基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測方法及試劑與流程

2023-11-02 05:45:17 3

本發明涉及一種用於檢測深部真菌的方法，具體的說是一種基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測方法。本發明還涉及一種基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測試劑。
背景技術：
：隨著近些年來環境汙染的不斷惡化，真菌感染人群也在不斷擴大。真菌感染者由以往的繼發感染人群，發展為目前的原發性真菌感染「正常」人群(由環境、職業、過勞等因素誘發)。此外，伴有基礎疾病的患者和老年人，如糖尿病患者均為真菌感染的易感人群，現代介入技術及外科手術治療的廣泛應用也給真菌感染創造了條件。目前，檢測深部真菌有以下四種方法：體液直接塗片形態學檢測、血清學檢測、病原菌基因檢測以及病理學檢測。體液直接塗片形態學檢測為目前主要的深部真菌檢測的方法，主要依靠可獲得的體液或分泌物塗片檢測及培養鑑定，但由於所獲得的體液或分泌物來源於與外界相通的內體表(即管腔黏膜)，無法與空氣隔離，易於汙染，導致其檢測結果特異性差，不能反映深部感染真實情況，且真菌培養耗時長，一般需要2周以上，培養的陽性率極低，不能快速檢測而便於後續的臨床搶先治療。血清學檢測包括血清半乳甘露聚糖檢測(簡稱gm試驗)和1，3β-d-葡聚糖檢測(簡稱g試驗)，其目前已應用於臨床深部真菌感染與否的檢測及治療反應的監測，為臨床抗真菌的搶先治療提供了快速有效的依據，但由於其應用受多種因素的影響，容易出現假陽性，且敏感度和檢測菌種的覆蓋面有限，以及受到醫院條件和患者經濟條件的限制，使真菌深部感染的檢測困難。病原菌基因學檢測亦受多種因素的影響，因其假陽性率高，不能作為確診的金標準。病理學檢測則往往需要創傷性手段取材致使臨床上極少採用。技術實現要素：本發明的第一目的是為了克服
背景技術：
的不足之處，而提供一種基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測方法。本發明的第二目的是為了克服
背景技術：
的不足之處，而提供一種基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測試劑。為了實現上述目的，本發明的技術方案為：基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測方法，其特徵在於：它包括如下步驟，步驟一：無菌處理檢測深部真菌所需的器具，並無菌保存檢測所需的器具；步驟二：用1-2ml規格注射器取被檢測者肘靜脈血約1毫升；步驟三：先在無菌環境中將一滴未凝固的靜脈血滴入盛有0.8ml檢測試劑的安瓿瓶中，然後輕搖安瓿瓶直至靜脈血在安瓿瓶內呈均勻分布，最後將安瓿瓶靜置20分鐘，使芝加哥天藍對靜脈血進行染色；其中，0.8ml檢測試劑的製備方法為：先將0.8-1.5克芝加哥天藍粉劑溶入100ml無菌生理鹽水中，然後將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液經一次性針頭濾器過濾消毒，接著將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液放入到經過無菌處理的安瓿瓶中，最後將帶有芝加哥天藍的無菌生理鹽水以每安瓿0.8ml分裝於規格為5ml的安瓿瓶中備用；步驟四：對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理；其中，對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式可以為如下兩種中的一種，其中，第一種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：先在75％酒精溶液中將載玻片和蓋玻片浸泡3個小時以上，然後在製片時用酒精燈對載玻片和蓋玻片進行燃燒消毒，接著將載玻片和蓋玻片放置於直徑大於100mm的無菌密封容器中進行冷卻，直至染色完成；第二種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：將載玻片和蓋玻片直接放置在超淨臺中進行紫外線消毒並無菌保存，直至染色完成；步驟五：用1ml規格的一次性無菌注射器或無菌滴管吸取安瓿內已染色的混合液，在無菌條件下將一滴經過染色的混合液滴於步驟四中的載玻片上，蓋上蓋玻片；步驟六：當蓋上蓋玻片後，工作人員先依次通過4倍物鏡、10倍物鏡、40倍物鏡及100倍油鏡對載玻片上的混合液進行觀察，再由500萬以上像素的目鏡放大，然後用高解析度顯像軟體將載玻片上的混合液的圖像顯示於電腦屏幕，最後工作人員在電腦上對載玻片上的混合液進行觀察記錄。