用於生產生物燃料的帕米爾綠球藻的培養的製作方法

2023-11-02 13:06:32 1

專利名稱：用於生產生物燃料的帕米爾綠球藻的培養的製作方法
技術領域：
本發明涉及帕米爾綠球藻的提純方法，培養該藻類的方法，以及提高其油脂含量的方法。該富油藻類可用於生物燃料的大規模生產。
背景技術：
可持續的能源供應和環境保護，現在被認為是本世紀國際社會，特別是美國，所面臨的兩個最關鍵的問題。例如，美國嚴重依賴石油進口，尤其是交通運輸行業消耗了化石燃油國內用量的三分之二。石油進口成本佔美國貿易赤字增長的三分之一，對美國經濟的負擔越來越重。儘管美國可以繼續增加石油進口，但全球石油供應不是無限的。即使根據樂觀的估計，世界石油資源約為2. 2-3. 9萬億桶，是已探明儲量的近兩倍，但在30年至50年內，世界的石油供應將會告罄。中國，印度和其他國家的新興市場和快速增長的經濟體對石油的需求進一步地加劇了競爭和價格波動。此外，世界上存在著化石能源的大量使用的問題，以及美國、尤其是美國運輸行業存在對外國石油進口存在嚴重依賴，美國同時面臨著上述問題的交匯。交通運輸業燃料的使用推動國家的石油進口需求，並造成約一半的溫室氣體排放量，美國和全球的化石燃料使用和溫室氣體排放對氣候造成變化，這是另一個越來越受到關注的問題。石油進口和消費構 成的對經濟和環境的影響還是一個重要的國家安全問題。在全球石油完全枯竭前，能夠以何種量、何種速度、以及何種程度地減少對化石燃料的需求，並通過提供可持續供應的可再生能源，同時在國內控制溫室氣體的排放量，將決定所產生的影響的嚴重程度。微藻屬於光合微生物，可以從環境利用無機營養素(如氮，磷)生產有機的化合物，如蛋白質，顏料，和油脂。微藻是淡水和海洋生物系統中發現的微小藻類。它們大多是單細胞微生物。已知微藻比農業作物的增長速度快10-20倍，某些微藻可積累大量的脂類或油(佔乾重的30%至60%)。其結果是，使用微藻作為生物燃料特別是生物柴油的生產原料的替代資源，相關技術方案的研究工作已經深入開展。雖然微藻的生物柴油生產只處於實驗室規模，尚無由微藻生產的生物柴油的商業化產品。我們所面臨的挑戰是如何將具備性價比和高效率的技術、系統及流程成功地進行開發和商業化。

發明內容
為解決上述問題，本發明的目的是通過提供一種培養和提純微藻帕米爾綠球藻(Chlorococcum pamirum)的方法，以便優化細胞株的成長使得微藻的油脂生產也得以優化。本發明所提供的方法誘導和提高帕米爾綠球藻細胞內油脂積累。此處所公開的方法適合於大規模的富油微藻生產。更具體地說，本發明提供了用於優化帕米爾綠球藻菌株生長和誘導帕米爾綠球藻細胞內油脂積累的生長培養基和培養條件。一方面，本發明 提供了一種增加微藻帕米爾綠球藻中的油脂積累的方法，包括在
培養基中培養微藻。另一方面，本發明提供了一種用於生產富油微藻的培養基，該培養基包括微量元素和從硝酸鈉、硫酸鎂、碳酸鈉、氯化鈣、乙二胺四乙酸二鈉和磷酸氫二鉀及等等類似物中所選取的無機化合物。在一個實施例中，該培養基中含有約O. 025-1. 75克/升的硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升的氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升的乙二胺四乙酸二鈉，約O. 075-1. 5克/升的3水合磷酸氫二鉀，約O. 2-2毫升/升A5微量元素(乏氮)。在另一個實施例中，該培養基中還含有約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉。在另一個實施例中，該培養基中含有約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約O. 025-1. 75克/升硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 2-2毫升/升的A5微量元素(乏磷)。在另一個實施例中，該培養基中還含有濃度至少為O. 1% w/v的氯化鈉。另一方面，本發明提供了一種用於生產生物柴油原料的方法，包括(a)在培養基中培育的微藻帕米爾綠球藻；(b)誘導油脂在微藻中富集，(C)從培養基分離富油微藻；(d)從富油微藻中提取脂類或油。另一方面，本發明提供了微藻帕米爾綠球藻在製備富油微藻中的用途。另一方面，本發明提供了帕米爾綠球藻在油料或脂類生產中的用途。另一方面，本發明提供了本文所述的方法在生產作為生物柴油原料的富油微藻中的用途。另一方面，本發明提供了一種微藻細胞集落，包括富油微藻帕米爾綠球藻，其中所述富油微藻細胞包括了高於正常培養條件下的微藻細胞所能產生的量的油脂。參照以下的附圖具體實施方式
和權利要求書，將能夠更好地理解本發明的各個方面。


