一種花生青枯病菌巢式pcr檢測方法
2023-11-10 14:25:27
一種花生青枯病菌巢式pcr檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，以樣品DNA為模板，利用細菌16S-23SrDNAITS序列通用引物L1/L2進行第一輪PCR擴增，再以第一輪PCR產物為模板，通過設計的一對鑑別花生青枯病菌的特異性引物W1/W2，進行第二輪PCR擴增，擴增產物進行電泳檢測，如果出現374bp的特異條帶，則確定所檢測的病原菌為花生青枯病菌。本發明的花生青枯病菌巢式PCR檢測方法，對病菌基因組DNA的檢測靈敏度為10fg，且能克服生物學鑑定、酶聯免疫技術和常規PCR等方法的缺點，提供了一種快速、靈敏、特異的花生青枯病菌檢測方法，可用于田間花生青枯病菌的早期診斷，對該病害的早期檢測和及時防治具有十分重要的意義。
【專利說明】—種花生青枯病菌巢式PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種花生青枯病菌巢式PCR檢測方法。
【背景技術】
[0002]花生青枯病是由SoJaflacearw引起的一種細菌性維管束病害。該病害於1905年在印度尼西亞首次報導，隨後在20多個國家和地區相繼發生或出現報導。目前，主要以中國、印度尼西亞和越南危害較重。我國關於花生青枯病的報導始見於30年代後期，現在主要分布於中部和南方地區，每年全國實際病地面積在40萬hm2以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病發病率一般在10% - 30%左右，減產20%以上；重病區發病率可在50%以上，甚至導致完全絕收。近年來有報導顯示，花生青枯病表現出向北蔓延的趨勢，給花生生產帶來更大威脅。除引起減產外，青枯病的發生還會降低花生品質，並增加黃麴黴毒素的汙染。同時，花生青枯病是一種土傳病害，可經雨水、土壤、病殘體等從發病區向未發病區傳播，且其侵染能力強，在較短的時間內可造成植株枯萎死亡。隨著設施農業的高度集約化生產，複種指數高，品種單一，導致該類病害的發生越來越嚴重。因此，開展花生青枯病菌的快速檢測，對該病害的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。
[0003]目前，關於花生青枯病菌的檢測方法包括傳統分離培養法、血清學和分子生物學等方法。青枯病菌的傳統分離培養法是採用選擇性培養基對病原物進行分離純化，然後進行一系列的生理生化實驗進行診斷，該方法易受外界因素的影響且靈敏度較低。而應用血清學方法時血清的製備過程耗時耗力，且可能存在交叉反應，造成檢測結果的假陽性。基於PCR原理的分子生物學技術是一種靈敏度高、特異性強的快速檢測技術，已在多種植物病害的檢測中得到廣泛應用。在細菌基因組中，16S-23S rDNA ITS序列在物種進化過程中具有高度的保守性，目前很多病原細菌分子檢測方法的建立都是基於這一位點。本發明通過比較花生青枯病菌和同屬近緣種的16S-23S rDNA ITS序列選擇差異位點設計特異引物，採用巢式PCR對花生青枯病菌進行檢測，靈敏度高，特異性強，國內外尚未見報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其具有特異性強、靈敏度高的特點，可用于田間花生青枯病的早期診斷，對花生青枯病菌引起病害顯症之前的早期監測和及時防治具有十分重要的意義。
[0005]為實現上 述目的，本發明採用以下技術方案來實現:
一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其特徵在於:包括以下步驟:
步驟I)、基因組DNA提取:採用CTAB法提取花生青枯病菌基因組DNA或發病植物組織
DNA ；
步驟2)、第一輪PCR擴增:以步驟I)得到的DNA樣品為模板，採用細菌16S-23S rDNAITS序列通用引物L1/L2經PCR擴增得到第一輪PCR產物；
引物序列:L1:5』 -AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3』 (SEQ ID NO:1)；L2:5』 -GTGCCAAGGCATCCACC-3』 (SEQ ID N0:2)；
PCR 反應體系 25 μ I:DNA 模板 I μ 1，IOXPCR 反應緩衝液 2.5 μ 1，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μ1，5υ/μ1 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L 的 LI 引物 I μ 1，10 μ mol/L 的L2引物I μ I，滅菌超純水補足至25 μ I ;
PCR 擴增程序:95°C預變性 4min，94°C變性 I min，60°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，共30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存；
