鑑定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物的製作方法

2023-11-10 09:38:12

專利名稱：鑑定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑑定水稻秈粳亞種的方法及其專用弓I物組合物。
背景技術：
秈粳分化是亞洲栽培稻遺傳分化的主流，而且秈粳亞種在多方面都表現出很大差 異。因此，秈粳亞種間雜種優勢的利用是水稻超高產育種的一項很重要的手段，直接利用秈 粳間雜種優勢已成為雜交育種的主攻方向。要進行秈粳亞種間雜種優勢的超高產育種，首 先是正確判別秈粳。秈粳中間型或非典型秈粳可能來源於秈粳的自然雜交或人工雜交，也 可能來源於分化前的原始型過渡品種。這些品種中有很多是廣親和材料，如果能夠正確認 識其在分類系統中的地位，利用這些品種作為秈粳雜交的中間橋梁，運用科學的育種方法， 減少或避免亞種間產生不育或育性較差的問題，對秈粳稻雜種優勢的利用、廣親和材料的 選育、分子標記及基因工程的順利進行都具有很重要的意義。隨著科學技術的不斷發展和深入，許多學者試圖利用現代科學方法系統直觀 地判別秈粳，以期能簡單方便地進行分類。加藤等以形態特徵、雜交親和性與血清反應 為依據，提出了稃毛、粒形和親和性等作為秈粳鑑別的性狀；R彥一等則採用判別函數Y =-K+0. 75C-0. 22H+0. 86ph來判別秈粳(K為對氯酸鉀的抵抗力；C為低溫致害程度；H為穎 尖稃毛長度；Ph為對苯酚的反應)。這兩種方法對於典型的秈粳稻是很適應的，但對於某些 地區一些類型親緣關係複雜，分類上就易產生錯誤。程侃生提出的程式指數分類法，是以稃 毛、抽穗時殼色、葉毛、酚反應、第1-2穗節長和穀粒長寬比6個性狀為鑑別指標，將每個性 狀區分為5個等級，經數字量化後以其綜合得分值劃分為秈、偏秈、偏粳和粳型4類，到目前 為止是我國廣泛採用的秈粳形態鑑別法(請參見程侃聲.亞洲稻秈粳亞種的鑑別.雲南科 技出版社，昆明，1993)。生物技術的蓬勃發展，使得遺傳標記被廣泛用於秈粳分類。張堯忠等用稻種酯酶 同工酶聚丙烯酸胺凝膠電泳法進行秈粳分析，發現了秈粳的標誌酶帶，並且結果與程式分 類法一致，但不能鑑別象光殼稻、鐮刀谷等在內的特殊材料。錢惠榮等利用RFLP(擴增片段 長度多態性)技術，篩選出了一批對秈粳特異性具有鑑別能力的RFLP探針，可以用來鑑別 秈粳測驗種。程式華等構建了秈粳交群體，結合形態指數法和分子標記法對材料的秈性成 分和粳性成分進行有效鑑別。孫傳清等利用RAPD方法，採用35個隨機引物對5個秈稻品 種、5個粳稻品種和27份中國普通野生稻進行了分析，60%以上的引物能在秈稻和粳稻基 因組間顯示差異。然而，傳統分類方法採用的分類標準大都是數量性狀，既要求鑑定者經驗豐富，具 有準確的觀察能力，還要求對鑑定時期的正確選擇，使用標準難以把握。RFLP法要經過 Southern雜交，操作複雜，工作量大；一般選用單拷貝探針，標記數量相對較少，多態性較 低；DNA用量多，相對要求DNA較完整；酶切反應，要求DNA純度較高。RAPD法模板DNA在 擴增時對模板濃度很靈敏，即不同的濃度會出現不同的擴增式樣；擴增反應時要求模板盡 量少含雜質；使用低溫復性，通常為36°C (溫度在36°C以下，小於1°C的變化就會得到完全
3不同的擴增式樣)，特異性低，引物與模板間有較高的錯配率；重複性低，即便同一實驗室 也不易重複，不同的實驗室間更是缺乏可比性。因此，到目前為止還沒有形成一套能直接用 於實際工作中的分類系統。所以，亞洲栽培稻的分類一直受到各國科學家的高度重視，亟待 建立簡便易行的分類體系，使之更好地為水稻資源和育種工作服務。SSR標記是建立在PCR基礎上的一種新型遺傳標記，能夠反映植物在遺傳物質DNA 水平上的差異，具有較高的多態性信息量，具有共顯性分離、標記位點專化性等特點，而且， 操作簡單、試驗重複性好，已在生物起源、進化、遺傳多樣性研究和品種資源鑑定中得到廣 泛應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種鑑定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物。本發明提供了輔助鑑定水稻秈粳亞種的引物組合物，由如下3個引物對組成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對RM130 ；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對RM7009 ；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對RM7337。本領域技術人員根據專業知識可以選用以上任一引物對，或是它們的組合，還可 以在合成引物時使引物帶上標記，如螢光標記。本發明提供的輔助鑑定水稻秈粳亞種的方法，屬於微衛星指數法 (MicrosatelliteIndex)，包括下列步驟(1)以待測水稻的基因組DNA為模板，用引物對RM130進行PCR擴增，得到PCR擴 增產物甲；以待測水稻的基因組DNA為模板，用引物對RM7009進行PCR擴增，得到PCR擴增 產物乙；以待測水稻的基因組DNA為模板，用引物對RM7337進行PCR擴增，得到PCR擴增產 物丙；(2)如果PCR擴增產物甲為90bp，賦值為1，如果PCR擴增產物甲為84bp，賦值 為-1 ；如果PCR擴增產物乙為99bp，賦值為1，如果PCR擴增產物乙為96bp，賦值為-1 ；如 果PCR擴增產物丙為134bp，賦值為1，如果PCR擴增產物丙為122bp，賦值為-1 ；(3)將PCR擴增產物甲、PCR擴增產物乙和PCR擴增產物丙的賦值相加，得到和值； 和值大於0的為候選的粳型稻種，和值小於0的為候選的秈型稻種。所述方法中，可採用CTAB法提取水稻的基因組DNA。所述方法中，用於提取基因組的水稻材料可為新鮮的，也可為幹品。所述方法中可採用變性膠聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測所述PCR擴增產物的大小。所 述電泳中，優選採用銀染法染色。PCR擴增產物甲、PCR擴增產物乙和PCR擴增產物丙的電泳結果(SSR圖譜)可以 採用軟體進行分析，也可以目測進行分析。實施例中採用的是15ul PCR反應體系，本領域技術人員可以將反應體系擴大或縮 小，也可以將引物增多或減少。本發明還保護一種輔助鑑定水稻秈粳亞種的試劑盒，包括所述引物組合物。所述弓I物組合物，所述方法和所述試劑盒均可以用於水稻育種。所述試劑盒中，還可包括用於提取基因組DNA的試劑和/或用於PCR擴增的試劑。
所述試劑盒中的各個組分可為液體，也可為凍乾粉。本發明基於秈粳亞種DNA重複序列的差異，提供了 3對秈粳特異性分化程度高的 SSR引物對，可用於水稻秈粳亞種的鑑定。本發明採用137種水稻樣本對本發明的引物組合 物和方法進行了驗證。所選用的材料有很好的代表性，為用SSR標記進行秈粳鑑別研究提 供了很好的平臺。本發明具有快捷高效、靈敏度高、分辨力好、結果準確可靠等優點，適用於 水稻品種的秈粳屬性鑑定、水稻育種以及植物進化研究等方面的應用。


