一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法與流程
2023-11-10 02:21:57
本發明屬於免疫學技術領域，具體涉及一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法。
背景技術：
沙門氏菌(salmonellaspp)是一種條件致病菌。也是一種人畜共患病病原菌，對人和動物均有致病性，也是全世界引起人類食物中毒的最主要病原菌之一，主要侵染人的腸道上皮細胞，可以造成各種病症，輕者引起輕度腹瀉，重者出現傷寒發熱。沙門氏菌的傳播主要是通過汙染的環境、食物以及飲用水，而且能夠長時間存在於環境中，長期保持感染能力，導致其難以徹底淨化。準確檢測沙門氏菌無論是在動物臨床實踐還是人類自我保護方面，都具有重要意義。
目前多種沙門氏菌檢測技術種類很多，主要包括：傳統的分離培養等檢測方法、分子生物學檢測方法和免疫學檢測方法。
傳統檢測方法主要包括：沙門氏菌分離純化、生化鑑定和血清型鑑定。傳統檢測方法中分離純化和生化鑑定操作雖然簡單，但細菌生長較慢，耗時較長；血清型鑑定雖然簡便快捷，但是特異性不高，可能會出現交叉反應。分子生物學檢測方法包括：pcr檢測技術、基因晶片技術、下一代基因測序技術(nextgenerationsequencing，又稱第二代基因測序)。分子生物學檢測法快速、靈敏、特異性強，但成本較高，且要求較高技術水平，大範圍應用尚有一定難度。
免疫學檢測方法包括：酶聯免疫吸附(elisa)、乳膠凝集試驗(latexagglutinationtest,lat)等。其中酶聯免疫吸附較傳統檢測方法耗時短可以實現自動化處理大量樣品，比培養方法特異性高。但使用多抗血清檢測，則特異性不強，如果使用單抗提高靈敏度和特異性，相應抗體的製備要求較高。
乳膠凝集試驗是一種間接凝集反應，首先需要將可溶性抗原(或抗體)吸附到乳膠微球表面，該乳膠微球需要具備不溶性和不發生免疫反應等條件，製成致敏乳膠後，在電解質的條件下，與特異性抗體(或抗原)反應會出現肉眼可見的凝集現象。乳膠凝集試驗具有高特異性和敏感性，而且操作簡單，試驗耗時短，適用於臨床樣本的大量檢測。但是乳膠凝集試驗存在的缺點為不易找到吸附到乳膠微的特異性和免疫反應性較好的抗原或抗體。
實驗室常用的鑑定沙門氏菌的方法為pcr和elisa。雖然準確率高，但實驗條件要求高，且耗費大量時間。因此，迫切需要開發一種快速準確、簡便易行的檢測方法。
sen4030是沙門氏菌表達的一段多拷貝蛋白，有5559個胺基酸，在沙門氏菌中具有高度保守性。通過生物信息學分析胺基酸序列發現，sen4030蛋白跟鼠傷寒沙門氏菌的粘附素蛋白siie高度相似，只有76個胺基酸不同，由此推斷sen4030蛋白也應該是一種粘附素類蛋白，在沙門氏菌入侵宿主細胞過程中起作用，可以影響沙門氏菌的致病性。
技術實現要素：
本發明為了克服目前沙門氏菌檢測方法難以實現快速準確、簡便易行的問題，提出一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法。
sen4030a蛋白為sen4030的一部分，其編碼基因為sen4030編碼基因中截取的第6600-8100bps序列，約1500bps。通過前期研究，sen4030a蛋白包含免疫球蛋白樣的結構域，可以影響沙門氏菌的致病性，elisa等相關試驗證明有較強的特異性和免疫反應性，可以應用於沙門氏菌特異性診斷。
為此，本發明的具體技術方案如下：
一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法，包括以下步驟：
將sen4030a蛋白，連接到空白乳膠微球上，製備致敏乳膠微球；
將致敏乳膠微球與待測樣品混勻反應，觀察凝集結果。