步驟3)、第二輪PCR擴增:以第一輪PCR擴增產物或擴增產物的稀釋液為模板，採用花生青枯病菌特異引物W1/W2經PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物；
引物序列:W1:5』 -TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3』 (SEQ ID NO:3)；
W2:5』 -GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3』 (SEQ ID N0:4)；
PCR反應體系25 μ 1:第一輪PCR擴增產物或擴增產物的稀釋液I μ 1，10 XPCR反應緩衝液 2.5μ 1,2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2 μ 1，5U/μ I DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L的Wl引物I μ 1，10 μ mol/L的W2引物I μ 1，滅菌超純水補足至25 μ I ；
PCR 擴增程序:94°C預變性 4min，94°C變性 30sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 40sec,共30個循環；72°C延伸8min ;4°C保存；
步驟4)、PCR擴增產物檢測:取5 μ I第二輪PCR擴增產物，採用1%瓊脂糖凝膠，在110V電壓下電泳30min，之後置於EB內染色20min，取出，於凝膠成像系統下觀察拍照，如果存在374bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為花生青枯病菌；
所述的PCR反應緩衝液中均含有Mg2+。
[0006]本發明具有以下技術優勢和積極效果
1、靈敏度高:本發明檢測靈敏度為10fg，較常規PCR靈敏度提高了 100倍。
[0007]2、特異性強:本發明針對性的檢測花生青枯病菌，能從花生青枯病菌基因組中擴增出374bp的單一目的條帶，受其他菌類幹擾小，準確率高。
[0008]3、實用性好:本發明可用於花生青枯病潛伏期或者感病初期時的病害檢測，對花生枯病病害的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。
[0009]4、操作簡便快速:應用本發明方法，對帶花生青枯病菌的植物組織進行病菌DNA提取、PCR擴增和常規的瓊脂糖電泳後即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切，整個檢測過程一般可在8小時內完成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是花生青枯病菌特異性檢測擴增結果。
[0011]圖2是花生青枯病菌常規PCR靈敏性檢測擴增結果。
[0012]圖3是花生青枯病菌巢式PCR靈敏度檢測擴增結果。
[0013]圖4是人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測結果。
【具體實施方式】
[0014]實施例1花生青枯病菌的巢式PCR檢測 1.樣品DNA提取
1.1提取菌體DNA將花生青枯病菌接種於NA液體培養基，28°C、200rpm過夜培養，用CTAB法提取細菌基因組DNA,具體操作如下:
1)取1.5ml培養物於2.0ml離心管中，12000rpm離心2min ;
2)棄上清液，加入567μ I TE緩衝液重新懸浮菌體，加入30 μ I 10%SDS溶液和3 μ I20mg/ml的蛋白酶K,輕輕混勻，於37°C溫育Ih;
3)加入100μ I 5mol/L NaCl溶液，充分混勻，再加入80 μ I CTAB/NaCl溶液，混勻後65°C溫育 IOmin ；
4)加入800μ I的酚/氯仿/異戊醇溶液(三者體積比為25:24:1)，混勻後12000rpm離心5min ；
5)取上清液轉入新的1.5ml離心管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA 沉澱，12000rpm 離心 15 min ；
6)棄上清液,加入1000μ I無水乙醇,混勻，12000 rpm離心5 min ；
7)棄上清液，在超淨工作檯上自然晾乾，加入60μ I ddH20溶解DNA，於一 20°C保存備用。
[0015]1.2提取待檢 植物組織樣品DNA
1)稱取花生莖部組織lO Omg，加入液氮研磨成粉末，轉移入2.0ml離心管中；
2)加入1000 μ I CTAB/NaCl 溶液，於 65°C水浴 30min,每各 IOmin 混勻一次，12000rpm離心IOmin ；
3)取上清液800μ I於2.0ml離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液(三者體積比為25:24:1),混勻後12000rpm離心5min ；
4)取上清液750μI於2.0ml離心管中，加入等體積的氯仿/異丙醇溶液(體積比為24:1),混勻，12000rpm 離心 5min ；
