一種固相法和液相法結合合成阿加曲班的新方法

2023-11-02 04:30:57

專利名稱：：一種固相法和液相法結合合成阿加曲班的新方法
技術領域：
：本發明涉及多肽類化合物的合成方法，尤其涉及阿加曲班的固相法和液相法結合的合成方法。
背景技術：
：阿加曲班是由日本三菱(Mitsubishi)化學研究所最早研製合成的抗血栓藥，首先被應用於臨床治療周圍動脈閉塞性疾病，然後用於治療急性腦血栓形成，以及心肌梗死溶栓的輔助治療，並用於抗凝血酶(AT)缺乏患者在進行血透時的抗凝處理。美國食品與藥品管理局(FDA)在2000年批准了史克必成(SmithKlineBeecham)和德克薩斯生物技術公司(TexasBiotechnology)的注射用抗血栓小分子藥物阿加曲班(argatroban，Novastan)應用於治療和預防血栓形成及肝素誘導的免疫性疾病——血小板減少症(HIT),以及用於對需要進行經皮冠脈介入術(PCI)病人的治療。2003年3月5日在美國中風學會第28屆國際中風大會上公布的多中心二期臨床試驗結果表明，阿加曲班在急性缺血性中風治療中的療效顯著、安全性高。2005年，天津藥物研究院藥業有限責任公司治療急性腦血栓的一種新藥"達貝-阿加曲班"已獲國家食品藥品監督管理局批准上市，這種藥是目前國內獨家生產上市的二類新藥，而且被列入"十五"國家863項目並由國家科技部頒發了國家重點新產品證書。阿加曲班化學名(2R,4R)-1-[(28)-5-(氨基亞氨甲基)氨基-1-氧代-2-[(3-甲基-1，2,3,4-四氫喹啉-8-基)磺醯胺基]戊烷]-4-甲基哌啶-2-甲酸，其結晶水合物分子結構為其化學成分是21(R)和21(S)的混合物，通常是6465:3635(US6440417;Cossy.J.,etal，Bioorganic&MedicineChemistryLetters,11(2001)，1989-1992;JournalofPharmacerticalSciences,Vol.82,No.6，672(1993)),其結構式是1Argagroban(21(R):21(S)=65:35)laX=H，Y=CH3，21-(R)-ArgatrobanlbX=CH3，Y=H，21-(S)-Argatroban己經報導的阿加曲班的合成路線都是以硝基-L-精氨酸為起始原料，以哌啶羧酸或喹啉磺醯氯縮合先後次序不同，分成兩條主要路線1、氨基保護法硝基-L-精氨酸首先與哌啶羧酸酯縮合時，稱為氨基保護法硝基-L-精氨酸的氨基用t-Boc保護、再與哌啶羧酸酯縮合、去t-Boc保護基、與喹啉磺醯氯縮合、酯水解、氫化去硝基得阿加曲班。在氨基保護法中又有兩條合成線路(1)硝基精氨酸t-Boc保護後與(2R,4R)哌啶甲酸酯縮合(CN1951916;US4258192;US4201863;JP81-15267;US6440417;特許公報平2-31055)。具體反應路線如圖2所示。(2)硝基精氨酸t-Boc保護後與反式哌啶羧酸酯縮合、分離、拆分，再與喹啉磺醯氯縮合(Ow^J:,Wal，Bioorganic&MedicineChemistryLetters,11(2001),1989-1992)。具體反應路線如圖3所示。2、非保護法硝基-L-精氨酸首先與喹啉磺醯氯縮合時，稱為非保護法硝基-L-精氨酸與喹啉磺醯氯縮合後再與哌啶羧酸酯縮合、酯水解、氫化去硝基得阿加曲班。當L-精氨酸直接與喹啉磺醯氯縮合時反應副產物多、不易分離，不適用於工業化生產(特許公報平1-35000)。硝基-L-精氨酸為原料時反應產品單一，操作簡易，適用於工業化生產(EP823430)。具體反應路線如圖4所示。在現有技術中，阿加曲班的合成均採用液相法，其問題在於，液相合成法需要大量的反應後處理工作，同時中間體和目標產物的也難以純化和分離。另外，液相法製備阿加曲班收率低。
發明內容本發明的目的是提供了一種高收率、低成本、反應條件溫和、環境汙染小、有利於實現產業化的阿加曲班固相法和液相法結合的合成工藝。為實現上述目的，本發明製備阿加曲班的方法，包括以下步驟1)由(211，411)^^111004-甲基-2-哌啶甲酸和高分子樹脂反應得到(211,411)-^^111004-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；2:^(2R,4R)-N-FmoC-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂脫保護、採用固相合成法偶聯Fmoc-精氨酸(硝基)-OH,得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；3)將Fmoc-精氨醯灘基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂脫保護，採用固相合成法偶聯3-甲基-8-喹啉磺醯氯，得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯灘基)-(211,411)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；4)3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(211,411)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂經過裂解切割反應，獲得3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸；5)3_甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(211,411)-4-甲基-2-哌啶甲酸經過催化氫化得到阿加曲班粗品；6)阿加曲班粗品經過重結晶得到阿加曲班。步驟1)所述的"反應"指高分子樹脂經過DMF或DCM浸泡，由(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和高分子樹脂在偶聯劑和有機鹼的作用下，反應得到(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂。優選在-5-l(TC的條件下反應。所述偶聯劑為DCC、EDC、DIC、BOP、PyBOP、PyAOP、TBTU、TATU、HATU、HBTU、HCTU、HOBt、HOAt和HOCt的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。所述有機鹼為N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啡啉(NMM)和2，4，6-三甲基吡啶(TMP)中的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。其中偶聯劑和有機鹼的組合試劑優選DIC、HOBt和D正A試劑組合，優選在冰浴條件下反應，偶聯劑和有機鹼的一種或上述任意組合試劑摩爾數為樹脂的1-3倍，為(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸摩爾數為樹脂的1-3倍。所述的高分子樹脂是氯樹脂或羥基樹脂，優選2-氯三苯甲基氯樹脂(即2-Chlorotritylchloride樹脂或2-氯氯樹脂)或王樹脂，取代度為0.3—1.5mmol/g，優選的取代度為0.3-0.5mmol/g。步驟2)所述"偶聯"是指在偶聯劑和有機鹼的作用下，通過固相合成法連接Fmoc-精氨酸(硝基)-OH和(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂，得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂。所述"固相合成法"特指多肽的固相合成法。本發明的固相合成法採用20%DBLK(20。/。哌啶/DMF)或NaOH/MeOH為脫保護劑，優選20%DBLK。所述偶聯劑為DCC、EDC、DIC、BOP、PyBOP、PyAOP、TBTU、TATU、HATU、HBTU、HCTU、HOBt、HOAt和HOCt的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。所述有機鹼為N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA;KN-甲基嗎啡啉(NMM)和2，4，6-三甲基吡啶(TMP)中的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合，優選DIC、HOBt和TMP或DIC、HOBt和DIEA試劑組合。步驟3)所述"偶聯"是指在偶聯劑和有機鹼的作用下，通過固相合成法連接3-甲基-8-喹啉磺醯氯和精氨醯灘基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂，得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂。所述"固相合成法"特指多肽的固相合成法。本發明的固相合成法採用20%DBLK(20。/。哌啶/DMF)或NaOH/MeOH為脫保護劑，優選20%DBLK。所述偶聯劑為DCC、EDC、DIC、BOP、PyBOP、PyAOP、TBTU、TATU、HATU、HBTU、HCTU、HOBt、HOAt和HOCt的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。所述有機鹼為N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啡啉(NMM)和2，4，6-三甲基吡啶(TMP)中的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。步驟4)所述的"裂解切割反應"是指3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(211,411)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸的過程，即通過本領域常用的"切肽反應"獲得。本發明所選取的裂解劑是由切割試劑和捕獲試劑組成，切割試劑是三氟乙酸，捕獲試劑是水、三異丙基矽垸、三乙基矽烷、苯甲硫醚、苯甲醚或1,2-乙二硫醇等試劑的一種或任意兩種或任意兩種以上的組合，優選三氟乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚和l,2-乙二硫醇的混合物優選體積比90:5:3:2，更優選三氟乙酸、水的混合物，其體積比95:5。步驟5)所述"催化氫化"優選使用Pt02催化氫化後得到阿加曲班粗品。步驟6)所述"重結晶"得到高純度阿加曲班，優選使用水和乙醇重結晶。與已有技術相比，本發明工藝具有反應操作簡單、後處理容易、原料投入少、成本低、收率高等特點，具有可觀的經濟實用價值，同時在多肽藥物合成領域具有廣泛的應用前景。圖l為本發明總的工藝流程圖圖2為t-Boc保護的硝基精氨酸與(2R,4R)哌啶甲酸酯的反應路線圖圖3為t-Boc保護的硝基精氨酸與反式哌啶羧酸酯的反應路線圖圖4為
背景技術：
的非保護法的反應路線圖具體實施例方式下面給出實施例以對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只用於對本發明作進一步的說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練人員根據本