上述檢測方法中，所述sen4030a蛋白的胺基酸序列如seqidno.1所示。
上述檢測方法中，所述致敏乳膠微球的製備方法為：
將預處理後的空白乳膠微球溶液與sen4030a蛋白溶液混合，在4-60℃下偶聯1-10小時。
上述檢測方法中，所述空白乳膠微球溶液的濃度為0.1-10wt％，所述sen4030a蛋白溶液的濃度為0.1-5mg/ml。
上述檢測方法中，優選的，在10-40℃下偶聯3-7小時，所述空白乳膠微球溶液的濃度為0.1-3wt％，所述sen4030a蛋白溶液的濃度為0.1-3mg/ml。
上述檢測方法中，最優選的，在37℃下偶聯5小時，所述空白乳膠微球溶液的濃度為1wt％，所述sen4030a蛋白溶液的濃度為0.6-0.7mg/ml。
上述檢測方法中，所述預處理的方法為：將空白乳膠微球加入去離子水，離心，再加入緩衝液稀釋，然後加入tritonx-100。
上述檢測方法中，所述sen4030a蛋白的製備方法為：
根據腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritis)的sen4030a的基因序列，如seqidno.2所示，設計引物克隆目的基因，構建其pet-32a表達載體，轉化至工程菌中bl21中進行蛋白誘導表達，然後分離純化sen4030a蛋白。
上述檢測方法中，所述蛋白誘導表達的方法為：將細菌培養至od600nm為0.4-0.8時，加入iptg培養1-7h，其中iptg濃度為0.1-3mm/ml；
所述分離純化的方法為：裂菌後收集上清，上層析柱，然後透析。
上述檢測方法中，所述待測樣品可以是血清、血漿、全血、新鮮組織、鮮奶或者經過處理過可以與致敏乳膠微球均勻接觸的待檢樣品，所述處理，可以為，例如新鮮組織研磨後、離心取上清。
一種沙門氏菌蛋白乳膠凝集檢測試劑盒，包括：
sen4030a蛋白溶液、空白乳膠微球懸濁液；
緩衝溶液a、處理液b；
所述緩衝溶液a為40mmol/l的mes緩衝液；處理液b為體積濃度為0.05％的tritonx-100溶液。
本發明的有益效果為：
本發明提供了一種沙門氏菌感染抗體乳膠凝集檢測方法，利用sen4030a蛋白作為抗原製備致敏乳膠來檢測沙門氏菌，sen4030a蛋白具有較強的特異性和免疫原性，製備的致敏乳膠無自凝現象、特異性強，重複性好且性質穩定。本發明的方法快速準確、簡便易行，和商品化檢測抗原相比，具有較高的準確性。
附圖說明
圖1為製備沙門氏菌蛋白乳膠凝集檢測試驗技術路線圖。
圖2為sen4030基因pcr結果；m：5000bpdna標準分子量，1:sen4030a基因片段。
圖3為圖4-2dh5α陽性克隆篩選結果；m：5000bpdna標準分子量，1-7:dh5α菌株。
圖4為bl21(de3)測序結果。
圖5為bl21(de3)陽性克隆篩選結果，m：5000bpdna標準分子量1-5:bl21(de3)菌株。
圖6為重組蛋白sen4030apet-32a/bl21(de30)表達形式結果，m-蛋白標準分子量，1-細菌沉澱，2-細菌上清，3-空載體菌蛋白。
圖7為重組蛋白sen4030apet-32a/bl21(de30)經不同濃度iptg誘導表達，m-蛋白標準分子量，1-未加iptg菌液上清，2-0.1mmol/liptg細菌上清，3-0.2mmol/liptg細菌上清，4-0.5mmol/liptg細菌上清，5-空載體細菌上清。
圖8為重組蛋白sen4030apet-32a/bl21(de30)經不同時間誘導表達結果；m-蛋白標準分子量，1-空載體細菌上清，2-1h細菌上清，3-2h細菌上清，4-3h細菌上清，5-4h細菌上清，6-5h細菌上清。
圖9為蛋白sen4030a純化結果；m-蛋白標準分子量，1-純化蛋白，2-空載體菌蛋白。
