禽流感疫苗及其製備方法
2023-11-12 04:03:32
專利名稱：禽流感疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及 一種禽流感疫苗及其製備，尤其涉及禽流感疫苗製備中的重組 質粒和重組病毒的製備。
背景技術：
禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型中的一些毒株引起的急性呼吸道傳 染病。動物禽流感大規模爆發，不僅給養殖戶帶來嚴重損失，也將會給國民經 濟帶來重大損失，同時，也將會危害到人類的生存安全。
動物禽流感疫苗是預防與治療動物禽流感 一 種行之有效的方法。
現有的疫苗是用雞胚生產，生產商需要提前12個月訂購雞胚。病毒需要適 應雞胚後才能在雞胚中生長，疫苗的生產周期較長。病毒在雞胚的傳代過程中 病毒會發生變異，疫苗株與流行株之間的差異會降低疫苗的免疫保護效果。禽 流感對雞胚有易致病性，易於引起雞胚的死亡。
歐洲醫藥委員會批准的人用流感疫苗，MDCK(犬腎細胞)生產的疫苗，但
生產規模有限，目前僅夠100萬人使用劑量。
Treanor ( 2007 )用滅活病毒裂解疫苗以90, 45， 15， 7.5ugHA抗原肌肉注 射免疫兩次，18-64歲451人參與實驗。實驗結果表明，免疫誘導的抗體反應 效果欠佳。
發明內容
本發明的目的是提供 一種克服上述缺陷的動物禽流感疫苗。本發明的基因 毒，由於家蠶杆狀病毒宿主狹小，無論是在生產和使用上，它都具有比傳統疫苗，安全性好，且利用家蠶生物反應器大量表達目的蛋白，生產成本低，產量高，易搡 作，適用於大規模的生產。
本發明的技術方案如下
本發明提供一種重組基因，由杆狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列(SEQIDNO:7 所示)、禽流感病毒主要抗原基因HA序列(SEQ ID NO: 8所示)和杆狀病毒囊膜蛋白gp64 跨膜域基因序列(SEQ ID N0:9所示)融合而成。
上述重組基因的製備方法採用以SEQ ID N0:1與SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 3與 SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 6為引物進行PCR擴增的方法。
本發明還提供上述重組基因與pBacPAK8質粒重組構建的重組質粒。
上述重組質粒的製備方法，BamH I和Not I雙酶切pBacPAK8質粒和BatnH I和Not I雙酶切權利要求1所述的重組基因進行重組。
本發明還提供含有上述重組基因的家蠶重組杆狀病毒BmHA，該病毒保藏在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為家蠶核型多角體病毒(Botnbyxmori nucleopolyhedrovirus)，保藏日期為2007年12月28日，保藏編號為CGMCC No. 2316。
上述家蠶重組杆狀病毒BmHA的製備方法
(1) 取權利要求3所述的重組質粒和經Bsu36I酶切的病毒BmBacPAK6的DNA，加 入無血清的培養基混勾製成pBacHA混合液；
(2) 取Dosper,加入無血清的培養基，混勾製成Dosper混合液；
(3) 將培養BmN細胞用無血清的培養基洗滌後，逐滴加入上述製備的pBacHA混合 液和Dosper混合液，27'C培養；
(4) 收取培養皿中的上清，感染BmN細胞，瓊脂糖培養；
(5) 挑取噬斑，分組感染BmN細胞，保存上清；
(6) 感染的BraN細胞DNA用於Southern blot斑點雜交；
(7) 取保存的斑點雜交中陽性克隆細胞的上清進行噬斑篩選；
(8) 取噬斑篩選的陽性克隆細胞的上清感染家蠶細胞。
本發明還提供上述重組基因表達的蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO:IO所示。 上述蛋白的製備方法(1 )將權利要求5所述的家蠶重組杆狀病毒BmHA感染BmN細胞進行病毒
擴增，
(2)針刺接種法接入家蠶五齡起蠶和蛹，
本發明進一步提供上述家蠶重組杆狀病毒BmHA在製備動物禽流感疫苗中 的應用。
本發明還提供上述蛋白在製備動物禽流感疫苗中的應用。 本發明實現的技術效果如下
利用家蠶幼蟲、蛹作為生物反應器，家蠶杆狀病毒表達系統高效表達具有 極高臨床應用價值動物禽流感疫苗的方法。本方法適用於大規模生產，降低了 成本，且產量高，所生產的動物禽流感疫苗應用價值大。
圖1:含重組基因SP-HA — TM的重組質粒pGEM-HA;
圖2:含重組基因SP-HA - TM杆狀病毒轉移質粒pBacHA;
P: polyhedrin,多角體蛋白基因啟動子；A: Polyhedin Poly A+ signal, 多角體蛋白基因聚腺苷酸化信號；M13oW: M13噬菌體複製起始點；Amp:氨 苄青黴素基因；or/: pUC複製起始點。
