新型穿膜肽及其用途的製作方法
2023-11-01 17:23:42
專利名稱：新型穿膜肽及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，確切地說它是新型穿膜肽及其用途。
背景技術：
近年來，一些具有細胞膜穿透能力的多肽例如TAT、 MPG、 PEP-1、 penetratin、寡聚精氨 酸、寡聚賴氨酸等逐漸成為關注的焦點，它們可穿過細胞膜而細胞膜卻完好無損。這些天然 的或人工合成的多肽具有水溶性、低裂解性並通過非吞噬作用進入各種細胞膜，稱之為穿膜 肽(cell—permeable peptides, CPP)，穿膜肽最早發現於全鏈蛋白質的跨膜轉運，故又稱蛋白 轉導域(protein transduction domain, PTD)。穿膜肽對生物大分子的轉運效率非常高，不耗能， 穿膜肽的穿膜機制目前還不完全清楚，但是這些穿膜肽在穿膜效率上非常相近，它們共同的 特點是胺基酸序列對其穿膜功能非常重要。在穿膜肽的毒性情況方面，寡聚精氨酸、寡聚賴 氨酸等沒有發現有任何毒性或不良反應；MAP 、 transportan 10 、 penetratin等對細胞膜有輕 微毒性；而TAT、 pAntp(43-58), pTAT(48~60)、 pVEC(615"632)等對細胞膜基本無毒性。穿膜 肽可以通過共價鍵或非共價鍵偶合等方式攜帶各種生物大分子透過細胞膜，已經實驗證實的 這些生物大分子有基因、多肽、蛋白質、納米顆粒和脂質體等。(lain Prochiantz. Protein and peptide transduction, twenty years later a happy birthday [J].Adv Drug Deliv Rev, 2008 M ar l;60(4-5):448-51.)
在巳有的穿膜肽轉運研究中，天然穿膜肽及其衍生的人工合成肽在攜帶外源大分子進入
細胞時必須與目的大分子以共價鍵相連。相比較而言，人工合成的MPG、 PEP-1等兩親性穿
膜肽能夠以非共價鍵攜帶蛋白質透過細胞膜，但這些穿膜肽由於結構複雜，合成、提純、大
量生產非常困難。
發明內容
本發明的目的旨在提供新型穿膜肽及其用途。
本發明所述的新型穿膜肽，其特徵是具有細胞膜穿透能力；每個肽由三部分組成可 以表示為X—Y—Z， X代表6-9個連續的精氨酸殘基組成的鹼性胺基酸簇，Y代表0-1個穀氨 酸殘基，Z代表l-2個色氨酸殘基，鹼性胺基酸簇既可以位於C端，也可位於N端。
本發明所述的穿膜肽的各種藥用鹽如鹽酸鹽、檸檬酸鹽等在本發明的保護範圍之內。 本發明所述的穿膜肽中的任何一個或多個直至全部胺基酸殘基可以被其對應體D型氨基
酸取代，取代後的多肽序列在本發明的保護範圍之內。
本發明所述的穿膜肽可以採用固相多肽合成法或液相多肽合成法進行合成。
本發明所述的穿膜肽的用途在於參與攜帶生理活性物質或檢測試劑穿透細胞膜。生理活性物質包括生物技術藥物、化學藥物、中藥、DNA、 RNA、 siRNA、 miRNA、正RNA、反義RNA、 疫苗、寡糖、多糖等。檢測試劑包括各種用於生物體內檢查的試劑。
含有本發明所述的穿膜肽的藥物組合物都在本發明的保護範圍之內，含有本發明所述的
穿膜肽的藥物組合物可以是片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、注射劑、緩釋製劑、控釋製劑及
各種微粒給藥系統。
含有本發明所述的穿膜肽的胰島素製劑在本發明的保護範圍之內。在PH6-10的條件下， 本發明所述的穿膜肽荷正電，可以和荷負電的胰島素在適當的溶劑中通過電荷作用形成複合 物，複合物可以進一步製備成各種製劑，其口服腸溶製劑等都在本發明的保護範圍之內。
本發明的有益成果在於提供了一組結構較為簡單、合成相對容易、穿膜效率較高的新型 穿膜肽。
以下通過非限定性實施例進一步詳細說明本發明。 實施例1
以RRRRRREW (R在C端)為例，說明採用固相法合成多肽的方法
在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入lgRinkamide-MBHA樹脂(O. 74 mmolN/g)，加20 mL DMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然後加入20 mL 20X哌啶/DMF溶液， 攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 1. 44g(2. 22mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf為2， 2， 4， 6， 7_五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯基)、 0. 46g (2. 22mmo1) 二環己基碳二亞胺和0. 30g (2. 22ramo1)} HOBt (1-羥基苯並三唑)和20 mLDMF， 室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時後取少量樹脂進行茚三酮顯色試驗，結果表明縮合反 應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的第一個(保護的)胺基酸已聯 接於樹脂上。後面接著聯接由C端起的第二個至最後一個(保護的)胺基酸，反應步驟重複上 面的操作，即從用20X哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗後用DMF洗滌止。如果 茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有胺基酸的a-氨基都用 Fmoc保護，胺基酸依次為Fmoc-Arg(Pbf)-0H、 Fmoc-Arg (Pbf) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf) -0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-0H、 Fmoc-Glu(0But)-OH、 Fmoc-Trp (Boc) -0H。最後樹脂 用甲醇洗滌三次，真空乾燥。
