一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法

2023-11-02 06:10:22 3

專利名稱：一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法
一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法技術領域
本發明屬分子生物學領域，涉及一種血管生長抑制劑的製備方法，尤其涉及一 種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法。
背景技術：
全世界每年約有500萬人死於腫瘤。早在20世紀70年代，Folkman就提出， 腫瘤生長是血管依賴性的。血管的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長 階段到有血管的快速生長階段。血管的生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養物質，是促成上 述轉變的關鍵環節。血管的生成主要依賴於血管生成刺激劑和抑制劑的調節，內源性的 血管生成刺激劑的下調和血管生成抑制劑的上調，引起血管生成平衡失調，可能是血管 生長抑制劑抑制血管活性的機制。
在此之前，在腫瘤治療領域一直佔主導地位的策略是直接殺傷腫瘤細胞，即先 進行腫瘤切除手術或通過放療使原發瘤消退，然後再進行放化療，以消除體內殘留的癌 細胞。這種策略的缺點是特異性不高，對病人的副作用太大，甚至有時會加速病人的死 亡。而且癌細胞反覆暴露於化療下會產生抗藥性，嚴重影響治療的效果。因此，很多腫 瘤專家的注意力就從腫瘤細胞本身轉移到總體腫瘤組織，尤其是血管的生成過程。
以腫瘤組織血管為靶標與直接針對腫瘤細胞本身相比有兩個顯著的優點首 先，由於許多固體瘤(或許還有某些白血病)是血管生成依賴的，因而這種方法不必為 某種特定的腫瘤而制定特定的治療方案；其次，抗血管生成藥物只是阻止新生血管的生 長，不攻擊健康血管，理論上對正常血管無害並且不產生抗藥性。正常成年人體內新生 血管的生成處於相對靜息的狀態，只有0.01%左右的內皮細胞處於分裂期，而腫瘤血管 處於分裂周期的內皮細胞比例要高出2-3個數量級。因此，抑制內皮細胞增殖對正常組 織影響非常小。
有人從荷瘤的小鼠尿液和血清中分離到血管抑素，它與人纖維蛋白溶酶原 Kringle 1-4區有高度的同源性。隨後有實驗證明血管抑素能特異性的抑制血管內皮細胞 的增殖，也可以抑制原發瘤以及轉移瘤組織中的血管生成。
人纖維蛋白溶酶原是一種含有5個Kringle結構域和一個絲氨酸蛋白酶的分泌性 糖蛋白，每個Kringle環由76-80個胺基酸組成。1996年Cao等人比較了血管抑素中各個 Kringle區的抗血管增生活性後發現，每個獨立的Kringle片段都能不同程度地抑制內皮細 胞增殖。Kringle 1、Kringle 2和Kringle 3具有較強的抑制活性而Kringle 4僅僅具有很低 的抑制活性，Kringle 1和Kringle 3的抑制活性要強於Kringle 2，而單獨的Kringle 5片段 抗血管增殖活性最強，它是目前所知道的抑制內皮細胞增殖和遷移最有效的纖維蛋白溶 酶原片段，也是目前國際上研究和開發的最具前途的腫瘤血管生長抑制劑。血管生長抑 製劑Kringle 5被認為是目前抑制血管內皮細胞增殖和遷移活性最強的纖溶酶原片段。但 目前血管生長抑制劑Kringle 5製備工藝複雜，表達效率低下。

發明內容
為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發明提供了一種高活性可溶型血 管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法。