聖路易斯腦炎病毒樣顆粒所在組分。具體步驟如下
(1)細胞反覆凍融3次，超聲破碎；
(2)將上清和破碎細胞4°CIOOOOrpm離心IOmin去除細胞碎片；
(3)將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；
(4)收集上清，IOOKD超濾濃縮後加PBS離心緩衝液重複超濾濃縮，透過的液體-80°C 保存；
(5)50000rpm, 3h, 4°C (SW55Ti 轉子)棄去上清，200ul PBS 重懸;
(6)10%_60% 的連續性蔗糖梯度離心，30000rpm，2. 5h，10°C (SW55Ti 轉子)；
(7)收集各層，每層55000印111，汕，41(SW55Ti轉子)，留沉澱加20ulPBS (蛋白酶抑制劑)，4°C保存。五純化產物的蛋白印跡檢測 Western Blot 分析
米用 Bio-Rad 公司的 Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell 進行半乾法蛋白質轉移實驗
1)裂解的蛋白行SDS-PAGE後轉膜 a取樣品進行SDS-PAGE ； b當電泳結束時，用蒸餾水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2張3匪濾紙和一張PVDF濾膜，使其大小與凝膠大小相適應；
d.先將濾紙浸入轉移緩衝液中，至少平衡15min，PVDF膜需進行前處理，置於100%甲醇中浸溼約5min將膜激活，再用轉移緩衝液漂洗2次；
10e.半乾轉移儀下面的電極是陽極，故在轉移緩衝液中按從下至上的順序排列濾紙一轉移膜一凝膠一濾紙(可在膜的右上角切一標記，以標記膜的正反面)，各層之間應避免留有氣泡；
f.將其置入半乾轉移儀中，膠側置負極，膜側置正極；
g.通電轉移根據凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，電轉移45min ；
h.轉移結束後，斷開電源並拔下插頭，從上到下拆卸轉移裝置，逐一掀去各層，凝膠可移至盛有考馬斯亮藍染色液的託盤中進行染色，以便檢查蛋白轉移是否完全，PVDF膜用於下一步實驗；
2)封閉將膜放入可密封的塑膠袋中，加入適量的TBS配置的5%(w/v)脫脂奶封閉液中，室溫封閉1 一 2小時；
3)抗體的結合用TBS配置的5%(w/v)脫脂奶1 :200稀釋純化的抗SLEV鼠單克隆抗體作為一抗，將PVDF膜與稀釋好的抗體室溫搖床孵育2小時；
4)洗去未結合的抗體用TBS-T(0. 5%的Tween20)漂洗濾膜3次，每次5min ；
5)二抗的結合用TBS配置的5% (w/v)脫脂奶1 :500稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌後的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫搖床孵育1小時後將膜用TBS-T洗滌 3次；
6)DAB顯色用50mlTBS洗滌膜，去除磷酸和Tween 20。將膜放入DAB底物顯色液中顯色10 30分鐘，注意觀察顯色情況。至棕色條帶出現時終止反應，照相後避光保存。六間接ELISA法的建立
1)包被抗原將純化的蛋白抗原用ELISA包被液稀釋，反應板每孔加100ul，4°C冰箱過
夜；
2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反覆三次，最後將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3)加1 5 % FBS 封閉液 200ul，37°C放置 2h ；
4)拍幹後超淨颱風機吹乾；
5)加抗體小鼠抗SLEV抗體用封閉液1:200倍稀釋，反應板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih ；
6)洗滌同2);
7)加辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG(1:5000倍稀釋)，每孔lOOul, 37°C放置Ih ；
8)洗滌同2);
9)加底物加TMBlOOul，室溫暗處放置IOmin；
10)加終止液每孔50ul；
11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄450nm讀數。本發明中，使聖路易斯腦炎病毒樣顆粒能夠高分泌表達的信號肽及包含編碼包括所述信號肽和聖路易斯腦炎病毒包膜蛋白(M，E)重組病毒的構建及其在相應重組病毒感染哺乳動物細胞中的共表達，以及由這些共表達蛋白在哺乳動物細胞中自動組裝而形成的病毒樣顆粒。以哺乳動物細胞生產的這些蛋白或病毒樣顆粒可作為抗原建立聖路易斯腦炎病毒的免疫檢測方法，亦可用於製備聖路易斯腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發及治療方面。 通過哺乳動物細胞表達系統得到的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒是非複製型的，結構接近天然病毒，且免疫原性好，可作為天然病毒抗原建立檢測聖路易斯腦炎感染的免疫檢測方法，表達路易斯腦炎包膜蛋白的細胞，可建立間接免疫螢光檢測方法，進一步的應用還包括將得到的病毒樣顆粒或重組蛋白可按一定的作用劑量作為亞單位疫苗直接用於人體用於預防聖路易斯腦炎病毒感染。