5)取上清液500μ I於2.0ml離心管中，加入50 μ I預冷的3mol/L NaAC溶液(pH=5.2)，混勻，加入50 μ I預冷的異丙醇，混勻，於一 20°C放置30min ；
6)4°C 1000Orpm離心5min，棄上清液，加入1000 μ I預冷的75%無水乙醇洗滌沉澱2次，再用無水乙醇洗滌I次，在超淨工作檯上自然晾乾，加入60 μ I ddH20溶解DNA，於一20°C保存備用。
[0016]2.第一輪PCR擴增
以提取的菌體DNA和植物組織DNA樣品為模板，採用細菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2進行第一輪PCR擴增。
[0017]引物序列:L1: 5』-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3』 (SEQ ID NO:1)；
L2: 5』 -GTGCCAAGGCATCCACC-3』 (SEQ ID N0:2)；
PCR反應體系 25 μ 1:DNA模板 I μ 1，10XPCR反應緩衝液(含Mg2+) 2.5 μ 1,2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2μ1，5υ/μ1 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L 的 LI 引物 I μ 1，10 μmol/L的L2引物I μ I，滅菌超純水補足至25 μ I ;
PCR 擴增程序:951:預變性31^11，941:變性 lmin，60°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，共30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存；
3.第二輪PCR擴增
將第一輪PCR擴增產物稀釋10倍，取I μ I作為DNA模板，採用花生青枯病菌特異引物W1/W2進行第二輪PCR擴增。
[0018]引物序列:W1:5』 -TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3』 (SEQ ID N0:3)；
W2:5』 -GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3』 (SEQ ID N0:4)；
PCR反應體系25 μ 1:第一輪PCR擴增產物或擴增產物的稀釋液I μ 1，10 XPCR反應緩衝液(含 Mg2+) 2.5 μ I，2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2 μ I，5U/ μ I DNA Taq 聚合酶 0.5 μ I，10 μ mol/L的Wl引物I μ 1，10 μ mol/L的W2引物1μ 1，滅菌超純水補足至25μ I ;
PCR 擴增程序:94°C預變性 4min，94°C變性 30sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 40sec,共30個循環；72°C延伸8min ;4°C保存；
4.PCR擴增產物檢測
取5 μ I第二輪PCR擴增產物，採用1%瓊脂糖凝膠，在IlOV電壓下電泳30min，之後置於EB內染色20min,取出，於凝膠成像系統下觀察拍照,如果存在374bp的特異條帶,則確定所檢測的病菌為花生青枯病菌。
[0019]圖1是花生青枯病菌特異性檢測擴增結果。其中，M為2000 bp DNA分子量marker, I為花生青枯病菌，2_13為部分參試菌株，14為陰性對照。
[0020]巢式PCR擴增結果顯示，只有泳道I即花生青枯病菌擴增出374bp的特異條帶，而陰性對照和2-13泳道的其他菌株均無擴增條帶出現。
[0021]實施例2花生青枯病菌的常規PCR靈敏度試驗
將花生青枯病菌基因組DNA分別稀釋為I`Ong/μ 1、Ing/μ 1、IOOpg/μ 1、IOpg/μ 1、lpg/μ lUOOfg/μ 1、10 fg / μ I和I fg / μ I 8個濃度梯度。取各濃度的DNA I μ I作為模板，只用特異性引物W1/W2分別進行一次PCR擴增，經3次重複後均得到相同的結果。
[0022]圖2是花生青枯病菌常規PCR靈敏性檢測擴增結果。其中，M為2000 bp DNA分子量marker, 1-8為不同濃度的花生青枯病菌DNA,其濃度依次為10 ng、lng、100 pg、10 pg、lpg、100 fgUO fg、l fg/μ 1，9 為陰性對照。
[0023]圖2結果顯示，單獨使用特異性引物W1/W2進行一次PCR擴增，泳道1_5均擴增出374bp特異條帶，表明病原菌DNA的最低檢測濃度為lpg/μ I。
[0024]實施例3花生青枯病菌的巢式PCR靈敏度試驗
同實施例2，將花生青枯病菌基因組DNA分別稀釋為IOng/μ 1、Ing/μ 1、IOOpg/μ 1、IOpg/ μ l、lpg/ μ l、100fg/ μ 1、10 fg / μ I 和 I fg / μ I 8 個濃度梯度。取各濃度的 DNAI μ I作為模板，按實施例1的步驟2和步驟3，分別依次進行第一輪和第二輪PCR擴增。