圖1為採用引物RM7009時部分樣本的聚丙烯醯胺電泳圖。圖2為採用引物RM130時部分樣本的聚丙烯醯胺電泳圖。圖3為採用引物RM7337時部分樣本的聚丙烯醯胺電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平 均值。CTAB 提取液(1000ml)的配方(pH = 8. 0)見表 1。表ICTAB 提取液(1000ml)的配方(pH = 8. 0)
權利要求
輔助鑑定水稻秈粳亞種的引物組合物，由如下3個引物對組成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對RM130；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對RM7009；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對RM7337。
2.輔助鑑定水稻秈粳亞種的方法，包括下列步驟(1)以待測水稻的基因組DNA為模板，用引物對RM130進行PCR擴增，得到PCR擴增產 物甲；以待測水稻的基因組DNA為模板，用引物對RM7009進行PCR擴增，得到PCR擴增產物 乙；以待測水稻的基因組DNA為模板，用引物對RM7337進行PCR擴增，得到PCR擴增產物丙； 所述引物對RM130由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成；所述引物 對RM7009由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；所述引物對RM7337 由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；(2)如果PCR擴增產物甲為90bp，賦值為1，如果PCR擴增產物甲為84bp，賦值為-1；如 果PCR擴增產物乙為99bp，賦值為1，如果PCR擴增產物乙為96bp，賦值為-1 ；如果PCR擴 增產物丙為134bp，賦值為1，如果PCR擴增產物丙為122bp，賦值為-1 ；(3)將PCR擴增產物甲、PCR擴增產物乙和PCR擴增產物丙的賦值相加，得到和值；和值 大於0的為候選的粳型稻種，和值小於0的為候選的秈型稻種。
3.一種輔助鑑定水稻秈粳亞種的試劑盒，包括權利要求1所述的引物組合物。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中還包括用於提取基因組DNA 的試劑和/或用於PCR擴增的試劑。
5.權利要求1所述引物組合物在製備輔助鑑定水稻秈粳亞種的試劑盒中的應用。
6.權利要求1所述引物組合物在輔助鑑定水稻秈粳亞種中的應用。
7.權利要求1所述引物組合物、權利要求2所述方法或權利要求3或4所述試劑盒在 水稻育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鑑定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物。本發明提供的引物組合物，由如下3個引物對組成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對RM130；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對RM7009；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對RM7337。述引物組合物可用於輔助鑑定水稻秈粳亞種，具有快捷高效、靈敏度高、分辨力好、結果準確可靠等優點，適用於水稻品種的秈粳屬性鑑定、水稻育種以及植物進化研究等方面的應用。
文檔編號C12Q1/68GK101942518SQ20101029187
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者宋立營, 張冬玲, 張洪亮, 李自超, 王鳳梅, 王美興, 馬佔峰 申請人:中國農業大學