具體實施例方式
本發明所述的利用家蠶生物反應器動物禽流感疫苗的方法，是通過PCR的 方法獲得禽流感病毒主要抗原HA基因的重組基因，並在其5'和3'端分別引 入BaniH T和Not I酶切位點，與家蠶杆狀病毒載體pBacPAK8相連接，連接產 物與野生型家蠶杆狀病毒BmBacPAK6在家蠶細胞中發生同源重組，通過空斑篩 選，獲得帶重組基因SP-HA-TM的家蠶重組杆狀病毒，人工接種家蠶幼蟲、蛹， 經5-7天後收集幼蟲體液和蛹體，勻漿，進行離心，分離純化，冷凍乾燥，無 菌條件下製成動物禽流感疫苗凍乾粉實現的。下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容 實驗例1:重組基因SP-!IA-TM的構建。
禽流感病毒主要抗原基因是HA基因，在HA基因的5'和3'端分別連接編 碼杆狀病毒囊膜蛋白gp64的信號肽基因序列和編碼杆狀病毒囊膜蛋白gp64的 跨膜域基因序列，構建重組基因。通過引物設計，在該重組基因的5，和3，端 分別引入BamH I和Not I內切酶酶切位點。分別以杆狀病毒AcNPV囊膜蛋白 gp64的信號肽基因序歹U、禽流感病毒H5N1的HA基因序列和杆狀病毒AcNPV囊 膜蛋白gp64的跨膜域基因序列為模板設計3對引物，首先PCR擴增目的片段 gp64信號肽基因序歹J (sp)、 HA基因和gp64跨膜域基因序列(tm)，然後利用 各目的片段互為引物和模板構建重組基因SP-HA - TM。
引物設計如下
Pspl formula see original document page 75'AGGCGGCCGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCAT 3，。 (1) gp64信號肽基因序列(sp)的擴增
以gpM的DM序列為模板，PCR反應參數設計為，94。C預變性3min, 94 'C變性30s， 68。C復性延伸30s， 30個循環，68。C延伸5min。 在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列組分
710 x PCR Buffer 10 ju 1
25n腦l MgCl2 8 m 1
2. 5 mmol d證s 8 ja 1
Pspl 1 |U 1
Psp2 lul
模板 1 H 1
KOD-Plus DM聚合酶 1 ja 1
加無菌雙蒸水至]00 m 1。
各組分混勻後，放入PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應 結東後，電泳鑑定擴增片段，同時切膠回收擴增片段。
(2) gp6糹跨膜域基因序列(tm)的擴增
以gp64的DNA序列為模板，PCR反應參數設計為，94。C預變性3min， 94 "C變性30s， 68。C復性延伸30s, 30個循環，68。C延伸5min。
lOOul的反應體系同上，所用引物為Ptml和Ptm2 ,各組分混勻後，放入 PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應結東後，電泳鑑定擴增片
段，同時切膠回收目擴增片段。
(3) HA基因的擴增
以禽流感病毒H5N1 HA基因為模板，PCR反應參數為94。C預變性3min, 94 n變性30s, 68。C復性延伸lmin， 30個循環，68。C延伸5min。
100ul的反應體系同上，所用引物為Phal和Pha2 ,各組分混勻後，放入 PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應結東後，電泳鑑定擴增片段， 同時切膠回收目的片段。
(4) gp64信號肽sp基因與HA基因的融合
PCR反應參數為94。C預變性3min， 94。C變性30s， 68。C復性延伸lmin， 30 個循環，68。C延伸5min。
在 一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列組分 10 x PCR Buffer 10 ju 1
825mml MgCl2 8 p 1
2. 5 mmol dNTPs 8 ju 1
Pspl ljul Pha2 1 ju 1
模板sp 1M1 模板HA 1 u 1
kod-Plus dna聚合酶1 jj 1
加無菌雙蒸水至100p 1。
各組分混勻後，放入PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應 結束後，電泳鑑定擴增片段，同時切膠回收擴增片段。
因為sp的下遊引物Psp2在設計時加入了 HA基因5'端的部分序列，所以 PCR擴增出的sp片段3，端序列與HA基因5，端序列存在重疊，再次利用PCR 方法就可以擴增出重組基因sp-HA序列。
(5 )重組基因sp-HA與tm的融合，構建出重組基因sp-HA - tm
