一種檢測雞殘差採食量性狀的分子生物學方法
2023-11-02 03:22:37
一種檢測雞殘差採食量性狀的分子生物學方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測雞殘差採食量性狀的分子生物學方法。該方法是檢測雞GHSR基因completecds序列自5』端起第671位鹼基為A還是G。本發明為雞生產效率改良提供了一個高效準確，方便易行的分子遺傳標記（單核苷酸多態性標記），可用於以提高肉雞尤其是黃羽肉雞生產效率為目標的分子育種工作。本發明的檢測方法具有早期篩選、節省時間、節約成本、準確性高等優點，可以加快育種進程，為提高肉雞生產效率和肉雞養殖業的生產效益奠定技術基礎。
【專利說明】一種檢測雞殘差採食量性狀的分子生物學方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於農業養殖動物分子標記輔助育種【技術領域】。具體涉及檢測雞殘差採食量性狀的方法，特別是涉及一種利用雞基因的單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism, SNP)檢測雞殘差採食量性狀的方法。
【背景技術】
[0002]肉質細嫩鮮美的中國地方雞種在國內外擁有廣闊的市場。近年來，隨著人們生活水平的提高，消費觀念的轉變，地方雞銷售表現出良好的趨勢，成為我國養雞業中獨具特色的一個產業。在養殖業生產的競爭激烈中，想獲得經濟效益，就必須提高生產效率，以降低成本。然而我國地方雞品種與白羽肉雞相比仍存在生產效率低的缺點。通過現代育種技術提高地方雞的生產效率是增強地方雞市場競爭力和增加企業生產效益的重要基礎。殘差採食量為動物實際進食的量與維持需要和生產產品需要的差值。飼料成本佔到養殖業成本的60-70%,因此殘差採食量常作為衡量農業動物生產效率和養殖業經濟收益的重要指標。但是在生產和育種研究過程中測定殘差採食量性狀難度大、成本高。殘差採食量為中等遺傳力性狀，說明該性狀的變異均具有一定的遺傳基礎。從分子生物學的角度去研究殘差採食量的候選基因和相關分子標記，通過基因型進行選擇，可以提高選擇準確度並加快育種進程。
[0003]生長激素促分泌素(Ghrelin)是一種內源性多肽,最初在1999年由Kojima等在大鼠胃組織中發現。Ghrelin可刺激生長激素的分泌，並促進腎上腺分泌激素、催乳素、皮質醇及腎上腺素的釋放，對 能量平衡起調節作用，並促進進食。Ghrelin基因的生理作用的調節主要是由其受體基因(Ghrelin rec印tor，6HS?)介導。在畜禽研究中，Jin等研究指出
基因一個突變位點與山羊體長指數顯著相關(Jin et al.，2010) ;Zhang等研究發現基因完全連鎖的2個SNP與南陽牛的體重和平均日增重顯著相關(Zhang et al.，2009)；基因的SNP與歐洲肉牛的生長和胴體性狀相關(Masanori et al., 2010)o Fang等發現隱性白來航和杏花雞的基因內含子I上的一個突變位點與生長和胴體性狀相關(Fang et al.，2009)。同時，基因SNP與脂肪沉積性狀也具有一定的相關性:Nie等對8個雞群和9個鴨群研究指出基因突變與雞和鴨的脂肪沉積相關(Nie et al.，2009);6HS?基因的缺失突變與白洛克雞和杏花雞的雜交二代脂肪性狀有顯著相關(Lei etal., 2007)。上述結果表明基因可作為候選基因，研究其變異與肉雞群體殘差採食量性狀變異的相關性，為標記輔助育種提供參考依據。
[0004]單核苷酸多態性是指基因組水平上單個核苷酸的變異所引起的一種DNA序列多態性。SNP在基因組中廣泛存在。通過對目標基因靶序列進行PCR擴增，之後對擴增產物進行DNA測序是檢測SNP的一個常用技術。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種利用雞生長激素促分泌素受體基因(Ghrelinreceptor, GHSR)的SNP檢測雞殘差採食量的方法。
[0006]本發明所提供的檢測雞殘差採食量的方法，是檢測待測雞的基因completecds序列自5』端起第671位鹼基為A還是G。
[0007]如果待測雞的GHSR基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基為A時，其純合體的基因型為AA ;如果雞的基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基為G時，其純合體的基因型為GG ;它們的雜合體基因型為AG。
[0008]上述基因型中，GG基因型雞的飼殘差採食量比AA和AG基因型雞分別低39.13g和27.75g，且差異達到極顯著水平Gd 0.05)。