圖10為sen4030a蛋白western-blot鑑定結果，m-蛋白標準分子量，1-空載體蛋白，2-純化蛋白。
圖11為乳膠自凝性檢驗結果：a.致敏乳膠與pbs反應(-)，b.致敏乳膠與生理鹽水反應(-)。
圖12為抗體致敏乳膠與各病毒反應結果；a.沙門氏菌(+++)，b.巴氏桿菌(-)，c.大腸桿菌(-)，d.鴨肝炎病毒(-)，e.pbs(-)。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1sen4030a蛋白的表達
1重組質粒的構建
1.1腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritis)的基因組dna提取
⑴.取1ml過夜振蕩培養菌液於乾淨離心管中，12000rpm離心1min,吸除上清。
⑵.向細菌沉澱中加入300μl65℃預熱重懸液，從分吹打混勻。
⑶.向溶液中加入150μl65℃預熱裂解液，顛倒混勻，然後置於65℃水浴鍋5min。
⑷.加入200μl氯仿，震蕩混勻20s，此時呈乳白色渾濁狀，12000rpm離心2min，將上清移至新的離心管，避免觸及中間白色膜狀物。
⑸.向上清中加入1.5倍體積膜結合液，顛倒混勻，吸出至吸附柱中，室溫放置2min，然後12000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液。
⑹.向吸附柱中加入500μl通用漂洗液，12000rpm離心1min，倒掉收集管廢液，重複洗一次。然後倒出廢液，將吸附柱放入收集管12000rpm離心2min，除去殘留液體。
⑺.將吸附柱放入新的離心管，加入50μl洗脫液，室溫放置3min，12000rpm離心1min，重複洗脫一次以收集更多dna。
1.2pcr擴增
根據沙門氏菌sen4030a基因序列，其序列如如seqidno.2所示，設計引物，並在引物前分別添加bamhi和xhoi兩個酶切位點，引物為：
f:cgggatccagggtggaagatgaggc,
r:ccgctcgagttattctaccgtcagggtatgta。以沙門氏菌(salmonellaenteritis)基因組dna為模板進行pcr擴增，預期片段大小為1500bp。
pcr的反應體系
將混合物混勻後進行pcr擴增，循環參數為：94℃預變性5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30個循環；72℃延伸7min。離心回收擴增產物目的片段。
1.4pet-32a質粒的提取
⑴.3ml過夜培養含有pet-32a質粒的菌液後抽提pet-32a質粒
1.5回收產物及質粒雙酶切
酶切體系如下，37℃2h，然後進行凝膠電泳，
回收酶切產物，回收操作同上。
1.6pcr產物與pet-32a質粒連接
將混合物置於16℃恆溫水浴鍋中連接過夜。
1.7dh5α感受態的轉入及陽性克隆的篩選
1.將dh5α感受態細胞放置在冰上融化，取50μl於新離心管，加入20μl連接產物，輕輕混勻，冰上放置30min。
2.將離心管放入42℃預熱水浴鍋熱激45s，迅速轉入冰上保持2min，過程中注意不要搖動離心管。
3.向離心管中加入500μl37℃預熱lb肉湯培養基，37℃200rpm搖菌1h，最後將菌液塗到加有氨苄的lb瓊脂培養基中，過夜培養。
4.在培養基中隨機挑選10個菌落，做好編號，分別接種於含氨苄的lb肉湯培養基中，37℃200rpm搖菌3h。
5.取50μl菌液於pcr管中，100℃煮菌10min做模板，進行pcr鑑定。
6.篩選出陽性的菌液擴大培養，提取質粒，操作同上。