PCR反應參數為94。C預變性3min, 94。C變性30s, 68。C復性延伸1. 5min, 30個循環，68。C延伸5min。
在--個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分
10 x PCR Buffer 10 )a 1
25mmol MgCl2 8 n 1
2. 5 mmol dNTPs 8 ju 1
Pspl lMl
Ptm2 1 ju 1
模板sp-HA ljul
模板tm 1 ii 1
KOD-Plus DNA聚合酶 1 n 1
加無菌雙蒸水至100ja 1。
各組分混勻後，放入PCR儀中，按上述反應參數設計30個循環。待反應結東後，電泳鑑定擴增片段，同時切膠回收目的片段。
同上，因為tra的上遊引物Ptml設計時加入了 HA基因3'端的部分序列， 所以PCR擴增出的tm片段5'端序列與HA基因3'端序列存在重疊，利用PCR 方法就可以擴增出重組基因sp-HA - tni。 實驗例2:克隆質粒pGEM-HA的構建
將PCR擴增出的重組基因sp-HA - tm連接到pGEM-T vector上 重組;^因sp-HA-tm 2ul pGEM-T vector 0. 5ul
2xRapid Ligation buffer 5ul T4 DNA ligase lul
ddH,O_1. 5ul
lOul
上述組分混句，25'C反應lh。
反應混合物轉化至感受態細胞E. coli DH5a中，塗平板，於37。C培養， 12-16小時後可出現菌落。挑取單菌落，提取質粒，進行酶切和測序，序列完 全正確，得到質粒pGEM-HA。
實驗例3:含重組基因SP-HA-TM的杆狀病毒轉移質粒pBacHA的獲得 質粒pGEM-HA經Bamll工和Not I雙酶切，切下重組基因SP-IIA - TM片段， 克隆至經Bamll I和Not I雙酶切的質粒pBacPAK8中，使重組基因SP-HA - TM 置於多角體蛋白(polyhedrin， ph)基因啟動子控制之下，構建成重組轉移質粒 pBacHA,經酶切分析鑑定基因序列正確。
實驗例4:含重組基因SP-HA - TM的家蠶重組杆狀病毒BmHA的獲得 取重組轉移質粒pBacHA和經Bsu36I酶切線性化的病毒BraBacPAK6 DNA, 加入lOOul無血清的TC-100培養基(G工BCOBRL公司)混勻製成pBacHA混合液。 取6ul的Dosper (寶靈曼公司)，加入lOOul無血清的TC-IOO培養基，混勻制 成Dosper混合液。將事先培養在35mm平皿中的BmN細胞用無血清的TC-100 培養基洗滌兩次，逐滴加入上述製備的pBacHA混合液和Dosper混合液，27"C
10培養4-5天。收取上清進行第一輪嗜斑篩選。取5ul上清感染35隱平皿中的 BraN細胞，1小時後棄去上清加入等量混合的TC-100培養基和低熔點瓊脂糖。 4-5天後挑取噬斑，分組感染BmN細胞3-4天，保存上清，細胞用NaOH裂解用 於Southern blot斑點雜交，以重組基因SP-HA - TM作模板用隨機引物探針標 記試劑盒(寶靈曼公司)標記探針，雜交方法按照《分子克隆》(科學出版社， 1 995 )。取保存的斑點雜交中陽性克隆細胞的上清進行第二輪噬斑篩選。取陽性 克隆細胞的上清感染家蠶細胞，以擴增得到大量的含重組基因SP-HA-TM的重 組杆狀病毒BmHA。該病毒能感染家蠶細胞，在顯微鏡下感染的家蠶細胞呈發 病狀。
實驗例5: HA融合蛋白在家蠶5齡幼蟲和蛹中的表達
將重組病毒BmHA以10 MOT感染BmN細胞進行病毒擴增，按1 x 1"PFU/條 針刺接種法接入家蠶五齡起蠶或蛹，在感染5-7天後，採取蠶體或蛹體勻漿， 經高速離心U2000rpm, 30min)，取上清，測血淋巴中的HA活性，在感染的第 6天，血淋巴中的HA活性達到6 x 104U/nil。高速離心後的上清加入等體積的2 x蛋白質上樣緩衝液(100Mm Tris.HCl,4% SDS, 0. 1%溴酚藍，10%甘油),IO(TC 加熱10min，取20ul進行SDS-PAGE分析。結果表明，重組病毒已表達HA融合 蛋白。蛋白測序結果顯示，其胺基酸序列如如SEQ ID NO:10所示。
實驗例6:動物禽流感疫苗的獲得 (1)從蠶蛹中分離純化HA融合蛋白(動物禽流感疫苗)
a. 取適量經BmHA感染的蠶蛹樣品，在4"C下解凍後，與0. 85%生理鹽水適
b. 將勻漿液加入500ml離心管中，配平，3000rpm離心20-60min,取上清， 小心棄去油脂；
c. 將3000rpm離心上清液倒入新500ml離心管中，配平，6000，離心 20-60min,取上清，棄油脂；
d. 6000rpm離心的上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離心 30—120min,取上清，棄油脂；
11e. 12000rpm離心上清液轉入新的50ml離心管，配平，18000rpm離心 30-120min，取上清，棄油脂；