圖1A和圖1B示出氮濃度對帕米爾綠球藻 生長的影響，測量參數包括(A) 550nm波長下的光強度，(B)乾重。圖2A和圖2B示出磷濃度對帕米爾綠球藻生長的影響，測量參數包括(A) 550nm波長下的光強度，(B)乾重。圖3A和圖3B示出了乏氮和/或乏磷時對帕米爾綠球藻生長(A.測量乾重的變化)和油脂含量(B.佔乾重的百分比)的影響。
具體實施方式
已知帕米爾綠球藻是綠藻類微藻，並在德州大學奧斯汀分校藻類培養物保藏中心進行保藏，其UTEX保藏編號為2498。本發明涉及用於提純和培養帕米爾綠球藻以及增加帕米爾綠球藻細胞中的油脂富集的方法和成分。一方面，本發明提供了一種增加油脂在帕米爾綠球藻中富集的方法，其特徵在於在培養基中培養該微藻並引導油脂在微藻中富集。在該方面的一個實施例中，所述培養包括在含有培養基的瓊脂平板上培養微藻細胞，以及在含有培養基的容器培養微藻細胞。在該方面的另一個實施例中，所述培養包括在含有培養基的瓊脂平板上培養微藻細胞，在含有生長培養基的容器中培養微藻細胞；以及進一步地在光生物反應器中培養微藻。在該方面的另一個實施例中，所述的培養包括在上述方法步驟中，至少有一步對微藻細胞實施光照。在該方面的另一個實施例中，所述的培養包括在上述方法步驟中，每一步都對微藻細胞實施光照。在該方面的另一個實施例中，用於照明的光可以是螢光燈光，正常白天環境光，或太陽光。在該方面的另一個實施例中，所述螢光燈的光具有至少200 μ m0l m-2s—1的強度。在該方面的另一個實施例中，培養基中含有微量兀素和從硝酸鈉、硫酸鎂、碳酸鈉、氯化鈣、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鉀，以及其它類似物中所選取的無機化合物。在該方面的另一個實施例中，培養基中成分包括約0. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約0. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約0. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約0. 025-0. 20克/升氯化鈣，約0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，約0. 2-2暈升/升的A5微量兀素，pH值在7. 4-8. 2的範圍內。在該方面的另一個實施例中，培養基由下述成分組成約0. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約0. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約0. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約0. 025-0. 20克/升氯化鈣，約0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，約0. 2-2暈升/升的A5微量兀素，pH值在7. 4-8. 2的範圍內。在該方面的另一個實施例中，所述誘導油脂富集於微藻細胞是指在乏氮培養基中培養微藻細胞。在一個實施例中，該乏氮培養基的成分包括約0. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約0. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約0. 025-0. 20克/升氯化鈣，約0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，約0. 2-2毫升/升的A5微量元素。在另一實施例中，乏氮培養基基本由以下成分組成0. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約0. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約0. 025-0. 20克/升氯化鈣，約0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，以及約0. 2-2毫升/升的A5微量元素，pH值在約7. 4-8. 2的範圍內。在該方面的另一個實施例中，所述誘導油脂富集在微藻細胞中，是指在乏磷環境培養微藻細胞。在一個實施例中，該乏磷培養基中含有約0. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約0. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約0. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約0. 025-0. 20克/升氯化鈣，約0. 001 0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約0. 2-2毫升/升的A5微量元素。在該方面的另一個實施例中，乏磷培養基基本由以下成分組成約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，和大約O. 2-2毫升/升的A5微量元素，pH值在約7. 4-8. 2的範圍內。在該方面的另一個實施例中，所述誘導油脂在微藻帕米爾綠球藻細胞中富集的光的強度是至少大於200mmol nT2s'在該方面的另一個實施例中，所述的誘導進一步包括在含有濃度至少為O. 1% w/V的氯化鈉的培養基中培養微藻細胞。在一個實施例中，該培養基可以通過向普通培養基中添加適量的氯化鈉方式獲得。另一方面，本發明提供了一種用於提高微藻帕米爾綠球藻油脂富集的培養基，該培養基包括微量元素從硝酸鈉、，硫酸鎂、，碳酸鈉、，氯化鈣、，乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鉀，以及其它類似物中所選取的無機化合物。在該方面的一個實施例中，該培養基成分包括約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，以及約O. 2-2暈升/升的A5微量兀素。在該方面的另一個實施例中，該培養基基本由以下成分組成約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣約O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，以及約O. 2-2暈升/升的A5微量兀素。在該方面的另一個實施例 中，該培養基包括約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，大約O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，約O. 2-2毫升/升的A5微量元素。在該方面的另一個實施例中，該培養基中有約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，以及約O. 2-2毫升/升的A5微量元素(乏氮)。在該方面的另一個實施例中，該培養基包括約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 2-2暈升/升的A5微量兀素。在該方面的另一個實施例中，該培養基有約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，約O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 2-2毫升/升的A5微量元素(乏磷)。在該方面的另一個實施例中，前述的任一培養基中還進一步包含濃度至少為O. 1% w/v以上的氯化鈉。另一方面，本發明提供了一種含有富油的微藻帕米爾綠球藻細胞株的微藻細胞集落，其中所述的富油微藻細胞的油脂富集水平高於在正常狀態之下培養的微藻細胞。在該方面的一個實施例中，該細胞集落是從培養基中分離的。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落被提純。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的油脂水平至少高於正常油脂水平10%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的油脂水平至少高於正常油脂水平20%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的油脂水平至少高於正常油脂水平30%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的油脂水平至少高於正常油脂水平50%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的油脂水平至少高於正常油脂水平100%。在該方面的另一個實施例中，該微藻細胞集落包含至少佔乾重30%的油脂。在該方面的另一個實施例中，該微藻細胞集落包含至少佔乾重40%的油脂。在該方面的另一個實施例中，該微藻細胞集落包含至少佔乾重50%的油脂。在該方面的另一個實施例中，該微藻細胞集落包含約佔乾重至少50-70%的油脂。