通過帶有amp的lb平板篩選，選出7個陽性菌落，分別命名為d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7，pcr鑑定結果如圖3所示。選取一個菌落繼續搖菌8小時，送去北京華大科技有限公司測序，結果與genbank中sen4030基因序列一致，如圖4所示。
1.8bl21(de3)感受態細胞的轉入及陽性篩選
1.取3μl上述提取質粒加入到50μlbl21(de3)感受態細胞中，冰浴30min，轉42℃45s，迅速冰浴2min，加入lb肉湯培養基，37℃搖菌1h，塗板過夜培養。
2.隨機選取10個菌落接種於含有氨苄的lb肉湯培養基中培養3h，取菌液煮沸10min作為模板，挑選5個菌落進行pcr鑑定，均得到1500bp片段，結果如圖5所示。
實施例2目的蛋白的誘導表達
2.1陽性的細菌的培養
經過pcr篩選出的陽性菌株37℃搖菌，當菌液od為0.4-0.8時，加入0.5mmol/liptg誘導蛋白表達，表達4小時後收集菌液，超聲裂解後離心，分別將上清和沉澱進行sds-page電泳，結果上清和沉澱均出現明顯條帶，證明蛋白表達以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在，如圖6所示。
包涵體的形成一般是在外源基因在大腸桿菌中表達時，由於蛋白合成速度過快，導致蛋白無法正確摺疊，從而以包涵體形式存在，許多實驗研究表明適當降低表達溫度和搖床轉數可以提高可溶性蛋白的表達量，但是本研究分別將菌置於150rpm/min搖床，25℃和16℃條件下過夜表達後進行sds-page，結果發現蛋白量變化並不明顯。
按上述實驗步驟，其他條件不變，分別加入0.1mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/liptg，表達4小時後收集菌液，超生裂解後離心，取上清進行sds-page電泳，通過條帶亮度判斷蛋白表達量的高低，結果如圖7所示。
按上述實驗步驟，其他條件不變，在加入0.5mmol/liptg後，每隔一小時取菌液超聲裂解，取上清進行sds-page電泳，結果如圖8所示，通過條帶亮度判斷蛋白表達量的高低，表達時間4小時時，效果較優。
以上實驗表明，該蛋白37℃條件下，加入0.5mmol/liptg搖菌4h蛋白表達最高，條件最優。
2.3蛋白純化和鑑定
以上述條件大量表達蛋白後，進行蛋白純化：按1：100比例加入菌液搖菌500ml，收集菌液，加入適量pbs，超生裂解菌體至溶液透亮，4℃8000rpm離心10min，收集上清。用ni-agarosehis標籤蛋白純化試劑盒進行蛋白純化，純化結果如圖9所示。
將純化後的蛋白透析48h，除掉雜質，用bca蛋白濃度測定試劑盒測定16倍稀釋後的蛋白濃度為0.31mg/ml，進而得出透析蛋白濃度為4.96mg/ml。
將透析後的蛋白做western-blot鑑定，分別用沙門氏菌免疫小鼠血清作一抗，辣根酶標記山羊抗小鼠igg作二抗，曝光後結果如圖10所示。結果證明預期蛋白(70kd左右)具有良好抗原性。
實施例3乳膠凝集實驗方法
本實施例中所用的mes緩衝液為40mmol/l的mes緩衝液，配製方法為：mes7.81g，加入適量去離子水，然後用濃鹽酸調節ph值至6.1，用去離子水定容至1l。
0.01mpbs緩衝液ph7.2配製方法為：nacl8.0g，kcl0.2g，kh2po40.2g,na2hpo4·12h2o2.9g加入去離子水定容至1l，用濃鹽酸調整ph至7.2。
3.1乳膠預處理
取0.1μl，2.5％(w/v)空白乳膠微球，加入10ml去離子水，12000rpm離心15min，再加入10mlmes緩衝液稀釋至1％(v/v)，加入tritonx-100，濃度至0.05％(v/v)，得到空白乳膠微球溶液。
3.1致敏乳膠微球的製備
將上述預處理後的空白乳膠微球溶液與sen4030a蛋白溶液混合，在4-60℃下偶聯10小時。