f. 18000rpm離心後的上清，在超淨臺上分裝於滅菌的超離管中，平衡， 35000rpm離心30-90min;
g. 3500rpm離心後，取上清，進行超濾。 (2 )超濾
使用中空纖維膜進行超濾。選擇合適的中空纖維膜規格(截留分子量為 750kD)，進行清洗後加樣，用適量無菌超純水超濾。 (3 ) 動物禽流感疫苗生物活性鑑定
超濾後的樣品進行測活，測活方法釆用紅細胞凝集試驗。取24孔細胞培養 板，在每一排的1到6孔(Al-A6 )加250 p 1生理鹽水(0. 85% )後，加入250 Hl樣品於第一孔，做倍比稀釋，同時設置陰性對照孔，加入不含樣品的液體 做倍比稀釋，再加入1%雞紅細胞懸液250 yl至每一孔內，輕輕震蕩培養板， 於37'C脬育4小時後觀察結果。
用Bradford法(考馬斯亮藍法)檢測樣品蛋白含量。
動物禽流感疫苗比活計算(mg/mL)公式如下動物禽流感疫苗比活=2" x 4/樣品濃度，n為發生紅細胞凝集的孔數。該方法所獲得的動物禽流感病毒比 活可達20以上。
(4 )保存及檢測
比活較高的樣品，無菌分裝，-50'C冷凍乾燥，製成動物禽流感疫苗凍乾粉。 同時，再鑑定凍乾粉比活，取達到20以上者。12%SDS-PAGE電泳檢測，在45kD 處有目的蛋白的表達。 (5 )疫苗效果
動物禽流感疫苗進行動物體中試驗，皮下注射，注射劑量為0. 1-50mg/kg,
在4周齡雞體內產生抗體，其保護抗體效價大於l: 150，攻毒試驗結果顯 示該疫苗能產生中和抗體並具有明顯抵抗病毒的效果。安全藥理結果顯示該疫苗對雞的心血管、呼吸系統、神經系統、體溫等無明顯影響。長毒結果顯示該 疫苗對雞無毒性。急毒結果顯示該疫苗對雞進行皮下注射，最大耐受劑量大於
153mg/kg。致突變試驗結果顯示該疫苗無致突變性。
可見，該疫苗在動物體中能產生抗體，具有明顯保護作用，無毒副作用， 安評結果表明該疫苗安全有效。SEQUENCE LISTING
浙江中奇生物藥業股份有限公司 禽流感疫苗及其製備方法
071437-I-CP-nzj
2007101642157
2007-09-30
10
Patentln version 3.5
1
28
DNA
引物
1
teggatccat gctactagta aateagtc 28
2
43
DNA
引物
2
gtgtaacagt aacgttcttt tccgcaaagg cagaatgcgc cgc 43
3 31 DNA 引物 3
taaaagaacg ttactgttac tgttacacat g 31
14<210〉 4 25 DNA <213〉 引物 4
aatgcaa組ctgcattgta acgac 25
5 48 DNA 引物 <400〉 5
tcgttacaat gcagaatttg cattggtgat actgggctat ccaaaaat 48
<210〉 6 31 DNA 引物 <■〉 6
aggcggccgc ttactttcca agtcggttca t
31
7 114 DNA gp64信號肽 7
,ctactog tMato3gte血cc犯ggc ttcgata卿肌c3cac犯g cgagatggta 60 ggcgctattg ttttatacgt gcttttggcg gcggcgcatt ctgcctttgc ggcg 114 8 1110 DNA 〈213〉HA基因 8
ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaact gaaacaccta 60
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaat 120
catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccctacc tggggaagcc ctcctttttc 180
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaat aatacatacc caacaataaa gaggagctac 240
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc caatgatgag 300
gcagggcagg taaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg aacatcaaca 360
ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaatgg gcaaagtgga 42 0
agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgagg ctatcaattt cgagagtaat 480
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctetgcaatt 540