本發明的技術解決方案是本發明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑 Kringle 5三聚體的高效表達方法，其特殊之處在於所述高活性可溶型血管生長抑制劑 Kringle 5三聚體的高效表達方法包括以下步驟1)製備Kringle 5基因的上遊引物、Kringle 5基因的下遊引物、pET15b質粒 DNA以及感受態細胞BL21 (DE3)plys ；所述Kringle 5基因的上遊引物含有Nco I酶切位 點；所述Kringle 5基因的下遊引物含有Xho I酶切位點；2)根據步驟1)所得到的Kringle 5基因的上遊引物以及Kringle 5基因的下遊引 物對Kringle 5基因進行PCR擴增，獲取PCR擴增產物；3)利用限制性內切酶分別對步驟2)所得到的PCR擴增產物以及pET15b質粒進 行雙酶切，分別得到PCR擴增產物經酶切後的產物以及pET15b質粒經酶切後的產物；所 述限制性內切酶是Nco I酶以及Xho I酶；4)利用T4 DNA連接酶對步驟3)中所得到的PCR擴增產物經酶切後的產物以及 pET15b質粒經酶切後的產物進行酶連接，得到重組質粒pET15b/K5 ；5)將步驟4)獲取得到的重組質粒pET15b/K5轉化至感受態細胞BL21 (DE3)plys 中培養並進行保存；6)對步驟5)中已經轉化至感受態細胞BL21 (DE3) plys中的重組質粒進行低溫誘
導表達。上述步驟1)中，所述Kringle 5基因的上遊弓丨物是 ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG,其中，CCATGG是Nco I酶切位點所述 Kringle 5 基因的下遊引物是 ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG,其中， CTCGAG是Xho I酶切位點。上述步驟2)中對Kringle 5基因進行PCR擴增的反應體系是Kringle 5基因的上 遊引物和Kringle 5基因的下遊引物各1 μ 1，模板1 μ 1，Taq酶25 μ 1，加無菌水至50 μ 1 ； PCR擴增的反應條件是95°C5min預變性；95°C30s變性，55°C30s退火，72°C 30s延 伸，30個循環;72°C7min延伸。上述步驟3)中利用限制性內切酶對PCR擴增產物進行雙酶切的反應體系是 Nocllyl，Xho I 1 μ 1, IOXM Buffer 4 μ 1，PCR 產物 10 μ 1，BSA 0.4 μ 1，加無菌水至 40μ1 ；酶切溫度37°C，時間2h;利用限制性內切酶對pET15b質粒進行雙酶切的反應體系是Noc I 1 μ 1，Xho I Ιμ , IOXMBuffer 4 μ 1，pET15b 20 μ 1, BSA 0.4 μ 1，加無菌水至 40μ1;酶切溫度
37°C,時間 2h。上述步驟4)中對PCR擴增產物經酶切後的產物以及pET15b質粒經酶切後的 產物進行酶連接的反應體系是pET15b質粒ΙΟμΙ，Kringle 5片段2 μ 1，10XT4DNA Ligase Buffer 2 μ 1，T4DNALigase 1 μ 1，加無菌水到 20 μ 1 ；反應條件是16°C保溫過夜，-20°C保存備用。
上述步驟幻中的具體實現方式是將IOyL連接產物加到200yL感受態細 胞BL21(DE3)plys的懸液中，混勻，冰浴30_40min，42°C水浴保溫90s，立即置冰上 3min,加入790 μ ILB培養基，180rpm，37°C震蕩培養60min，然後吸取200 μ 1培養液轉移到加有抗生素氨苄的培養基上進行培養。
上述步驟6)的具體實現方式是選取轉化後培養出的單菌落至含有5ml培養液 的試管中，30°C 220rpm振蕩過夜；吸取50 μ 1培養物以1 100接種於含100 μ g/ml氨卞 的5ml LB培養基中，30°C 220rpm振蕩3小時，加入誘導劑IPTG，使其終濃度為ImM， 再於30°C 220rpm振蕩4小時；離心收集菌體，用200 μ 1 O.lMTris-HCl重懸菌體並洗滌， 於5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，所述200 μ 1 0.IMTris-HCl的ρΗ是8.0。
上述步驟5)中感受態細胞BL21 (DE3)plys的製備方法是
冰冷的CaCl2溶液的製備O.lmol/L CaCl2溶液，使用一次性濾器過濾除菌 後，-4°C冰箱存儲備用；0.05mol/L CaCl2甘油溶液30%的甘油+0.1M CaCl2 ；使用一 次性濾器過濾除菌後，_4°C冰箱保存備用；
無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5ml LB液體培養基中，37°C培養 過夜；第二天，倒入250ml的LB液體培養基中，37°C振蕩3.5_4.0h，當LB液體培養基的 OD600值介於0.4-0.6時停止培養；將培養液分裝到8個25ml預冷無菌的聚丙烯管中，於 冰上置5-10分鐘，然後4°C，8000rmp離心8min ；細胞沉澱用IOml冰冷的CaCl2溶液重 懸，4°C 6000rmp離心5分鐘；棄上清後，加入IOml冰冷的CaCl2溶液重懸細胞，冰浴半 小時後，4°C，6000rmp離心5分鐘；棄上清後，加入2ml冰冷的CaCl2溶液重懸細胞， 按每管200 μ 1量分裝於預冷的0.5ml離心管中，立即凍存於_75°C冰櫃中備用。