為了實現上述第二目的，本發明的技術方案為：基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測試劑，它由芝加哥天藍粉劑和無菌生理鹽水混合而成，所述芝加哥天藍粉劑與無菌生理鹽水的重量比為(0.8～1.5):100。在上述技術方案中，它由芝加哥天藍粉劑和無菌生理鹽水混合而成，所述芝加哥天藍粉劑與無菌生理鹽水的重量比為1:100。現有的用於檢測深部真菌的方法均有缺陷，而真菌為真核細胞，形態學檢測是真菌的主要檢測方法，目前缺乏特異性高的針對深部真菌的形態學檢測的有效方法，其原因為：①傳統的臨床思維缺乏對真菌從外界侵入人體深部的過程中必血液感染這一過程的認識，認為要在血液中找到真菌如同大海撈針，從而忽略了對血液深部真菌形態學檢測的研究。②血培養真菌陽性率極低，也是長期以來臨床上忽略深部真菌感染菌血症過程的原因，加深了血液中能找到真菌的可能性極低的固有思維。③現有的血液及體液的細胞形態學檢測為外周血或體液塗片染色後靜態的細胞形態學檢測，其檢測範圍僅限於有限的正常或病態血細胞(如白血病細胞等)和少量微生物(如瘧原蟲及組織胞漿菌等)。也由於深部真菌感染的培養陽性率極低，不能與現有的靜態細胞塗片形態學方法中所見的細胞與相關結構互相對應，導致顯微鏡下的形態學鑑別的困難。④現有的細胞學檢測的塗片方法為非無菌操作，塗片汙染不可避免，也使得塗片檢測真菌結果可信度不高。⑤更重要的是，本發明者在長期的對深部真菌感染的研究過程中發現，真菌感染的發生率比現有臨床所認識的發生率高得多，觀察血液中活體細胞能非常容易而清晰地發現和鑑別真菌實體及相關結構，如菌絲、子孢子及菌團。但由於真菌實體的構成成分與人體的正常細胞(如紅細胞和血小板)的構成成分相似，導致現有的細胞學塗片檢測中所用的染色方法在靜態細胞檢測中不能區分真菌實體與人類的正常細胞(紅細胞及血小板)，這也是現有臨床上忽略真菌感染，導致深部真菌感染檢測困難的重要原因之一。與現有技術相比，本發明的有益效果如下：1、與現有的各類真菌檢測方法相比，本發明所需的檢測時間短，準確率高，細胞及其相關結構輪廓清晰，色澤深淺有別，可清晰的顯示菌絲及孢子，紅細胞表面的棘刺等，是一種簡單、快捷、有效的真菌形態學檢測方法，可推廣至基層醫院。2、本發明即針對深部真菌感染，通過對感染血液和體液中真菌菌絲的特異性對比染色，動態檢測血液及體液中活體真菌實體及其相關結構(菌絲和孢子)。3、由於本發明能夠快速準確的幫助臨床醫生判斷被檢測者是否感染深部真菌，且由於現有的深部真菌檢測方法中尚缺乏血液形態學的快速檢測，而深部侵襲性真菌感染具有較高的死亡率(12小時內即行抗真菌治療的死亡率為11％，而超過12小時開始抗真菌治療的死亡率為33％)，故本發明具有良好的社會效益和市場前行。4、本發明可以使工作人員在計算機輔助設備(高解析度電子照相設備)的支持下，通過顯微鏡清晰地觀察到肉眼難以觀察到血液中各種有形成分，可為臨床精準快治療提供可靠的判斷依據。其中，上述血液中各種有形成分不僅包括正常和病理狀態下的人血細胞及其功能狀態，異形真核微生物細胞，還包括肉眼不可視的各種形態和性質的導致血液循環障礙的成分，如血栓、菌栓、漂浮菌絲(團)以及各種附壁結構(如附壁菌絲、芽生孢子等)。由於是無菌操作，因此能客觀地反映體內深部真菌感染的真實情況。5、由於本發明可在顯微鏡下發現肉眼不可見的微小菌栓，可在發現肉眼可視的附壁栓子之前快速檢測可導致微循環障礙的微小菌栓或血栓。同時，本發明還可應用於獻血者的快速篩選以及輸血前血液的檢測，快速發現所輸血液中真菌孢子及菌絲的情況。附圖說明圖1為本發明的流程圖。圖2為某正常人的血液(不含真菌)經過芝加哥天藍染色後的圖像。圖3為菌絲未被染色時的圖像。圖4為菌絲經過芝加哥天藍染色後的圖像。圖5為採用體液培養直接塗片形態學檢測的方式檢測真菌時，樣本經過2周的培養後在顯微鏡下的圖像。圖6為在採用與圖5中同樣的體液樣本後，同一被檢測者經過本發明所述的檢測方法進行檢測後的圖像。圖7為某個被確定為血液中含有真菌的被檢測者，經過本發明對其血液樣本檢測後的圖像。圖8為採用半乳糖甘露醇聚糖抗原檢測(gm試驗)的方式檢測真菌時的圖像。圖9為在採用與圖8同樣的體液樣本後，同一被檢測者經過本發明所述的檢測方法進行檢測後的圖像。圖10為採用本發明所述的檢測方法檢測胸水中是否有真菌的圖像。圖11為採用本發明所述的檢測方法檢測腦脊液中是否有真菌的圖像。圖12為激惹白細胞的圖像。圖中1-正常紅細胞，2-正常白細胞，3-正常血小板，4-菌絲，5-異常紅細胞，6-孢子及子孢子，7-激惹白細胞，8-纖維滲出物，9-晶體。