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatggggggc 600
gataaatttc ctagtatgcc attccacaac atacaccctc tcaccatcgg ggaatgcccc 660
aaatatgtga aatcaaacag attagtcctt gcgactgggc tcagaaatag ccctcaaaga 720
gagagaagaa gaaaaaagag aggattattt ggagctatag caggttttat agagggagga 780 tggcagggaa tggtagatgg ttggtatggg taccaccata gcaatgagca ggggagtggg 8 40
tocgctgcag iiCii肌giiatc C3ctca3aag gcaategatg gagte3cc肌t肌ggteaac 900
tcgatcallg acaaaatgaa cactcagttt gaggccgttg gaagggaatt taacaactta 960
gaaaggagaa tagagaattt aaacaagaag atggaagacg gattcctaga tgtctggact 1 020
tataatgctg aacttetggt tctcatggaa aatgagagaa ctctagactt tcatgactca 108 0
aatgtcaaga acctttacga caaggtccga 1110
9 72 DNA gp64跨膜域基因 9
加atgtttg gtcatgtagc cacttttgta attgtattta ttgtaatttt atttttgtac 60 tgtatggttt aa 72
10 <2U〉 393 PRT 重組蛋白 10
Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu 15 10 15
Leu Lys His Leu Leu Ser Arg lie Asn His Phe Glu Lys lie Gin lie
20 25 30
lie Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser
35 40 45
Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Lys Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val
50 55 60
Trp Leu lie Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr lie Lys Arg Ser Tyr 65 70 75 80
Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly lie His His
85 90 95
Pro Asn Asp Glu Ala Gly Gin Val Lys Leu Tyr Gin Asn Pro Thr Thr 100 105 110
Tyr lie Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg Leu Val Pro Lys
115 120 125
lie Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gin Ser Gly Arg Met Glu Phe
130 135 140
Phe Trp Thr lie Leu Lys Pro Asn Glu Ala lie Asn Phe Glu Ser Asn 145 150 155 160
17Gly Asn Phe lie Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie Val Lys Lys Gly
165 170 175
180 185 190
Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Gly Asp Lys Phe Pro Ser Met Pro Phe
195 200 205
His Asn lie llis Pro Leu Thr lie Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys
210 215 220
Scr Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gin Arg 225 230 235
Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe
245 250 255
[is
260 265 270