上述步驟1)中pETKb質粒DNA的製備方法是
質粒的放大培養在2ml含有lOOyg/ml氨卞抗生素的LB培養基中，接入含有 pET15b質粒的ToplO單菌落，於37°C，220rpm振搖下培養過夜；吸取1.5ml培養物於離 心管中，IOOOOg離心30秒，吸去培養液；
離心柱的活化取750 μ 1 GPS緩衝液加入分離柱中，靜置4min，12000g離心 2min ；
質粒的提取在上述沉澱中加入250 μ 1溶液I，吹吸使沉澱完全分散；加入 250 μ 1溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混勻溶液，靜置2min;加入350 μ 1 溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩10秒，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，靜 置4min; 12000g離心lOmin，吸取上清至分離柱中IOOOOg離心lmin，棄去液體，加 入 500 μ 1 Buffer HB IOOOOg 離心 lmin，棄去液體，加入 500 μ 1 DNA Wash, IOOOOg 離心 lmin,重複此步驟；換離心管，加入40 μ 1 Elution Buffer放置2min，13600g離心2min， 紫外分光光度計測含量，27.5ng/ μ 1，Α260/Α280在1.80以上；取5 μ 1做1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測，剩餘儲存於-20°C;所述溶液I和溶液II是指質粒小量提取試劑盒中標註的溶 液。
本發明的優點是
本發明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方 法，該方法根據&"ingle 5基因序列設計PCR引物，通過PCR從模板擴增出人纖維蛋白溶 酶原Kringle 5非融合單基因，在Nco I和Xho I兩酶切位點分別對Kringle 5和pET15b基因雙酶切後再將二者相連，成功構建了 pET15b_K5基因非融合表達載體；將重組載體導 入BL21 (DE3)plys大腸桿菌細胞中低溫誘導表達，結果表明Kringle 5蛋白以可溶型三聚 體形式獲得了高效表達，目標蛋白表達佔菌體總蛋白的25%左右；將上清液經過一步SP Sepharose Fast Flow介質分離純化後可獲得高純度和活性的非融合Kringle 5三聚體蛋白， 經高效凝膠排阻色譜和反相色譜分析檢測其純度在96%以上；雞胚尿囊膜刺激實驗結果 表明，表達的Kringle5三聚體蛋白的抑制血管生成活性約是Kringle5蛋白的三倍。本發 明所提供的非融合可溶型高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法，所表 達的血管生長抑制劑Kringle 5三聚體蛋白比血管生長抑制劑Kringle 5蛋白具有更高的抑 制血管生成活性，在腫瘤治療方面具有巨大的潛在價值和廣闊的應用前景。非融合可溶 型高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的設計和高效表達方法為將其開發成一種新型 抗血管生成藥物奠定了基礎。


圖1是本發明所提供的模板PCR電泳圖；圖2是本發明所提供的Kringle 5和pET15bk5雙酶切電泳圖；圖3是本發明所提供的重組質粒PCR電泳圖；圖4是本發明所提供的IPTG誘導的菌體蛋白電泳圖；圖5是本發明所提供的重組蛋白質表達上清和沉澱的電泳圖；圖6是本發明所提供的重組蛋白的活性檢測示意圖。