通過調整蛋白sen4030a濃度、致敏溫度、時間等條件，探討乳膠微球的最佳製備條件：
將透析後的蛋白sen4030a用mes緩衝液作2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋，加入等體積預處理後的空白乳膠微球懸液，bca法測定初始蛋白濃度，將混合液置於37℃水浴鍋偶聯4h，13000rpm離心10min終止偶聯，測定上清中蛋白濃度，每組4個重複，計算平均值，得出偶聯率，觀察有無自凝現象，確定最佳偶聯濃度。偶聯率，其中a：偶聯前蛋白濃度，b：偶聯後蛋白濃度。結果如表1所示，在濃度為0.62mg/ml時，效果最好。
表1不同濃度蛋白致敏乳膠結果
(2)將蛋白用mes緩衝液作8倍稀釋，加入等體積乳膠微球懸液，分別置於4℃、25℃、37℃、56℃中，每組4個重複，偶聯4h，測定蛋白偶聯率，並觀察凝集情況，結果如表2所示。
表2不同溫度下致敏乳膠
(3)將蛋白用mes緩衝液作8被稀釋後，加入等體積乳膠微球懸液，置於37℃中，分別偶聯1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，每組4個重複，測定偶聯前後蛋白濃度，計算偶聯率並觀察凝集情況，結果如表3所示。
表3不同時間致敏乳膠結果
3.3乳膠自凝性檢測
吸取適量致敏乳膠，分別於等量pbs、mes緩衝液在37℃偶聯5hr，觀察是否出現凝集現象。結果如圖12所示，與pbs和mes均無凝集現象，說明致敏乳膠無自凝現象。
3.4乳膠特異性檢測
吸取適量致敏乳膠，分別於巴氏桿菌血清、大腸桿菌血清進行反應，同時設立陰陽性對照，觀察是否有凝集現象。結果如圖12所示，說明致敏乳膠特異性強。
其中lat操作方法為：
取一潔淨玻片，在玻片上滴加25μl抗體致敏乳膠，在其旁邊滴加一滴待檢血清樣品並將兩者迅速混合，並輕搖玻片約2min，使抗體致敏乳膠與待檢血清樣品混合均勻，在5min內觀察結果並記錄。同時設標準陰陽性對照。凝集判定標準：
⑴「++++」為全部乳膠凝集，乳膠顆粒完全凝集並聚集於液滴周圍，液滴呈透明狀態。
⑵「+++」為75％乳膠凝集，可見明顯的乳膠顆粒，但液體稍渾濁。
⑶「++」為50％乳膠凝集，乳膠凝集顆粒不明顯，液體亦比較渾濁。
⑷「+」為僅有少量乳膠顆粒凝集，液體仍為渾濁狀態。
⑸「-」為乳膠不凝集，乳膠仍呈原有乳狀，未見乳膠顆粒。
結果判定：當標準陽性抗原出現「++++」(100％)凝集現象且標準陰性抗原出現「-」(即不凝集)現象時，試驗方可成立，否則重試。最終判定乳膠出現50％以上凝集者為陽性。
3.5沙門氏菌檢測
採用上述3.4中lat操作方法，取一潔淨玻片，在玻片上滴加25μl致敏乳膠，在其旁邊滴加一滴待檢血清樣品，並將兩者迅速混合，並輕搖玻片約2min，使抗體致敏乳膠與待檢血清樣品混合均勻，在5min內觀察結果並記錄。同時設標準陰陽性對照。根據凝集程度，進行判定。
3.6乳膠重複性檢測
空白乳膠微球溶液的濃度為1wt％，sen4030a蛋白溶液的濃度為0.62mg/ml，37℃下偶聯5小時，製備致敏乳膠。
重複檢測乳膠微球的結果如表4，表明該抗原致敏乳膠重複性好且性質穩定。
表4重複性試驗
3.6乳膠對比試驗試驗
用致敏乳膠和商品化檢測抗原(雞白痢沙門氏菌平板凝集抗原)同時檢測80份血清，對比陽性數量，做好記錄。結果如表5所示。
表5乳膠凝集與平板凝集對比
以上實驗表明，lat具有較高的準確性。
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中國農業大學
一種沙門氏菌抗體乳膠凝集檢測方法
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