具體實施方式下面結合附圖詳細說明本發明的實施情況，但它們並不構成對本發明的限定，僅作舉例而已。同時通過說明使本發明的優點更加清楚和容易理解。參閱附圖可知：基於對比染色的深部真菌形態學快速檢測方法，其特徵在於：它包括如下步驟，步驟一：無菌處理檢測深部真菌所需的器具，並無菌保存檢測所需的器具；步驟二：用1-2ml規格注射器取被檢測者肘靜脈血約1毫升；步驟三：先在無菌環境中將一滴未凝固的靜脈血滴入盛有0.8ml檢測試劑的安瓿瓶中(稀釋15倍)，然後輕搖安瓿瓶直至靜脈血在安瓿瓶內呈均勻分布，最後將安瓿瓶靜置20分鐘，使芝加哥天藍對靜脈血進行染色；其中，0.8ml檢測試劑的製備方法為：先將0.8-1.5克芝加哥天藍粉劑溶入100ml無菌生理鹽水中，然後將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液經一次性針頭濾器過濾消毒，接著將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液放入到經過無菌處理的安瓿瓶中，最後將帶有芝加哥天藍的無菌生理鹽水以每安瓿0.8ml分裝於規格為5ml的安瓿瓶中備用；步驟四：對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理；其中，對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式可以為如下兩種中的一種，其中，第一種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：先在75％酒精溶液中將載玻片和蓋玻片浸泡3個小時以上，然後在製片時用酒精燈對載玻片和蓋玻片進行燃燒消毒，接著將載玻片和蓋玻片放置於直徑大於100mm的無菌密封容器中進行冷卻，直至染色完成；第二種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：將載玻片和蓋玻片直接放置在超淨臺中進行紫外線消毒並無菌保存，直至染色完成；步驟五：用1ml規格的一次性無菌注射器或無菌滴管吸取安瓿內已染色的混合液，在無菌條件下將一滴經過染色的混合液滴於步驟四中的載玻片上，蓋上蓋玻片；步驟六：當蓋上蓋玻片後，工作人員先依次通過4倍物鏡、10倍物鏡、40倍物鏡及100倍油鏡對載玻片上的混合液進行觀察，再由500萬以上像素的目鏡放大，然後用高解析度顯像軟體將載玻片上的混合液的圖像顯示於電腦屏幕，最後工作人員在電腦上對載玻片上的混合液進行觀察記錄。優選的，它由芝加哥天藍和無菌生理鹽水混合而成，所述芝加哥天藍與無菌生理鹽水的重量比為(0.8～1.5):100。優選的，芝加哥天藍與無菌生理鹽水的重量比為1:100。根據圖2、圖6和圖7的對比可知，血液中的正常血紅細胞和異常紅細胞在經過芝加哥天藍染色後，其形態特徵差異明顯，工作人員可以根據細胞的形態很方便快速的分辨判斷出血液中是否含有真菌或孢子。根據圖3與圖4的對比可知，經過染色後的菌絲與沒有經過染色的菌絲在顯微鏡下的差別很明顯，工作人員可以根據顯微鏡下看到的結果，不僅可以很快的判斷出被檢測者的血液中是否含有真菌，也可以初步的判斷被檢測者的血液中細菌的大致數量。根據圖5、圖6、圖8和圖9的對比可知，本發明所述的用於檢測真菌的方法是有效的，能夠用於檢測血液中是否含有真菌。同時，由於本發明所述的方法只需要約20分鐘的的染色時間就可準確的判斷出被檢測的體液是否含有真菌，因此，本發明所述的真菌檢測方法與現有的各類檢測方法相比，本發明能夠明顯的縮短檢測時間和檢測成本，並提高檢測精度，具有良好的社會價值和市場價值。根據圖7的描述可知，本發明所述的真菌檢測方法是能夠在真菌感染者體內清晰的檢測到真菌的，因此，本發明所述的真菌檢測方法是有效的，值得推廣的。根據圖9、圖10、圖11和圖12的描述可知，本發明所述的方法可以被廣泛的用於檢測真菌，不僅可以用於檢測血液中是否含有真菌，而且還可以用於檢測其它液體(如胸水、腦脊液)中是否含有真菌，同時，本發明所述的方法還可以用於做其它的實驗(如圖12中所示的白細胞激惹實驗)。為了能夠更加清楚的說明本發明的特點，並進一步的說明經過芝加哥天藍染色後的樣本與沒有經過芝加哥天藍染色後的樣本之間的區別，發明人對同一樣本進行了是否染色的對比實現，其對比結果如下：表1.芝加哥天藍對比染色與非對比染色血片的區別：非對比染色芝加哥天藍對比染色細胞顏色均勻一致，與紅細胞色澤一致細胞輪廓清晰，色澤深淺有別菌絲無顯示可現實清晰的菌絲及孢子孢子不能顯示散在玻片底部的子孢子能清晰顯示散在玻片底部的子孢子受染細胞不可現示受染白細胞可現示受染白細胞紅細胞不顯示紅細胞表面的棘刺清晰顯示紅細胞表面的棘刺其他不能顯示玻片底部可染色的結構可對比顯示玻片底部可染色的結構其它未說明的部分均屬於現有技術。當前第1頁12