具體實施例方式本發明所選擇的試驗材料是1、主要試劑限制性內切酶、T4DNA連接酶、高保真Taq酶均購自Promega公 司，Taq酶購自MBI;質粒小量提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒均購自OMEGA ；引 物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。2、菌株和質粒大腸桿菌BL21(DE3)plys和質粒pET15b。3、培養基LB培養基胰蛋白凍10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加水至 1000ml, 121°C滅菌20分鐘；瓊脂培養基胰蛋白凍10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g， 瓊脂粉15g，加水至1000ml，121°C滅菌20分鐘。本發明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方 法，該方法包括Kringle 5基因上下遊引物的設計與合成上遊引物ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG,其中CCATGG 是
Nco I酶切位點；下遊弓丨物ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG,其中 CTCGAG是Xho I酶切位點。Kringle 5基因的PCR擴增，其具體實現方式是DPCR擴增體系是上遊引物和下遊引物各1 μ 1，模板1 μ 1，Taq酶25 μ 1，加 無菌水至50 μ 1 ； PCR反應條件是95°C 5min預變性；95°C 30s變性，55°C 30s退火，
872 0C 30s延伸，30個循環；72 0C 7min延伸。
PCR後，取5ul PCR反應產物和5ul marker進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑑定產物大小。
2)PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳稱取0.20g瓊脂糖置專用三角瓶，加入20ml蒸 餾水，加熱至沸騰。待冷卻後加入少許Goldview貯存液，混勻後倒入事先插好梳子的 電泳槽中，待其冷卻凝固後加入適量的電泳緩衝液，小心取出梳子；用微量移液槍吸取 PCR產物5 μ 1加入加樣孔中，在旁邊加樣孔中加入DNA Marker做對照；接通電泳池的 電源調節電壓至80v，進行電泳。之後在凝膠成像儀下觀察。
參考圖1，該圖是模板PCR電泳結果，泳道1代表DL2000分子量marker ；泳道2-7是六個平行樣品的模板PCR電泳結果；泳道8代表陰性對照，其結果表明，在300bp 處顯示出條帶，與目的基因大小一致，從模板質粒中能夠擴增出大量的模板DNA分子。
3)pET15b質粒DNA的小量製備，其具體實現方式是
(1)質粒的放大培養在2ml含有100 μ g/ml氨卞抗生素的LB培養基中，接入 含有pET15b質粒的ToplO單菌落，於37°C，220rpm振搖下培養過夜。吸取1.5ml培養 物於離心管中，IOOOOg離心30秒，儘量吸去培養液。
(2)離心柱的活化取750 μ IGPS緩衝液加入分離柱中，靜置4min，12000g離 心 2min。
(3)質粒的提取在上述沉澱中加入250 μ 1溶液I，吹吸使沉澱完全分散；加入 250 μ 1溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混勻溶液，靜置2min;加入350 μ 1 溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩10秒，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，靜 置4min。12000g離心lOmin，吸取上清至分離柱中IOOOOg離心lmin，棄去液體，加 入 500 μ 1 Buffer HB IOOOOg 離心 lmin，棄去液體，加入 500 μ 1 DNAWash, IOOOOg 離心 lmin,重複此步驟。換離心管，加入40 μ IElution Buffer放置2min，13600g離心2min， 紫外分光光度計測含量，27.5ng/ μ 1，Α260/Α280在1.80以上。取5 μ 1做1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測，剩餘儲存於-20 V。
4)PCR產物的凝膠回收，其具體實現方式是