發明內容對本發明作出的一些非本質的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。說明書和權利要求書中所使用的縮寫的含義列於下表中:tableseeoriginaldocumentpage8實施例1:(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將2-氯氯樹脂200.0g(替代度為0.5mmol/g)，加入到1000ml的圓底燒瓶中，加入DMF600ml後劇烈攪拌。冰水浴，將36.5g(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和相等摩爾比的DIC、HOBt和DIPEA加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂，檢測替代度為0.48mmol/g，收率96%。實施例2:(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備—將2-氯氯樹脂450.0g(替代度為0.8mmol/g)，加入到2000ml的圓底燒瓶中，加入DMF1000ml後劇烈攪拌。冰水浴，將262.8g(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和相等摩爾比的DIC、HOBt和DIPEA加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂，檢測替代度為0.72mmol/g，收率900/0。實施例3:(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將2-氯氯樹脂300.0g(替代度為0.3mmol/g)，加入到2000ml的圓底燒瓶中，加入DMF800ml後劇烈攪拌。冰水浴，將65.7g(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和相等摩爾比的DIC、HOBt和DIPEA加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂，檢測替代度為0.29mmol/g,收率97%。實施例4:(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂加入至1000ml圓底燒瓶中，加入20%DBLK600ml後劇烈攪拌30min。反應結束，過濾，用DMF洗漆3次，DCM洗3次，放置待用。實施例5:Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備'將(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂取1/3加入至1000ml圓底燒瓶中，加入700ml四氫呋喃劇烈攪拌。冰水浴，將45gFmoc-精氨酸(硝基)-OH和相等摩爾比的DIC、HOBt和TMP加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂，檢測替代度為0.45mmol/g，收率94%。實施例6:Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將C2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂取1/3加入至1000ml圓底燒瓶中，加入700ml四氫呋喃劇烈攪拌。冰水浴，將45gFmoc-精氨酸(硝基)-OH和相等摩爾比的DIC、HOBt加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂，檢測替代度為0.40mmol/g，收率83%。9實施例7:Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂取1/3加入至1000ml圓底燒瓶中，加入700ml四氫呋喃劇烈攪拌。冰水浴，將45gFmoc-精氨酸(硝基))-OH和相等摩爾比的TBTU、HOBt和DIEA加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂，檢測替代度為0.46mmol/g，收率95.8%。實施例8:精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂加入至1000ml圓底燒瓶中，加入20。/。DBLK600ml後劇烈攪拌30min。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，放置待用。實施例9:3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(石肖基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂的製備將精氨醯灘基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂加入至1000ml圓底燒瓶中，加入800ml二氯甲烷劇烈攪拌。冰水浴，將0.1mol3-甲基-8-喹啉磺醯氯和相等摩爾比的DIPEA加入至上述裝有樹脂的圓底燒瓶中反應2小時。反應結束，過濾，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，後用甲醇30min收縮得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯灘基)-(211,411)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂。實施例10:3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸的製備將3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-2-氯氯樹脂加入至5000ml圓底燒瓶中，冰水浴冷卻，加入800ml三氟乙酸、水的混合物(體積比95:5)反應4小時。反應結束，過濾，用8L冰乙醚沉澱、離心、洗滌、離心和乾燥，得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸16.4g，收率98%。實施例lh阿加曲班的製備-將16.4g3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸使用Pt02催化氫化後得到阿加曲班粗品，粗品使用水和乙醇重結晶得到高純度阿加曲班。總收率63%。權利要求1.