在該方面的另一個實施例中，該微藻細胞集落包含約佔乾重至少55-65%的油脂。本技術領域的一般技術人員將能夠明白，在本發明的實施中初始細胞濃度通常不受限制，例如，本文所公開的細胞培養基中初始細胞濃度範圍可以為10，000 1，000，000個細胞每毫升。另一方面，本發明提供`了一種用於生產生物柴油的原料的方法，其特徵在於，包括(a)在培養基中培育的微藻帕米爾綠球藻；(b)誘導油脂在微藻中富集，(b)從培養基分離富油微藻；(C)從富油微藻中提取脂類或油。在該方面的一個實施例中，所述提純方法包括轉移微藻到含有培養基的瓊脂平板上。在該方面的另一個實施例中，所述誘導油脂富集包括在從約5°C至約35°C的溫度條件下培養微藻細胞。在該方面的另一個實施例中，所述誘導油脂富集包括在從約25°C至約30°C的溫度條件下培養微藻細胞。在該方面的另一個實施例中，該方法進一步包括在乏氮介質中培育微藻細胞。在該方面的另一個實施例中，該方法進一步包括在乏磷介質中培育微藻細胞。在該方面的另一個實施例中，所述誘導油脂富集包括對微藻使用光照。在該方面的另一個實施例中，該用於照明的光包括螢光燈的光，白天的環境光或陽光。在該方面的另一個實施例中，該螢光燈的光具有200 μ mo I IrT2iT1的強度。在該方面的另一個實施例中，該方法進一步包括擴大微藻的培養規模。在該方面的另一個實施例中，該擴大培養規模包括保持微藻在含有生長培養基的瓊脂平板上，在含有50-1000毫升培養基的反應器中培養微藻，以及在5-20升的光生物反應器中培養微藻。另一方面，本發明提供微藻帕米爾綠球藻在生產油脂中的用途。在該方面的另一個實施例中，通過在培養基中培育微藻帕米爾綠球藻使油脂富集。
另一方面，本發明提供了作為生產生物柴油的原料的富集油脂的微藻帕米爾綠球藻細胞集落的用途。在該方面的一個實施例中，該細胞集落中的含油水平為高於自然狀態下的微藻帕米爾綠球藻細胞株至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少100%，或至少為120%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平是乾重的30% -70%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平是乾重的40% -70%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平是乾重的50% -65%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平是乾重的55% -60%。另一方面，本發明提供帕米爾綠球藻細胞株的富油細胞集落或其單個的變化形式在生產油料和/或脂質中的應用。在該方面的一個實施例中，該細胞集落中的含油水平為高於自然狀態下的微藻帕米爾綠球藻細胞株至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少100%，或至少為120%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平乾重的30% -70%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平乾重的40% -70%。在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平乾重的50% -65%。

在該方面的另一個實施例中，該細胞集落的含油水平乾重的55% -60%。本文所用術語「約」，是指到基線值的百分之十(10%)內的值的範圍。即，例如，「約100」指的是在90和110之間的範圍內的值。當術語「約」用於描述範圍時，是指上限值和下限值可以在基線值的百分之十(10%)範圍內變動。本文所用術語「該」可表示單數和複數形式。通常地，當一個名詞無論是以單數或以複數形式使用時，它同時表示單數和複數形式的該名詞。本文所用的術語「生物燃料」，通常是指以某種方式來源於生物質的一種燃料。該術語涵蓋了固體生物質、液體燃料和沼氣。然而，在本發明中，專門指生物柴油。本文所用的術語「生物柴油」，是指通常已知的脂肪酸酯(例如，甲基、乙基、丙基、等等)。根據本發明所生產的微藻主要含有脂質(包括油-甘油三酯、游離脂肪酸、磷脂、等)。在對微藻進行培養後，首先收穫微藻生物團，然後將其萃取，得到脂質(油和其它類脂)。這些脂質將被用作生產生物柴油的原料。例如，油脂豐富的微藻提取的脂類可以根據已知的化學反應和/或化學工程流程(例如，通過酯化和/或酯交換)很容易地轉化為生物柴油。在本專利中，術語「油」和「脂質」有時可以互換使用。