採用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物。將Kringle 5基因的PCR產物按步 驟2)所述方法進行凝膠電泳，在紫外燈下切下含有目的DNA的凝膠，凝膠重0.144g，假 設膠密度為lg/ml，按一個凝膠體積加入等體積Binding Buffer計算，向其中加入150 μ 1 Binding Buffer,混和均勻後於60°C加熱，間斷混合直至凝膠完全融化。將混合溶液加入 分離柱中，IOOOOg離心lmin，棄去下液，加入300 μ 1 Binding Buffer至分離柱中，IOOOOg 離心lmin。加入700 μ 1 SPW (已經用乙醇處理)，IOOOOg離心lmin，重複一遍，棄去 下液，13000g離心2min。將分離柱放入1.5ml離心管中，加入40 μ 1 Elution Buffer,靜 置lmin，13000g離心lmin。紫外分光光度計測含量為60ng/ μ 1，Α260/Α280為1.80。取 5 μ 1膠回收產物進行電泳檢測。
5)雙酶切PCR產物和載體質粒DNA，其具體實現方式是
反應體系NocI1 μ 1，Xho I 1 μ 1, 10 XM Buffer 4 μ 1，pET15b 20 μ 1, PCR 產 物ΙΟμΙ，BSA 0.4 μ 1，加無菌水至40μ1;酶切溫度37°C，時間濁。
6)pET15b和Kringle 5基因雙酶切產物膠回收，其具體實現方式是
具體步驟同4)所述。紫外分光光度計測含量Kringle 5基因濃度為12.0ng/yl， pET15b濃度為4.5ng/ μ 1。取10 μ 1電泳檢測。參見圖2，該圖表示了尺!^§^5和9￡1!551^雙酶切電泳圖，其中，泳道1代表 DNA分子量marker ；泳道2是Kringle 5雙酶切結果；泳道3_4是pET15b雙酶切結果； 泳道5是pET15b未酶切。結果表明，模板質粒和pET15b質粒均能有效進行雙酶切，模 板酶切位點設置正確。7)重組載體pET15b/K5的製備，其具體實現方式是反應體系組成為回收的pET15b質粒10μ1，回收Κ5片段2μ1，10XT4DNA Ligase Buffer 2 μ 1，T4DNALigase 1 μ 1，加無菌水到 20 μ 1。反應條件16°C保溫過夜，_20°C保存備用。8)感受態細胞的製備，其具體實現方式是CaCl2溶液(冰冷)0.1mol/L CaCl2溶液，使用一次性濾器過濾除菌後，_4°C 冰箱存儲備用；0.05mol/L CaCl2甘油溶液30%的甘油+0.1M CaCL2。使用一次性濾器 過濾除菌後，_4°C冰箱保存備用。(1)無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5ml LB液體培養基中，37°C培 養過夜。第二天，倒入250ml的LB液體培養基中，37°C振蕩3.5_4.0h (OD6000.4-0.6)，
停止培養。(2)將培養液分裝到8個25ml預冷無菌的聚丙烯管中，於冰上置5_10分鐘，然 後 4°C，8000rmp 離心 8min。(3)細胞沉澱用IOml冰冷的CaCl2溶液重懸，4°C 6000rmp離心5分鐘。(4)棄上清後，加入IOml冰冷的CaCl2溶液重懸細胞，冰浴半小時後，4°C， 6000rmp離心5分鐘。(5)棄上清後，加入2ml冰冷的CaCl2溶液重懸細胞，按每管200 μ 1量分裝於預 冷的0.5ml離心管中，立即凍存於_75°C冰櫃中備用。9)重組質粒的轉化以及保存，其具體實現方式是(1)將10 μ L連接產物加到200 μ L感受態細胞懸液中，混勻，冰浴30_40min， 42°C水浴保溫90s，立即置冰上3min，加入790 μ 1 LB培養基，180rpm，37°C震蕩培養 60min,然後吸取200 μ 1培養液轉移到加有抗生素氨苄的培養基上進行培養。(2)將轉化成功的大腸桿菌，挑取單菌落於液體培養基，進行純化擴增培養， 37°C劇烈振搖過夜。吸取過夜搖床培養的培養物500 μ 1加入1.5ml的離心管中，再加30% 的甘油500 μ 1混合均勻後於-20或-70°C保藏，定期進行活化重保藏，以防菌種退化或質 粒丟失。10)重組質粒的提取、PCR檢測和序列測定，其具體實現方式是質粒提取方法同步驟3)，質粒PCR檢測所用程序和反應體系同步驟1)，然後進 行瓊脂糖凝膠電泳檢測；序列測定採用T7 Promoter作為起始引物，結果顯示序列正確。序列測定採用T7 promoter作為起始引物，結果如下結果顯示序列正確。ATGGTGCTGCTCCGGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTAAATTTG GGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGC CAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGG TCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCA GTGTGCGGCCCCGTAA,結果表明，所測定序列與設計序列一致。