權利要求
1.一種聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法，其特徵在於，該方法具體為1)選取GenBank資料庫中聖路易斯腦炎病毒HiAbard的基因序列、基因序列序列號為 EU566860，進行聖路易斯腦炎病毒基因的合成，獲得重組質粒；2)重組質粒轉染哺乳動物細胞^3T，轉染的細胞收穫後進行瞬時表達分析；3)通過相應的純化方法獲得相應的表達蛋白，並形成聖路易斯腦炎病毒樣顆粒。
2.如權利要求1所述的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法，其特徵在於，所述步驟1)中PCR方法進行聖路易斯腦炎病毒基因的合成，該PCR方法具體為1)設計用於信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下遊引物，外源信號肽上遊引物JF: 5，CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下遊引物 JR 5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上遊引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3，和下遊引物 MER :5，CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，；2)以劃線部分分別為BamHI和)(h0 I酶切位點，以信號肽和SLEV-ME基因為模板，通過融合PCR擴增JME基因全長；3)凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進行BamHI、 Xho I雙酶切，膠回收後T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化DH5 α，挑取單克隆菌落，擴菌提取重組質粒。
3.如權利要求1所述的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)中重組質粒轉染哺乳動物細胞的具體步驟為轉染前18- 小時接種細胞到T25細胞瓶中；將IOug質粒加入Iml無血清培養基中，再加入20ulPEI，室溫孵育IOmin ；倒掉舊的培養基，用無血清培養基洗兩遍；加2ml培養基，370C /5%C02孵育3小時後補加2ml培養基，72小時後進行瞬時表達分析。
4.如權利要求1所述的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法，其特徵在於，所述步驟3)中純化方法具體為1)將所述轉染的細胞收穫物經反覆凍融及超聲破碎；2)將上清和破碎細胞離心去除細胞碎片；3)將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；4)收集上清，100KD超濾濃縮後加PBS離心緩衝液重複超濾濃縮；5)棄去上清，PBS重懸；6)用10%-60%的連續性蔗糖梯度離心；7)離心分層後，逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA 通過E蛋白單克隆抗體或聖路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，獲得聖路易斯腦炎病毒樣顆粒。
5.一種以聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的細胞為抗原建立的間接免疫螢光檢測方法，其特徵在於，該方法具體為收集轉染設定時間後的細胞，用預冷的IxPBS清洗細胞，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾乾，用冷丙酮進行固定，加入稀釋的抗SLEV抗體37 度孵育設定時間，漂洗液洗滌；加入異硫氰酸螢光素標記的山羊抗小鼠IgG室溫結合；漂洗液洗滌後於螢光顯微鏡下觀察。