[0009]所述檢測方法為PCR法和DNA測序。
[0010]其中，PCR擴增待測雞的包含基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基的核苷酸序列所用的引物可為序列表中的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3。
[0011]所述檢測方法中的PCR反應體系可為:雞基因組DNA 0.6 μ L (50 ng/^L)，2XTaqPCR Master Mix 5 μ L,上下遊引物各0.3 μ L (10 pmol/gL),加去離子水至10 μ L。所述PCR反應條件為:先94°C預變性3min ;然後94°C變性30s，59.1°C退火30s，72。。延伸30s，共32個循環；最後72°C延伸7 min。
[0012]本發明提供了一種利用雞基因的單核苷酸多態性標記檢測雞殘差採食量性狀的方法。試驗證明可以利用G//57?基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基的多態性，並根據基因型對雞的殘差採食量性狀進行選擇，刪除不利等位基因(A)。用本發明的方法對雞的殘差採食量進行選擇，能夠提高肉雞的生產效率，並且具有早期篩選、節省時間、操作簡單、節約成本、準確性高等優點。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測雞基因組DNA結果。
[0014]圖2為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測使用序列表中的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3進行PCR擴增雞的包含GHSR基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基的核苷酸序列的結果。
[0015]圖3為對包含雞GHSR基因的擴增產物多態位點(complete cds序列自5』端起第671位鹼基)雜合子個體(基因型為AG)測序結果，圖中方框部分表示發生鹼基替代的位置。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例中未經特別說明的方法均參照[美]J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)，北京:科學出版社，2002年)。
[0017] 實施例1:雞GHSR基因多態位點的獲得
1、PCR擴增
選取297隻北京油雞公雞為實驗材料，17周齡時對每個個體進行翅下靜脈採血lmL，用A⑶抗凝，血樣於-20°C冷凍保存。採用酚-氯仿抽提法從上述的雞血液中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果發現DNA條帶清晰、明亮、無雜帶(圖1)，可以用於後續的PCR擴增試驗。
[0018]從GenBank上獲取紅色原雞GHSR基因的complete cds序列(GeneID:AB095994.1),針對該基因的外顯子I設計引物，序列如下:F(正向引物):5，-TGAGGACCACCACCAACT-3』(序列表中 SEQ ID N0.2)，R(反向引物):5』-:AGCACCGTGAGGCAGAAT-3』(序列表中 SEQ ID N0.3)
用上述引物對提取的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增體系(10 μι)如下:雞基因組DNA 0.6μL(50 ng/^L)，2XTaq PCR MasterMix 5 μL，上下遊引物各 0.3 μL(10 pmol/^L)，加去離子水至10 μLο PCR反應條件如下:先94°C預變性3 min ;然後94°C變性30s，59.1°C退火30s，72°C延伸30s，共32個循環；最後72°C延伸7 min。PCR擴增產物經I %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖2所示。
[0019]2、DNA測序分析