參見圖3，該圖反應了重組質粒PCR電泳圖，其中泳道1是DL2000分子量 marker ；泳道2_5是四個平行樣品；泳道6表示陰性對照；結果表明，重組質粒中含有 Kringle 5模板分子，模板分子和載體質粒連接正確。
11)培養和重組蛋白的誘導表達，其具體實現方式是
挑取上述轉化後培養出的單菌落至含有5ml培養液的試管中，30°C 220rpm振 蕩過夜。吸取50 μ 1培養物以1 100接種於含100 μ g/ml氨卞的5ml LB培養基中， 30°C 220rpm振蕩3小時，加入誘導劑IPTG，使其終濃度為ImM，再於30°C 220rpm振蕩 4小時。離心收集菌體，用200 μ 1 0.1Μ Tris-HCl (ρΗ 8.0)重懸菌體並洗滌，於5000rpm 離心5分鐘，棄去上清液。誘導菌體以及未加誘導的對照菌體分別做SDS-PAGE，染色， 脫色，成像。
參見圖4，泳道1是蛋白質分子量marker;泳道2是未誘導對照；泳道3_5是 IPTG誘導後的結果；結果表明，經IPTG誘導後，重組菌體在分子量約為2.8kD處有明 顯的表達條帶。這表明它們是以三聚體分子形式存在的，其表達量約佔菌體總蛋白的 25%。
1 重組蛋白質表達分布位置的鑑定，其具體實現方式是
挑取上述轉化後培養出的單菌落至含有5ml培養液的試管中，30°C 220rpm振 蕩過夜。吸取Iml培養物以1 100接種於含100μ g/ml氨卞的100ml LB培養基中， 300C 220rpm振蕩3小時，加入誘導劑IPTG，使其終濃度為ImM，再於30°C 220rpm振 蕩4小時。離心收集菌體，用200 μ 10.IM Tris-HCl (pH8.0)重懸菌體並洗滌，於5000rpm 離心5分鐘，棄去上清液。
將菌體加入到5ml破碎緩衝液中，進行超聲波破碎，破碎後於12000rpm離心10 分鐘，分別收集上清和沉澱部分，沉澱用2.0M尿素洗滌兩次後用7.0M尿素溶解。上清 與沉澱以及未加誘導的對照菌體分別做SDS-PAGE，染色，脫色，成像。
參見圖5，泳道1是2.0M尿素洗滌沉澱一次電泳圖；泳道2是2M尿素洗滌沉 澱二次電泳圖；泳道3是2M尿素洗滌三次電泳圖；泳道4是沉澱8M尿素溶解；泳道5 是上清電泳圖；泳道6是蛋白marker;泳道7是IPTG誘導裂解液；結果表明，所表達的 三聚體Kringle 5不是以包涵體的形式存在的，它們以可溶形式存在於上清中。
1 重組蛋白質的活性檢測，其具體實現方式是
採用雞胚絨毛尿囊膜法對獲得的重組kringle 5進行生物活性鑑定。選擇表面清 潔、蛋形規範、氣室、氣孔均勻的雞胚(已孵化7-9天)，酒精消毒蛋氣室表面，用牙科 鑽劃刻凹痕，實驗組用微量注射器注入100 μ L純化得到的蛋白溶液，對照組注射等量磷 酸鹽緩衝液，在37.8°C、CO2濃度為5%、相對溼度為50%的條件下繼續孵育72h，觀察 雞胚絨毛尿囊膜血管生長情況。然後計數單位視域面積內的一級、二級和三級血管，並 計算單位視域面積內的一級、二級和三級血管所佔面積的百分數。
參見圖6，該圖反應了採用雞胚絨毛尿囊膜法測定的重組三聚體kringle 5的生物 活性，其中左圖陰性對照的雞胚絨毛尿囊膜，右圖為加三聚體kringle 5後的雞胚絨毛尿囊膜。結果表明，所表達的三聚體Kringle 5具有很強的血管生長抑制活性，且其抑制血 管生成活性約是Kringle 5蛋白的三倍。
權利要求
