豬膽粉結合型膽酸在製備治療支氣管哮喘藥物中的應用的製作方法
2023-11-10 12:30:27
本發明涉及豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸在製備治療支氣管哮喘藥物中的應用。
背景技術：
支氣管哮喘（Bronchial asthma，簡稱哮喘）是常見的慢性呼吸道疾病之一，是由多種炎症細胞、炎症介質參與的氣道慢性炎症性疾病。這種慢性炎症會導致氣道高反應性的產生，通常出現廣泛多變的可逆性氣流受限，並引起反覆發作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等症狀，且常在夜間和凌晨發作。近年來，由於氣候、環境等的變化，哮喘的發病率、患病率及死亡率均呈逐年上升趨勢。哮喘嚴重影響了患者的生活質量，並給患者帶來了沉重的經濟負擔，因此該病全球範圍內引起了廣泛重視。
目前，糖皮質激素、β2受體激動劑、白三稀受體調節劑、抗膽鹼能藥、IgE抗體等是治療哮喘的主要藥物。然而，由於個體的敏感度不同，仍有部分患者如吸菸者、肥胖哮喘患者和非Th2增高型哮喘患者對上述治療藥物的反應較差。
豬膽粉是我國的傳統中藥，具有清熱、潤燥、解毒、止咳平喘等功效，用於熱病燥渴、目赤、喉痺、黃疸、百日咳、哮喘、洩瀉、痢疾、便秘、癰瘡腫毒等症。豬膽粉結合型總膽酸中包括牛磺豬膽酸（Taurohyocholic acid）、牛磺豬去氧膽酸（Taurohyodeoxycholic acid）、牛磺鵝去氧膽酸（Taurochenodeoxycholic acid）、甘氨豬膽酸（Glycohyocholic acid）、甘氨豬去氧膽酸（Glycohyodeoxycholic acid）和甘氨鵝去氧膽酸（Glycochenodeoxycholic acid）。其中，牛磺豬去氧膽酸的含量達到4%以上。
據發明人所知，豬膽粉結合型總膽酸及牛磺豬去氧膽酸在製備治療支氣管哮喘藥物中的應用，目前還未見報導。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸在製備治療支氣管哮喘藥物中的應用，涉及一種新用途。
本發明的實現過程如下：
豬膽粉結合型總膽酸的製備：取豬膽粉藥材，加入其體積10倍量的質量分數為95%的乙醇，超聲提取使豬膽粉完全溶解，靜置12-14小時，過濾，回收溶劑，得棕黑色浸膏。將柱層析矽膠（100～160目）加入到浸膏中，浸膏與柱層析矽膠的質量比為1：2，拌樣，揮幹溶劑，研成80目細粉，細粉與中性氧化鋁按質量比1：15幹法裝於層析柱中，用質量分數為95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣於矽膠G薄層板上，用展開劑展開後用顯色劑顯色，待薄層板上出現結合型膽酸斑點時合併洗脫液，至斑點消失時結束，將收集到的洗脫液減壓回收溶劑，在烘箱內80～100℃烘乾，得豬膽粉結合型總膽酸，含量以牛磺豬去氧膽酸計在50%以上。
上述的展開劑為乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液，顯色劑為香草醛硫酸試液或乙醇制硫酸試液。
2、牛磺豬去氧膽酸的製備
將上述得到的豬膽粉結合型總膽酸與柱層析矽膠（100～160目）按質量比1：2的比例拌樣，研成80目細粉，細粉與柱層析矽膠（100～160目）按質量比1: 25幹法裝於層析柱中，經反覆柱層析進行分離，以體積比為65：25：10：2的二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸混合溶劑的下相洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣於矽膠G薄層板上，用展開劑展開後用顯色劑顯色，待薄層板上出現牛磺豬去氧膽酸斑點時合併洗脫液，至斑點消失時結束，將收集到的洗脫液回收溶劑，於丙酮中重結晶，得牛磺豬去氧膽酸，純度達95%以上。
上述的展開劑為乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液，顯色劑為香草醛硫酸試液或乙醇制硫酸試液。
上述方法製備的豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸在製備治療支氣管哮喘藥物中的用途。
有效成分豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸製備治療支氣管哮喘的藥物用常規藥用製劑的形式來使用。所述的常規藥用製劑含作為活性成分的豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸，該活性成分在製劑中與藥學上可接受的載體如適宜於胃腸內給藥的有機或無機的固體或液體賦形劑混合。該藥用製劑可以是固體形式如片劑、顆粒劑、膠囊劑；也可以是液體形式如懸浮劑、糖漿劑、灌腸劑等。