His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr
275 280 285
Gin Lys Ala lie Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser lie lie Asp
290 295 300
Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu 305 310 315
325 330 335
Asp Val Tip Thr 'Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu 340 345 350
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys
355 360 365
Val Arg Phe Met Phe Gly His Val Ala Thr Phe Val lie Val Phe lie
370 375 380
Val lie Leu Phe Leu Tyr Cys Met Val 385 390
18
240
320
權利要求
1. 一種重組基因，由杆狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列、禽流感病毒主要抗原基因HA序列和杆狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列重組而成。
2. 權利要求l所述重組基因的製備方法其特徵在於，所述方法中釆用以SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 6為引物進行PCR擴增的方法。
3. 權利要求1所述的重組基因與pBacPAK8質粒重組構建的重組質粒。
4. 權利要求3所述重組質粒的製備方法其特徵在於，所述方法中，BamHI和Not I雙酶切pBacPAK8質粒和BamH I和Not I雙酶切權利要求1所述的重組基因進行重組。
5. 含權利要求1所述的重組基因的家蠶重組杆狀病毒BmHA,該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 2316。
6. 權利要求5所述家蠶重組杆狀病毒BmHA的製備方法(1 )取權利要求3所述的重組質粒和經Bsu36I酶切的病毒BmBacPAK6的DM，加入無血清的培養基混勻製成pBacHA混合液；(2) 取Dosper,加入無血清的培養基，混句製成Dosper混合液；(3) 將培養BmN細胞用無血清的培養基洗滌後，逐滴加入上述製備的pBacHA混合液和Dosper混合液，27。C培養；(4) 收取培養皿中的上清，感染BmN細胞，瓊脂糖培養；(5) 挑取噬斑，分組感染BmN細胞，保存上清；(6 )感染的BmN細胞DNA用於Southern blot斑點雜交；(7 )取保存的斑點雜交中陽性克隆細胞的上清進行噬斑篩選；(8 )取P藍斑篩選的陽性克隆細胞的上清感染家蠶細胞。
7. 權利要求1所述的重組基因表達的蛋白，其胺基酸序列如SEQIDNO:IO所示。
8. 權利要求7所述蛋白的製備方法(1 )將權利要求5所述的家蠶重組杆狀病毒BmHA感染BmN細胞進行病毒(2) 針刺接種法接入家蠶五齡起蠶及蛹，(3) 收集表達的權利要求7所述蛋白。
9. 權利要求5所述家蠶重組杆狀病毒BmHA在製備動物禽流感疫苗中的應用。
10. 權利要求7所述的蛋白在製備動物禽流感疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種禽流感疫苗及其製備，尤其涉及禽流感疫苗製備中的重組質粒和重組病毒的製備。本發明提供一種重組基因及其製備方法，由杆狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列、禽流感病毒主要抗原基因HA序列和杆狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列融合而成。本發明還提供上述重組基因與pBacPAK8質粒重組構建的重組質粒，以及含有上述重組基因的家蠶重組杆狀病毒BmHA及其製備方法。上述含有重組基因的家蠶重組杆狀病毒BmHA保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.2316。本發明還提供上述重組基因表達的蛋白。本發明提供的，上述家蠶重組杆狀病毒BmHA和蛋白可用於製備動物禽流感疫苗。本方法適用於大規模生產，降低了成本，且產量高，所生產的動物禽流感疫苗應用價值大。
文檔編號C12N15/62GK101487016SQ20081016133
公開日2009年7月22日 申請日期2008年9月19日 優先權日2007年9月30日
發明者呂正兵, 張耀洲, 金來榮, 琴 陳 申請人:浙江中奇生物藥業股份有限公司