1.一種高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法，其特徵在於所述 高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法包括以下步驟1)製備Kringle5基因的上遊引物、Kringle 5基因的下遊引物、pET15b質粒DNA以 及感受態細胞BL21 (DE3)plys ；所述Kringle 5基因的上遊引物含有Nco I酶切位點；所 述Kringle 5基因的下遊引物含有Xho I酶切位點；2)根據步驟1)所得到的Kringle5基因的上遊引物以及Kringle 5基因的下遊引物對 Kringle 5基因進行PCR擴增，獲取PCR擴增產物；3)利用限制性內切酶分別對pET15b質粒以及步驟2)所得到的PCR擴增產物進行雙 酶切，分別得到pET15b質粒經酶切後的產物以及PCR擴增產物經酶切後的產物；所述限 制性內切酶是Nco I酶以及Xho I酶；4)利用T4DNA連接酶對步驟3)中所得到的PCR擴增產物經酶切後的產物以及 pET15b質粒經酶切後的產物進行酶連接，得到重組質粒pET15b/K5 ；5)將步驟4)獲取得到的重組質粒pET15b/K5轉化至感受態細胞BL21(DE3)plys中 培養並進行保存；6)對步驟5)中已經轉化至感受態細胞BL21(DE3)plys中的重組質粒進行誘導表達。
2.根據權利要求1所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效 表達方法，其特徵在於所述步驟1)中，所述Kringle5基因的上遊引物是 ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG，其中 CCATGG 是 Nco I 酶切位點；所述 Kringle 5 基因的下遊弓丨物是 ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG，其中 CTCGAG是Xho I酶切位點。
3.根據權利要求2所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法， 其特徵在於所述步驟2)中對Kringle 5基因進行PCR擴增的反應體系是Kringle 5基 因的上遊引物和Kringle 5基因的下遊引物各1 μ 1，模板1 μ 1，Taq酶25μ1，加無菌水 至50 μ 1 ； PCR擴增的反應條件是95°C 5min預變性；95°C 30s變性，55°C 30s退火， 72 °C 30s延伸，30個循環；72 0C 7min延伸。
4.根據權利要求3所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法， 其特徵在於所述步驟3)中利用限制性內切酶對PCR擴增產物進行雙酶切的反應體系是NocI 1 μ 1, XhoIl μ 1，10 XM Buffer 4 μ 1，PCR 產物 10 μ 1，BSA 0.4 μ 1，加無菌水至 40 μ 1 ; 酶切溫度37 °C，時間2h;利用限制性內切酶對pET15b質粒進行雙酶切的反應體系是NocI Ιμ ，XhoI Ιμ , IOXMBuffer 4 μ 1，pET15b 20 μ 1, BSA 0.4 μ 1,加無菌水至 40μ1;酶切溫度 37°C,時間 2h。
5.根據權利要求4所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法， 其特徵在於所述步驟4)中對PCR擴增產物經酶切後的產物以及pET15b質粒經酶切後 的產物進行酶連接的反應體系是pET15b質粒10 μ 1，Kringle 5片段2 μ 1，10XT4DNA Ligase Buffer 2 μ 1， T4DNA Ligase 1 μ 1，力口無菌7jC至Ij 20 μ 1 ；反應條件是16°C保溫過夜，-20°C保存備用。
6.根據權利要求5所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法，其特徵在於所述步驟5)中的具體實現方式是將10 μ L連接產物加到200 μ L感受態 細胞BL21(DE3)plys的懸液中，混勻，冰浴30_40min，42°C水浴保溫90s，立即置冰上 3min,加入790 μ ILB培養基，180rpm，37°C震蕩培養60min，然後吸取200 μ 1培養液轉 移到加有抗生素氨苄的培養基上進行培養。
7.根據權利要求6所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法， 其特徵在於所述步驟6)的具體實現方式是選取轉化後培養出的單菌落至含有5ml 培養液的試管中，30°C 200 250rpm振蕩過夜；吸取50 μ 1培養物以1 100接種於 含100yg/ml氨卞的5ml LB培養基中，30°C 220rpm振蕩3小時，加入誘導劑IPTG， 使其終濃度為ImM，再於30°C 200 250rpm振蕩4小時；離心收集菌體，用200 μ 1 0.IM Tris-HCl重懸菌體並洗滌，於5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，所述200μ10.1Μ Tris-HCl 的 ρΗ 是 8.0。