上述製劑中可含有輔助物質、穩定劑、潤溼劑和其它常用的添加劑，如乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米澱粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。
上述的製劑可按照各種製劑常規的製備工藝製成。
採用本發明得到的豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸經過治療支氣管哮喘的藥效學試驗，表明豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸對哮喘模型小鼠免疫球蛋白、白介素4和白介素13含量升高有抑制作用，顯示豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸能抑制促炎細胞因子的分泌，調節免疫反應，有效阻斷免疫反應性對機體造成的損傷，達到治療目的。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。
實施例1
以豬膽粉100 g為例，豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸的製備方法如下：
1.豬膽粉結合型總膽酸的製備
取豬膽粉藥材100 g，加入其體積10倍量的質量分數為95%的乙醇，超聲提取使豬膽粉完全溶解，靜置12-14小時，過濾，回收溶劑，得棕黑色浸膏。取浸膏5 g，加入100-160目的柱層析矽膠10 g拌樣，揮幹溶劑，研成80目細粉，細粉與中性氧化鋁按質量比1：15幹法裝於層析柱中，用質量分數為95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣於矽膠G薄層板上，用乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液為展開劑展開，用香草醛硫酸試液顯色，待薄層板上出現結合型膽酸斑點時合併洗脫液，至斑點消失時結束。將收集到的洗脫液減壓回收溶劑，在烘箱內80～100℃烘乾，得豬膽粉結合型總膽酸，含量以牛磺豬去氧膽酸（C26H45O6NS）計在50%以上。
2.牛磺豬去氧膽酸的製備
取步驟1中得到的豬膽粉結合型總膽酸2 g，加入100-160目的柱層析矽膠4 g拌樣，研成80目細粉，細粉與柱層析矽膠（100～160目）按質量比1：25幹法裝於層析柱中，經反覆柱層析進行分離，以體積比為65：25：10：2的二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸混合溶劑的下相洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣於矽膠G薄層板上，用乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液為展開劑展開，用香草醛硫酸試液顯色，待薄層板上出現牛磺豬去氧膽酸斑點時合併洗脫液，至斑點消失時結束。將收集到的洗脫液回收溶劑，於丙酮中重結晶，得牛磺豬去氧膽酸，純度達95%以上。
實施例2
藥用製劑豬膽粉結合型總膽酸製備成片劑，以生產片劑1000片為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
豬膽粉結合型總膽酸 50g
糊精 50g
硬脂酸鎂 2g
澱粉 加至300g
其製備方法按製劑學片劑的常規方法進行，每片重0.3g，每片含豬膽粉結合型總膽酸50mg。
藥用製劑牛磺豬去氧膽酸製備成片劑，以生產片劑1000片為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
牛磺豬去氧膽酸 10g
糊精 50g
硬脂酸鎂 2g
澱粉 加至300g
其製備方法按製劑學片劑的常規方法進行，每片重0.3g，每片含牛磺豬去氧膽酸10mg。
實施例3
藥用製劑豬膽粉結合型總膽酸製備成膠囊劑，以生產膠囊劑1000粒為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
豬膽粉結合型總膽酸 50g
微晶纖維素 20g
硬脂酸鎂 1g
澱粉 加至300g
其製備方法按製劑學膠囊劑的常規方法進行，每粒重0.3g，每粒含豬膽粉結合型總膽酸50mg。
藥用製劑牛磺豬去氧膽酸製備成膠囊劑，以生產膠囊劑1000粒為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