將上述己接肽的樹脂加入到50 mL圓底燒瓶中，加入15ml試劑K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯 酚/水=87. 5/5/2. 5/2. 5/2. 5 (v/v))，室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗 三次樹脂。合併濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉澱多 肽，放入冰箱中過夜。離心，除去乙醚，真空乾燥，得到RRRRRREW粗肽。
將100mg上述的RRRRRREW粗肽溶於2ml純水中，用製備型反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得RRRRRREW純肽。純肽的質譜表明，其分子量為 1270，與計算值相符。 實施例2
以RRRRRREW (R在C端)、RRRRRREW (R在N端)、RRRRRREWW (R在C端)、RRRRRREWW (R 在N端)、RRRRRRW (R在C端)、RRRRRRW (R在N端)為例與經典穿膜肽RRRRRRRRR比較，說 明本發明合成多肽的穿膜活性。
RRRRRREW、 RRRRRREWW、 RRRRRRW為本實驗室採用固相法合成，RRRRRRRRR購自AnaSpec公 司；N端均標記FITC螢光素。
ECV—304培養於RPMI 1640培養基中，含10 %的小牛血清、各100 mg/ L的氨苄青黴素 和鏈黴素。在37 °C，5%C02 ，完全飽和溼度下正常培養，每3d傳代一次。
取六孔板，加入蓋玻片，接種ECV—304細胞，密度為2X 105個/ L，培養過夜，在細胞貼壁 後，更換新鮮培養液,30 miri後，去掉培養液,更換含有一定濃度穿膜肽的1640培養基(無血清， 無雙抗)lmL。細胞與肽段孵化一定時間後，去掉培養液,細胞用PBS洗3次,用3. 7%的多聚甲 醛固定液(PBS配製)在室溫下固定細胞5 min ,再用PBS洗3次。50%的甘油(PBS配製)封 片後，在螢光顯微鏡下觀察。採用Image — Pro Plus (Version 4.5 for WindowsTM)來分析 細胞螢光強度。
結果RRRRRREW (R在C端)、RRRRRREW (R在N端)、RRRRRREWW (R在C端)、RRRRRREWW (R在N端)、RRRRRRW (R在C端)、RRRRRRW (R在N端)、RRRRRRRRR均能有效進入細胞， RRRRRREWW (R在C端)、RRRRRREWW (R在N端)進入細胞最多，其次是RRRRRREW (R在C端)、 RRRRRREW (R在N端)、RRRRRRW (R在C端)、RRRRRRW (R在N端)，RRRRRRRRR進入細胞的最 少。
實施例3
RRRRRREWW (R在C端)遞送的胰島素腸溶給藥系統
10mg胰島素(效價為29.3IU/mg，下同)用少量稀鹽酸溶解，加入2 mLPBS緩衝液，冷
凍乾燥，加入適量稀釋劑，分裝入大鼠用腸溶膠囊。
IOO呢RRRRRREWW加入2mL PBS緩衝液中，冷凍乾燥，分裝入大鼠用腸溶膠囊。 lOmg胰島素用少量稀鹽酸溶解，加入2mLPBS緩衝液和lOOmg RRRRRREWW,冷凍乾燥，分
裝入大鼠用腸溶膠囊。
將SD糖尿病大鼠隨即分成3組，每組6隻，給藥前禁食12 h ，第一組為胰島素對照組， 口服給予胰島素腸溶膠囊(劑量為20IU/Kg);第二組為RRRRRREW對照組，口服給予RRRRRREWW 腸溶膠囊(劑量為20 mg/Kg);第三組RRRRRREWW遞送的胰島素腸溶膠囊組(劑量為20 IU/Kg)。於給藥後0， 0. 5， 1 ， 2， 3， 4, 5, 6小時於眼角靜脈叢取血，血糖儀(穩捷基礎倍加型，美國強生 公司)測定血糖含量。各組的降糖效應如圖1所示，實驗表明RRRRRREWW遞送的胰島素腸溶膠 囊有顯著的降血糖作用，胰島素對照組和RRRRRRE沐對照組均無降血糖作用。
圖1是糖尿病大鼠口服RRRRRREWW遞送的胰島素腸溶膠囊降糖效應曲線圖。序列表
中國藥科大學 新型穿膜肽及其用途
32
Patentln version 3.3
1
8
PRT 人工序列
穿膜肽
1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Trp 1 5
2
9
PRT 人工序列
穿膜肽 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Tip 1 5
3
10
PRT 人工序列
穿膜肽
3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Trp 1 5 10
4
11
PRT 人工序列
穿膜肽
4
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Trp 1 5 10
5
8 PRT 人工序列
穿膜肽 5
Trp Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
6
9
PRT 人工序列
穿膜肽 <400〉 6
Trp Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
7 10
PRT 人工序列
穿膜肽 7
Trp Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
8
11
PRT 人工序列
穿膜肽
8
Trp Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
9
9
PRT 人工序列
<220〉
穿膜肽
9
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Tip Tip 1 5
10
10 PRT 人工序列