將上述擴增產物送至北京天一輝遠生物科技有限公司進行測序，採用DNAStar對所測序列進行分析，確定SNP位點。297隻北京油雞基因擴增片段多態性位點的基因分型採用sequnome進行質譜SNP分型，在北京毅新興業科技有限公司進行。結果發現6個單核苷酸突變位點，分別為自雞GHSR基因complete cds序列5』端起938位的G/A鹼基突變；自雞GHSR基因complete cds序列5』端起893位的C/T喊基突變；自雞GHSR基因completecds序列5』端起842位的C/T鹼基突變；自雞基因complete cds序列5』端起824位的C/T鹼基突變；自雞GHSR基因complete cds序列5』端起764位的C/T鹼基突變；自雞GHSR基因compIete cds序列5』端起671位的A/G鹼基突變。其中自雞GHSR基因complete cds序列5』端起 671位的A/G鹼基突變為本發明所涉及的分子標記(圖3)。
[0020]結果顯示，在所檢測的297隻北京油雞中，AA基因型個體有158個，GG基因型個體有25個，AG基因型個體有114個(表1)。在北京油雞中A等位基因的基因頻率為0.72，G等位基因的基因頻率為0.28。卡方適合性檢驗分析結果表明在該北京油雞群體中的基因型分布情況處於平衡狀態0° > 0.05)。所得結果真實可信。
[0021]實施例2 'GHSR基因A671G單突變位點與黃羽肉雞的殘差採食量性狀及其他重要經濟性狀的相關性分析
為確定雞基因complete cds序列自5』端起671位鹼基(A671G)的G/A多態性與肉雞重要表型性狀差異是否相關，以297至北京油雞為試驗材料，在9-17周齡飼養期間:9周齡時空腹稱重，記錄每個個體總採食量；17周齡將個體屠宰，稱量屠體重、全淨膛重、腿肌重、胸肌重、腹脂重、胸、腿肌肌內脂肪含量；計算平均日採食量、平均日增重、殘差採食量、胸肌率、腿肌率、腹脂率等重要性狀。
[0022]採用SAS8.0 GLM程序分析了雞GHSR基因A671G位點不同基因型與生產效率、胴體性狀間的相關關係。分析構建模型如下:
Yij= U + Li +Gj + ejj
其中，Yu為個體單個待分析性狀；μ為待分析性狀的群體均值A為第i個品系效應(i =1、2、3) ；Gj為基因型效應(j代表基因型)；eiJ為隨機殘差效應。
[0023]不同基因型與各性狀間的關聯分析結果如表1所示，A671G位點與雞殘差採食量以及平均日採食量性狀的相關性達到顯著水平(GG基因型個體的殘差採食量以及平均日採食量顯著低於AA基因型個體(P 0.05)。因此GG基因型是高生產效率，即低採食量和低殘差採食量的優勢基因型。
[0024]表1雞GHSR基因G671A位點基因型與生產效率、胴體性狀的相關性分析
【權利要求】
1.一種檢測雞殘差採食量性狀的分子生物學方法，是檢測雞ffiST?基因complete cds序列(序列表中的SEQ ID N0.1)自5』端起第671位鹼基為A還是G。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述雞的基因completecds序列自5』端起第671位鹼基為A時，其純合體的基因型為AA ;所述雞的基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基為G時，其純合體的基因型為GG ;它們的雜合體基因型為AG ；所述GG基因型雞的殘差採食量低於AA和AG基因型雞，殘差採食量比AA和AG基因型雞分別低39.13g和27.75g ;GG基因型是高生產效率(低採食量和低殘差採食量)的優勢基因型。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述檢測方法為PCR法和DNA測序。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述PCR擴增待測雞的包含GHSR基因complete cds序列自5』端起第671位鹼基的核苷酸序列所用的引物對為序列表中的SEQID N0.2 和 SEQ ID N0.3。
5.根據權利要求3或者4所述的方法，其特徵在於:所述PCR反應體系為:雞基因組DNA 0.6 μ L(50 ng/μ L),2XTaq PCR Master Mix 5 μ L，上下遊引物各0.3 μ L( 10 pmol/μ L)，加去離子水至10 μ L0
6.根據權利要求3或者4所述的方法，其特徵在於:所述PCR反應條件為:先94°C預變性3min ;然後941:變 性308，59.1°C退火30s，72°C延伸30s，共32個循環;最後72°C延伸.7 min0
【文檔編號】C12Q1/68GK104004825SQ201310723506
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】陳繼蘭, 孫研研, 劉國芳, 白皓 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所