牛磺豬去氧膽酸 10g
微晶纖維素 20g
硬脂酸鎂 1g
澱粉 加至300g
其製備方法按製劑學膠囊劑的常規方法進行，每粒重0.3g，每粒含牛磺豬去氧膽酸10 mg。
實施例4
藥用製劑豬膽粉結合型總膽酸製備成顆粒劑，以生產顆粒劑產品1000g為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
豬膽粉結合型總膽酸 5g
蔗糖 400g
糊精 加至1000g
製備方法按製劑學顆粒劑的常規方法進行，每袋重10g，1g含豬膽粉結合型總膽酸5 mg。
藥用製劑牛磺豬去氧膽酸製備成顆粒劑，以生產顆粒劑產品1000g為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
牛磺豬去氧膽酸 1g
蔗糖 400g
糊精 加至1000g
製備方法按製劑學顆粒劑的常規方法進行，每袋重10g，1g含牛磺豬去氧膽酸1 mg。
實施例5
藥用製劑豬膽粉結合型總膽酸製備成糖漿劑，以生產糖漿劑1000 mL為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
豬膽粉結合型總膽酸 5g
甜蜜素 10g
蒸餾水 加至1000mL
其製備方法按製劑學糖漿劑的常規方法進行，每瓶10mL，1mL含豬膽粉結合型總膽酸5mg。
藥用製劑牛磺豬去氧膽酸製備成糖漿劑，以生產糖漿劑1000 mL為例所用原料和輔料及其質量配比如下：
牛磺豬去氧膽酸 1g
甜蜜素 10g
蒸餾水 加至1000mL
其製備方法按製劑學糖漿劑的常規方法進行，每瓶10mL，1mL含牛磺豬去氧膽酸1 mg。
為了驗證採用本發明製備的豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸的有益效果，發明人對豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸進行了治療支氣管哮喘的藥效學試驗，各種試驗情況如下：
1、實驗藥物
豬膽粉結合型總膽酸，為黃色至深黃色的固體粉末，味苦，二次重蒸水配製，4℃密閉保存。牛磺豬去氧膽酸，為白色固體粉末，味微苦，二次重蒸水配製，4℃密閉保存。
2、實驗動物
雌性昆明種健康小鼠，體重（22±2）ｇ，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，合格證編號為61001700000563。
3、實驗試劑
卵清蛋白（OVA）試劑購自 Sigma公司，小鼠免疫球蛋白IgE、白介素4（IL-4）和白介素13（IL-13）酶聯免疫試劑盒購自R&D Systems公司。
4、實驗方法
豬膽粉結合型總膽酸用二次重蒸水分別配成體積濃度20 mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml 的水溶液，牛磺豬去氧膽酸用二次重蒸水分別配成體積濃度3 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml 的水溶液，4℃冰箱保存備用。
昆明種健康雌性小鼠，體重（22±2）g，在實驗條件下適應1周後，隨機分為8組，即正常對照組、模型組、豬膽粉結合型總膽酸大、中、小劑量給藥組、牛磺豬去氧膽酸大、中、小劑量給藥組，進行試驗。
支氣管哮喘小鼠模型採用OVA製備分為致敏和激發兩個階段。
致敏階段：正常對照組在小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水致敏，其餘各組小鼠均於實驗第0、7、14天腹腔注射0.2 mL含20 μg OVA和2 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液致敏。
激發階段：實驗第22、23、24天將除正常對照組外其餘各組小鼠置於密閉的有機玻璃箱中，霧化吸入1%（w/v） OVA生理鹽水溶液，每天1次，每次30 min，連續激發3天。正常對照組用生理鹽水激發。
各組小鼠於實驗第18-24天灌胃給藥，每次於霧化前1 小時給藥治療。正常對照組和模型組小鼠分別給予生理鹽水灌胃（20 ml/kg），給藥組豬膽粉結合型總膽酸按大計量400 mg/kg、中計量200 mg/kg、小劑量100 mg/kg灌胃給藥，給藥組牛磺豬去氧膽酸按大計量60 mg/kg、中計量40 mg/kg、小劑量20 mg/kg灌胃給藥每天一次，持續七天。末次霧化結束24小時後，處死小鼠。檢測各組小鼠血清中IgE含量，測定肺泡灌洗液中IL-4和IL-13活性，製備肺組織病理切片。
血清的採集及肺泡灌洗液的製備：