8.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5 三聚體的高效表達方法，其特徵在於所述步驟1)中感受態細胞BL21(DE3)plys的製備 方法是冰冷的CaCl2溶液的製備O.lmol/L CaCl2溶液，使用一次性濾器過濾除菌後，_4°C 冰箱存儲備用；0.05mol/L CaCl2甘油溶液30%的甘油+0.IM CaCL2 ；使用一次性濾器 過濾除菌後，_4°C冰箱保存備用；無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5ml LB液體培養基中，37°C培養過 夜·』將過夜培養BL21菌株單菌液倒入250ml的LB液體培養基中，37°C振蕩3.5_4.0h，當 LB液體培養基的OD600值介於0.4-0.6時停止培養；將培養液分裝到8個25ml預冷無菌 的聚丙烯管中，於冰上置5-10分鐘，然後4°C，8000rmp離心8min ；細胞沉澱用IOml冰 冷的CaCl2溶液重懸，4°C 6000rmp離心5分鐘；棄上清後，加入IOml冰冷的CaCl2溶液 重懸細胞，冰浴半小時後，4°C，6000rmp離心5分鐘；棄上清後，加入2ml冰冷的CaCl2 溶液重懸細胞，按每管200 μ 1量分裝於預冷的0.5ml離心管中，立即凍存於_75°C冰櫃中 備用。
9.根據權利要求8所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達方法， 其特徵在於所述步驟1)中pET15b質粒DNA的製備方法是質粒的放大培養在2ml含有lOOyg/ml氨卞抗生素的LB培養基中，接入含有 pET15b質粒的ToplO單菌落，於37°C，220rpm振搖下培養過夜；吸取1.5ml培養物於離 心管中，IOOOOg離心30秒，吸去培養液；離心柱的活化取750μ1 GPS緩衝液加入分離柱中，靜置4min，12000g離心 2min ；質粒的提取在上述沉澱中加入250 μ 1溶液I，吹吸使沉澱完全分散；加入250 μ 1 溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混勻溶液，靜置2min;加入350 μ 1溶液 III，蓋緊管口，溫和振蕩10秒，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，靜置4min; 12000g離心lOmin，吸取上清至分離柱中IOOOOg離心lmin，棄去液體，加入500μ1 Buffer HB IOOOOg 離心 lmin，棄去液體，加入 500 μ 1 DNA Wash, IOOOOg 離心 lmin，重 復此步驟；換離心管，加入40 μ IElution Buffer放置2min，13600g離心2min，紫外分光 光度計測含量，27.5ng/ μ 1，A260/A280在1.80以上；取5 μ 1做1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩餘儲存於_20°C ；所述溶液I和 溶液II是指質粒小量提取試劑盒中標註的溶液。
全文摘要
一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法，方法包括1)製備Kringle 5基因的上、下遊引物、pET15b質粒DNA以及感受態細胞BL21(DE3)plys；2)對Kringle 5基因進行PCR擴增，獲取PCR擴增產物；3)分別PCR擴增產物以及pET15b質粒進行雙酶切；4)利用T4DNA連接酶對PCR擴增產物經酶切後的產物以及pET15b質粒經酶切後的產物進行酶連接，得到重組質粒pET15b/K5；5)將重組質粒pET15b/K5轉化至感受態細胞BL21(DE3)plys中培養並進行保存；6)對重組質粒進行低溫誘導表達。本發明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達方法。
文檔編號C12N15/70GK102021192SQ20101029877
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者妙亮, 邊六交 申請人:西北大學