6.一種以純化的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的蛋白印跡檢測方法，其特徵在於，該方法具體為1)裂解的蛋白行SDS-PAGE後轉膜；2)封閉將膜放入可密封的塑膠袋中，加入適量的TBS配置的脫脂奶封閉液中，室溫封閉設定時間；3)抗體的結合用TBS配置的脫脂奶稀釋純化的抗SLEV鼠單克隆抗體作為一抗，將 PVDF膜與稀釋好的抗體室溫搖床孵育設定時間；4)洗去未結合的抗體用TBS-T漂洗濾膜；5)二抗的結合用TBS配置的脫脂奶稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌後的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫搖床孵育設定時間後，將膜用TBS-T洗滌；6)DAB顯色用TBS洗滌膜，去除磷酸和Tween 20，將膜放入DAB底物顯色液中顯色， 注意觀察顯色情況，至棕色條帶出現時終止反應，照相後避光保存。
7.如權利要求6所述的蛋白印跡檢測方法，其特徵在於，所述步驟1)具體為 a取樣品進行SDS-PAGE ；b當電泳結束時，用蒸餾水淋洗玻璃板；c戴上手套，切2張3匪濾紙和一張PVDF濾膜，使其大小與凝膠大小相適應； d先將濾紙浸入轉移緩衝液中，至少平衡15min，PVDF膜需進行前處理，置於100%甲醇中浸溼約5min將膜激活，再用轉移緩衝液漂洗2次；e半乾轉移儀下面的電極是陽極，故在轉移緩衝液中按從下至上的順序排列濾紙一轉移膜一凝膠一濾紙(可在膜的右上角切一標記，以標記膜的正反面)，各層之間應避免留有氣泡；f將其置入半乾轉移儀中，膠側置負極，膜側置正極； g通電轉移根據凝膠面積按0. 65mA/cm2接通電流，電轉移45min ； h轉移結束後，斷開電源並拔下插頭，從上到下拆卸轉移裝置，逐一掀去各層，凝膠可移至盛有考馬斯亮藍染色液的託盤中進行染色，以便檢查蛋白轉移是否完全，PVDF膜用於下一步實驗。
8.—種以聖路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的檢測聖路易斯病毒抗體的間接 ELISA法，其特徵在於，所述間接ELISA法具體為1)包被抗原將純化的蛋白抗原用ELISA包被液稀釋，反應板每孔加100ul，4°C冰箱過夜；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反覆三次，最後將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加15% FBS 封閉液 200ul，37°C放置 2h ；4)拍幹後超淨颱風機吹乾；5)加抗體小鼠抗SLEV抗體用封閉液1:200倍稀釋，反應板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih ；6)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反覆三次；7)加辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG,每孔lOOul,37°C放置Ih ；8)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反覆三次；9)加底物加TMBlOOul，室溫暗處放置IOmin；10)加終止液每孔50ul；11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄450nm讀數。
9.一種用於人體以預防聖路易斯腦炎病毒感染的疫苗，其特徵在於，該疫苗含有權利要求1所述的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的配伍組合。
10.一種檢測聖路易斯腦炎病毒的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒將重組的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒作為抗原組分構成，用於SLEVIgG ELISA診斷試劑盒或SLEVIgM ELISA診斷試齊U盒。
全文摘要
本發明公開了一種聖路易斯腦炎病毒樣顆粒的製備方法及其應用，本發明中通過哺乳動物細胞表達系統得到的聖路易斯腦炎病毒樣顆粒是非複製型的，結構接近天然病毒，且免疫原性好，可作為天然病毒抗原建立檢測聖路易斯腦炎感染的免疫檢測方法，表達路易斯腦炎包膜蛋白的293T細胞，可建立間接免疫螢光檢測方法，進一步的應用還包括將得到的病毒樣顆粒或重組蛋白可按一定的作用劑量作為亞單位疫苗直接用於人體用於預防聖路易斯腦炎病毒感染及診斷試劑的研發。
文檔編號A61K39/12GK102181408SQ201110032709
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月30日 優先權日2011年1月30日
發明者鹹慶傑, 平芮巾, 張麗萍, 楊鵬飛, 胡孔新, 郭雪, 馬雪徵 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院