最後一次霧化激發操作24小時後，對小鼠進行眼球採血。從小鼠眼眶取血1 ml，把血液注入高速離心機，5000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液放入-80℃冰箱冷凍保存，用於檢測IgE。
小鼠處死後，開胸暴露氣管至左右分支處，結紮右主支氣管後，將右肺取下，放入10%甲醛溶液中固定，48 小時後進行水洗，再用不同濃度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，經過二甲苯透明後用石蠟包埋，用切片機切成5 µm厚的切片，採用蘇木精-伊紅染色法進行染色。光鏡下觀察肺組織病理改變，拍照記錄。
小鼠處死後，暴露並分離氣管後，經頸部氣管插入留置針，向左肺勻速注入2 mL生理鹽水，留置2分鐘，按摩小鼠的胸部30秒後緩慢充分回收肺泡灌洗液，重複同樣操作3次，保證回收率>80%。充分混勻肺泡灌洗液，以2000轉/分鐘離心5分鐘，吸取上清於離心管中，用於測定細胞因子含量。
實驗數據以均值±標準差表示。實驗數據採用SPSS17.0統計分析軟體進行統計分析，多組均數比較採用單因素方差分析（ANOVA），P <0.05 為差異有統計學意義。
5、實驗結果
（1）實驗小鼠病理學形態變化
小鼠肺組織用蘇木精-伊紅染色法染色後在光學顯微鏡下觀察，正常對照組小鼠肺組織切片支氣管壁完整，厚薄均勻，黏膜上皮細胞排列整齊，管腔內未見脫落的上皮細胞及炎性滲出物，管壁及肺泡間未見嗜酸性粒細胞。模型組小鼠肺組織切片支氣管壁環肌肥厚，黏膜上皮細胞排列紊亂，部分上皮細胞脫落，管腔內可見炎性滲出物，管壁和肺泡間隔可見較多淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞。陽性對照組小鼠肺組織切片支氣管黏膜上皮細胞部分破壞，支氣管管壁稍增厚，黏膜下可見輕度充血和水腫，視野下可見少許炎性滲出物。豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸各劑量給藥組小鼠肺組織切片支氣管壁結構基本恢復，管腔內無炎性滲出物，黏膜上皮細胞開始恢復，黏膜下充血及水肺不明顯。
（2）豬膽粉結合型總膽酸及牛磺豬去氧膽酸對小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13活性及血清中IgE含量的影響
豬膽粉結合型總膽酸及牛磺豬去氧膽酸治療組與模型組相比，IL-4、IL-13和IgE含量明顯降低，有顯著性差異（P <0.001或P ﹤0.01或P ﹤0.05），與正常空白對照組相比，差異無顯著性，表明豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸可明顯抑制卵清蛋白（OVA）誘導小鼠肺泡灌洗液IL-4和IL-13活性及血清IgE含量升高。
6、結論
實驗結果表明，豬膽粉結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸對卵清蛋白誘導的支氣管哮喘模型小鼠免疫球蛋白、白介素4和白介素13含量升高有抑制作用，豬膽汁結合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸能抑制促炎細胞因子的分泌，調節免疫反應，有效地阻斷免疫反應性對機體造成的損傷，達到治療目的。
含有效成分豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的功能：消炎。
含有效成分豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物主治：支氣管哮喘。
含有效成分豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的規格：片劑每片重0.3g，每片含豬膽粉結合型總膽酸50 mg，或每片含牛磺豬去氧膽酸10 mg；膠囊劑每粒重0.3 g，每粒含豬膽粉結合型總膽酸50 mg，或每粒含牛磺豬去氧膽酸10 mg；顆粒劑每袋重10g，每克含豬膽粉結合型總膽酸5 mg，或每克含牛磺豬去氧膽酸1 mg；糖漿劑每瓶10mL，每毫升含豬膽粉結合型總膽酸5 mg，或每毫升含牛磺豬去氧膽酸1 mg。
含有效成分豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的用法用量：口服藥物每日服3次，每次口服片劑1片或膠囊劑1粒或顆粒劑1袋或糖漿劑1支，小兒酌減。
含有效成分豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的儲藏：密封陰涼乾燥處儲藏。
含有效成分豬膽粉結合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的有效期：兩年。