[0025]經兩輪PCR擴增所得產物的電泳結果見圖3。圖中，M是2000bp DNA分子量marker, 1-8為不同濃度的花生青枯病菌DNA,其濃度依次為10ng、lng、100 pg、10 pg、lpg、100 fgUO fg、l fg/ μ1，9 是陰性對照。
[0026]圖3結果顯示，經過兩輪PCR擴增，泳道1-7均擴增出374bp的特異條帶，表明病原菌DNA的最低檢測濃度為lOfg/μ I。與實施例2的結果相比，本發明的巢式PCR檢測靈敏度是單獨使用特異性引物W1/W2進行一次PCR擴增檢測靈敏度的100倍。
[0027]實施例4人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測
採用浸種法接種花生青枯病菌。隨機選取2株發病植株和3株尚未顯症植株進行檢測，同時以花生青枯病菌基因組DNA為陽性對照，健康花生植株作為陰性對照。提取花生莖部組織DNA，按實施例1的步驟2和步驟3依次進行第一輪和第二輪PCR擴增。[0028]兩輪擴增後的產物電泳結果見圖4。其中，M為2000 bp DNA分子量marker，I為陽性對照，2-3分別為發病植物組織，4-6分別為發病潛伏期植物組織，7為健康植物組織，8為陰性對照。
[0029]圖4結果可見，利用巢式PCR對5個樣品進行檢測時，泳道2-6均擴增出374bp的特異條帶，健康花生植物組織和陰性對照均無擴增產物。這表明，本發明可用於花生青枯病潛伏期或感病初期時的病害檢測。
[0030]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋 範圍。
【權利要求】
1.一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其特徵在於:包括以下步驟: 步驟I)、基因組DNA提取:採用CTAB法提取花生青枯病菌基因組DNA或發病植物組織DNA ； 步驟2)、第一輪PCR擴增:以步驟I)得到的DNA樣品為模板，採用細菌16S-23S rDNAITS序列通用引物L1/L2經PCR擴增得到第一輪PCR產物；L1序列為SEQ ID N0:1，L2序列為 SEQ ID NO:2 ； PCR 反應體系 25 μ 1:DNA 模板 I μ 1，IOXPCR 反應緩衝液 2.5 μ 1，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μ1，5υ/μ1 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L 的 LI 引物 I μ 1，10 μ mol/L的L2引物I μ I，滅菌超純水補足至25 μ I ; PCR 擴增程序:95°C預變性 4min，94°C變性 I min，60°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，共30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存； 步驟3)、第二輪PCR擴增:以第一輪PCR擴增產物或擴增產物的稀釋液為模板，採用花生青枯病菌特異引物W1/W2經PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物；W1序列為SEQ ID N0:3,W2 序列為 SEQ ID NO:4 ； PCR反應體系25 μ 1:第一輪PCR擴增產物或擴增產物的稀釋液I μ 1，10 XPCR反應緩衝液 2.5μ 1,2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2 μ 1，5U/μ I DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L的Wl弓丨物I μ 1，10 μ mol/L的W2弓丨物1μ 1，滅菌超純水補足至25μ I ; PCR 擴增程序:94°C預變性 4min，94°C變性 30sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 40sec,共30個循環；72 °C延伸8min ;4°C保存； 步驟4)、PCR擴增產物檢測:取5 μ I第二輪PCR擴增產物，採用1%瓊脂糖凝膠，在110V電壓下電泳30min，之後置於EB內染色20min，取出，於凝膠成像系統下觀察拍照，如果存在374bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為花生青枯病菌； 所述的PCR反應緩衝液中均含有Mg2+。
【文檔編號】C12Q1/04GK103614475SQ201310609847
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】遊泳, 謝世勇, 李本金, 陳慶河, 丁雪玲, 劉裴清 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所