通過本發明提供的富油微藻生產的生物柴油具有廣泛的應用，其中包括，但不限於，使用在標準的柴油發動機或轉換的柴油發動機的車輛、火車、飛機等，或作為住宅或商業鍋爐使用的加熱燃料。該生物柴油可以單獨使用，或與石油柴油混合。它也可以被用作一個採暖用油的低碳替代品。這些用途或其他用途取決於普通技術人員和現有技術，其中的描述僅僅是為了說明目的，但不做為限制。本文所使用的術語「乏氮介質」或「乏氮培養基」，是指培養基中包含沒有添加含任何形式氮的化合物(例如，硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨、等)。在一個實施例中，該乏氮介質含有O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，約O. 2-2暈升/升的A5微量兀素。本文所使用的術語「乏磷介質」或「乏磷培養基」，指的是培養基中包含沒有添加含有任何形式的磷的化合物(例如，磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、酯、亞磷酸等)。在一個實施例中，該乏磷介質包含約O. 25-2. 5克/升硝酸鈉，O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，約O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，約O. 025-0. 20克/升氯化鈣，約O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，約O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，以及約O. 2-2毫升/升的A5微量元素。本文所用的術語「A5微量元素」，是指含一種溶液，包含硼酸(約2. 86克/升)，氯化錳(約1.81克/升)，4水合硫酸鋅(約O. 222克/升)，鑰酸鈉(約O. 0177克/升)，5水合硫酸銅(約O. 07克/升)，或任何含有基本相似組分的類似用途的商業產品。當在本申請中提到一個化合物的水合物形式時，本技術領域技術人員將會明白，用相同化合物的相當量的無水形式或其他的溶劑化物(包括水合物)形式也可以用以代替水合物形式，因為它們將能夠達到大致相同的目的，並提供大致相同的結果。因此，無水形式、水合物形式，和其它的溶劑化物形式，可以被認為是功能等同物，都包含在本發明中。本發明將通過下列非限制性實施例進一步說明。
實施例 實施例1
收集和提純綠藻帕米爾綠球藻在北卡羅萊納州福賽斯縣亞金河，使用浮遊植物網(5微米的孔徑)收集細胞。用無菌培養基洗滌後，將收集的細胞塗布在含有生長培養基的瓊脂平板上(參見圖2所示)。用螢光燈照明平板一周後，平板的細胞被轉移到使用微生物轉移環路的新的平板，。經過3次轉移，獲得無菌單克隆。鑑定一個帕米爾綠球藻單克隆，選定其進一步培育。帕米爾綠球藻細胞株的細胞形狀像橢球，在固定培養中細胞成為球形。
實施例2
培養帕米爾綠球藻物種微藻細胞
一般程序帕米爾綠球藻細胞在指數生長期分別接種到內徑為4. 5釐米，或2. 8釐米圓柱內。最大培養體積相應分別為450毫升和250毫升的圓柱容器。本次誘導油脂富集的實驗中使用的為內徑為4. 5釐米的容器，而其他類型的圓柱被用於具有不同生長特徵的實驗中。每個培養圓柱內的該培養物被施加強度為ΙΟΟμπιοΙ HT2s-1的連續光照，溫度為25°C，通氣為O. 6升/分鐘(過濾的空氣，通過微孔過濾膜，孔徑為O. 22微米)。
培養基和生長條件本發明所使用的實現帕米爾綠球藻有機體的加速增長及增加有機體內油脂含量的生長培養基中包含有以下成分濃度超過O.1 %的氯化鈉，培養基的成分包括有O. 25 2. 5克/升硝酸鈉，O. 025-1. 75克/升7水合硫酸鎂，O. 5-3. 6克/升碳酸鈉，O. 025-0. 20克/升氯化鈣，O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二鈉，O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氫二鉀，O. 2 2毫升/升A5微量元素，最終的pH值在7. 4-8. 2的範圍內。根據本發明來培養帕米爾綠球藻物種的方法包括以下步驟
A.保持帕米爾綠球藻在含有上述培養基的瓊脂平板上；B.在含有50毫升上述生長培養基的125ml燒瓶中培養上述的帕米爾綠球藻細胞株至少72小時。然後將細胞轉移到含有I升上述介質的2升燒瓶中。C.然後在含I升培養基的2升燒瓶中培養該細胞株至少24小時。D.然後在8升柱式光生物反應器中培養帕米爾綠球藻至少120小時。在
發明者豐平仲, 胡徵宇, 盧凡 申請人:美國科樂生物能源有限公司