穿膜肽
10
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Trp Trp 1 5 10
11
11
PRT 人工序列
穿膜肽
11
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Trp Tip 1 5 10
12
T2
PRT 人工序列
穿膜肽 12
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Trp Trp 1 5 10
13
9
PRT
人工序列
穿膜肽
13
Trp Trp Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210〉 14
10
PRT 人工序列
穿膜肽
14
Trp Trp Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
15
11formula see original document page 13 17
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Tip 1 5
18
9
PRT 人工序列
穿膜肽
18
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Trp 1 5
19
10
PRT 人工序列
穿膜肽
19
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Trp 1 5 10
20
11 PRT 人工序列
穿膜肽
20
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Tip Trp 1 5 10
21
8
PRT 人工序列
穿膜肽
21
Trp Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
22
9
PRT 人工序列
穿膜肽 22
Trp Tip Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
23
10
PRT 人工序列
穿膜肽
23
Trp Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
24
11
PRT 人工序列
穿膜肽
24
Trp Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
25
7 PRT 人工序列
穿膜肽
25
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp 1 5
26
8
PRT 人工序列
穿膜肽
26
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Tip 1 5
27
9
PRT 人工序列
穿膜肽 27
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp 1 5
28
10
PRT 人工序列
穿膜肽
28
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp 1 5 10
29
7
PRT 人工序列
穿膜肽
29
Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
30
8 PRT 人工序列
穿膜肽
30
Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
31
9
PRT 人工序列
穿膜肽
31
Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
32
10
PRT 人工序列
穿膜肽 32
Tip Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
權利要求
1. 一組新型穿膜肽，其特徵是具有細胞膜穿透能力；每個肽由三部分組成可以表示為X—Y—Z，X代表6-9個連續的精氨酸殘基組成的鹼性胺基酸簇，Y代表0-1個穀氨酸殘基，Z代表1-2個色氨酸殘基，鹼性胺基酸簇既可以位於C端，也可位於N端。
2. 根據權利要求1所述的穿膜肽，其特徵是根據權利要求1所述的穿膜肽的藥用鹽類。
3. 根據權利要求1所述的穿膜肽，其特徵在於所述的穿膜肽中的任何一個或多個直至全部氨 基酸殘基可以被其對應體D型胺基酸取代。
4. 根據權利要求1所述的穿膜肽，其特徵在於穿膜肽具有序列表中所列的胺基酸序列。
5. 根據權利要求l所述的穿膜肽，其可以採用固相多肽合成法或液相多肽合成法進行合成。
6. 權利要求1—4所述的穿膜肽的用途，其特徵在於所述的穿膜肽參與攜帶生理活性物質或 檢測試劑穿透細胞膜。
7. 根據權利要求1一4所述的穿膜肽的用途，其特徵在於是一種含有權利要求1-4所述的穿 膜肽的藥物組合物。
8. 根據權利要求7所述的藥物組合物，包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、注射劑、緩釋制 劑、控釋製劑、乾粉吸入劑及各種微粒給藥系統。
9. 根據權利要求8所述的藥物組合物，是含有權利要求l-4所述的穿膜肽的胰島素製劑。
10. 根據權利要求9所述的藥物組合物，是含有權利要求1-4所述的穿膜肽的胰島素的口服 腸溶製劑。
全文摘要
本發明是一組新型穿膜肽，其特徵是具有細胞膜穿透能力；每個肽由三部分組成可以表示為X-Y-Z，X代表6-9個連續的精氨酸殘基組成的鹼性胺基酸簇，Y代表0-1個穀氨酸殘基，Z代表1-2個色氨酸殘基，鹼性胺基酸簇既可以位於C端，也可位於N端。穿膜肽的用途在於參與攜帶生理活性物質或檢測試劑穿透細胞膜。
文檔編號A61K9/14GK101412747SQ200810155949
公開日2009年4月22日 申請日期2008年10月21日 優先權日2008年10月21日
發明者呂慧俠, 周建平, 磊 張, 張振海 申請人:中國藥科大學