一種阿加曲班的製備方法，其特徵在於包含以下步驟1)由(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和高分子樹脂反應得到(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；2)將(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂脫保護、採用固相合成法偶聯Fmoc-精氨酸(硝基)-OH，得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；3)將Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂脫保護，採用固相合成法偶聯3-甲基-8-喹啉磺醯氯，得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；4)3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂經過裂解切割反應，獲得3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸；5)3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸經過催化氫化得到阿加曲班粗品；6)阿加曲班粗品經過重結晶得到阿加曲班。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述高分子樹脂為氯樹脂或羥基樹脂。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述(211,411)-1^{111004-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂是由(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和高分子樹脂在偶聯劑和有機鹼的作用下反應得到的，所述高分子樹脂為氯樹脂或羥基樹脂。4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述(211,411)-:^^111004-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂是由(2R,4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和高分子樹脂在偶聯劑和有機鹼的作用下反應得到的，所述高分子樹脂為氯樹脂或羥基樹脂。5.如權利要求1至4任意一項所述的方法，其特徵在於所述Fmoc-精氨醯(硝基)-(211,411)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂是由(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂和Fmoc-精氨酸(硝基)-OH在偶聯劑和有機鹼的作用下反應得到的。6.如權利要求1至4任意一項所述的方法，其特徵在於所述3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(211，411)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂是由精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂和3-甲基-8-喹啉磺醯氯在偶聯劑和有機鹼的作用下反應得到的。7.如權利要求3或4任意一項所述的方法，其特徵在於所述偶聯劑為DCC、EDC、DIC、BOP、PyBOP、PyAOP、TBTU、TATU、HATU、HBTU、HCTU、HOBt、HOAt或HOCt的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。8.如權利要求3或4任意一項所述的方法，其特徵在於所述有機鹼為N,N-二異丙基乙胺、三乙胺、N-甲基嗎啡啉或2，4，6-三甲基卩比啶的一種或者任意兩種或任意兩種以上的組合。9.如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述裂解切割反應試劑由切割試劑和捕獲試劑組成，切割試劑是三氟乙酸，捕獲試劑是水、三異丙基矽烷、三乙基矽垸、苯甲硫醚、苯甲醚或1，2-乙二硫醇的一種或任意兩種或任意兩種以上的組合。10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述阿加曲班粗品是由3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R,4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸經過二氧化鉑催化氫化製得的。全文摘要本發明公開了合成阿加曲班的方法，包括以下步驟由(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸和高分子樹脂反應得到(2R，4R)-N-Fmoc-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；脫保護，固相合成法偶聯Fmoc-精氨酸(硝基)-OH，得到Fmoc-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；再脫保護，固相合成法偶聯3-甲基-8-喹啉磺醯氯，得到3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸-樹脂；所得樹脂經過裂解切割反應，獲得3-甲基-8-喹啉磺醯-精氨醯(硝基)-(2R，4R)-4-甲基-2-哌啶甲酸；經過催化氫化得到阿加曲班粗品；經過重結晶得到阿加曲班。本發明方法，適合規模化生產，操作簡易，工藝穩定，生產成本低，總收率超過60％。文檔編號C07K1/02GK101560244SQ200910106759公開日2009年10月21日申請日期2009年4月21日優先權日2009年4月21日發明者建劉,李紅玲,袁建成,馬亞平申請人:深圳市翰宇藥業有限公司