一種實時fret-pcr和巢式pcr檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒的製作方法

2023-11-03 14:03:37 4

一種實時fret-pcr和巢式pcr檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種實時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒。所述引物、探針如序列1-8所示。本發明設計FRET-PCR的引物和探針，可以特異地擴增所有立克次氏體種屬的核酸，從而快速的判斷出陽性樣品；然後選擇相同基因的其他保守區間設計巢式PCR的2對引物，並通過巢式PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序確定相應陽性樣品的立克次氏體種屬。因此，此系統不僅能快速、特異的檢測到所有種屬的立克次氏體，而且能確定其種屬。
【專利說明】—種實時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明建立了一套基於檸檬酸合成酶基因、可以對所有立克次氏體的種進行檢測和分型的系統。本系統通過實時FRET-PCR和巢式PCR相結合的方式而達到快速檢測和分型所有立克次氏體種的目的。
【背景技術】
[0002]立克次氏體是一種細菌，但同時具有病毒的特徵，是嚴格的細胞內寄生生物，寄生在各種吸血節肢動物和昆蟲體內。人和動物通過被感染立克次氏體的媒介昆蟲叮咬或接觸其糞便而感染，可引起人類和動物發熱、頭痛和皮疹等臨床症狀。該病多發生在熱帶與亞熱帶國家和地區，目前立克次氏體感染已成為世界性問題。目前我國已將流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒等由立克次氏體感染所引起的傳染病列為乙類傳染病。我國存在10種以上立克次氏體感染引起的疾病，如流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、恙蟲病、北亞蜱傳斑點熱、黑龍江蜱傳斑點熱、內蒙古蜱傳斑點熱、Q熱、人單核細胞埃立克體病、人粒細胞埃立克體病以及巴爾通體病等。立克次氏體嚴格細胞內寄生性決定了鑑定立克次氏體感染不同於傳統的細菌學診斷，如不易於分離和培養。立克次氏體在世界範圍內檢出率不高且陽性樣品中立克次氏體核酸含量相對較低，亟需一種高效和高靈敏度的檢測方法。
[0003]1.分離培養。對於細菌性感染，從發病機體內分離和培養病原體是測定其種屬的常用方法。立克次氏體是一類介於細菌和病毒之間，更接近於細菌的原核生物。目前分離培養立克次氏體的常用方法有:(1)細胞培養。是目前臨床標本初步分離立克次氏體使用最廣泛的方法，最常用的細胞系有L929及vero細胞。(2)動物接種法。用於初代分離，常用實驗動物有小白鼠、豚鼠、大白鼠、地鼠等。(3)雞胚卵黃囊培養法。作為動物培養的輔助方法，用於動物培養失敗的弱毒株和無毒株培養，也可用於病原體在動物體內的傳代接種，它能直接從現場標本中分離病原體。由於立克次氏體為嚴格的細胞內寄生，同時感染的人或動物菌血症時間較短且病原菌含量很低，使得立克次氏體的分離培養較為困難。
[0004]2.血清學。立克次氏體特異抗體的檢測是WHO推薦的主要診斷技術之一，然而血清抗體一般在發病5到10天能夠檢測到，主要是IgM型抗體。單份血清特異抗體明顯高於當地正常人群血清滴度或雙份血清發生血清轉換(血清抗體4倍升高)可進行明確診斷。血清學方法通常根據實驗目的、實驗條件進行。通用的國際標準是間接免疫螢光(IFA)檢測血清抗體。(1)間接免疫螢光(IFA)。主要採用立克次氏體特異抗原檢測感染人或動物血清抗體，且同一抗原片可以同時檢測多種立克次氏體。(2)補體結合試驗(CF)。是一種有補體參與並以綿羊紅細胞和溶血素為指標系統的免疫檢測方法。(3)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)0包被抗原通常為重組抗原，可用於急性病例診斷和流行病學調查。由於立克次氏體較難分離培養，使得試劑盒中抗原提純不足而使結果中經常出現假陽性或交叉感染。
[0005]3.免疫組化。免疫組化螢光檢測立克次氏體能在血清轉化前診斷病人或動物的感染。新鮮組織、福馬林固定或石蠟包埋的標本均可用於免疫檢測，在普通顯微鏡下觀察到細胞周圍感染的立克次氏體具有較高的靈敏性和特異性，尤其在沒有螢光顯微鏡的實驗室更加方便。但此方法專業性較強，且操作繁瑣。
[0006]4.分子生物學。以PCR擴增及測序為主要手段的分子生物學技術目前已取代病原分離作為直接診斷依據。PCR技術包括常規PCR、巢式PCR和實時螢光定量PCR(real-timequantitative PCR)。(I)常規PCR。通常選用屬、群或種特異基因進行擴增。如立克次氏體屬16SrRNA，斑疹傷寒和斑點熱群17KD、gltA和外膜蛋白ompB等。(2)巢式PCR。如17KD、gltA、ompB、56KD巢式PCR分別被用來檢測斑疹傷寒群和斑點熱群、恙蟲病立克次氏體。(3)實時螢光定量PCR。這是目前檢測病原體最快速、準確、特異、靈敏的核酸檢測技術。如根據gltA基因序列設計引物和探針建立了斑疹傷寒和斑點熱群立克次氏體的螢光定量PCR檢測技術。然而，目前的分子診斷方法還不夠成熟。部分通過傳統PCR和瓊脂糖凝膠電泳的檢測方法可以涵蓋所有的立克次氏體種屬，但是操作繁瑣，不適應於大量樣本的檢測。現存的定量PCR僅能檢測立克次氏體的部分種，而且不能區分有致病性差異的不同種立克次氏體。

【發明內容】

[0007]1.要解決的技術問題
[0008]目前立克次氏體的檢測方法如下:1)病原菌的分離和培養。通過從感染人或動物體內分離得到立克次氏體，然後接種細胞等並培養來判斷。但由於立克次氏體的嚴格胞內寄生性使得立克次氏體病原菌的分離和培養較為困難。2)血清學檢測。用抗原和抗體結合的理論，通過包被的抗原檢測人或動物的血清抗體來判斷。但由於試劑盒中抗原提純不夠或檢測過程中出現的交叉感染，使結果經常出現假陽性。3)分子生物學檢測。主要通過PCR方法檢測樣本中有無立克次氏體核酸來判斷。立克次氏體有3個屬、12個種，不同屬和種的立克次氏體的致病性及感染後的預後明顯不同。因此，我們亟需建立一種快速、精確地檢測並區分所有種立克次氏體的方法。
[0009]2.技術方案
[0010]本發明的原理和最核心的思路是發明一種高度靈敏、特異、快速檢測和分型所有立克次氏體種的方法體系。同時確保此系統不擴增其它非立克次氏體的微生物，尤其是與其相近的其他病原體，如埃裡克體、貝納柯克斯體和無形體等。本發明選擇檸檬酸合成酶基因作為目標基因，並選擇相對保守的區域設計引物和探針。總體的思路是:巧妙地設計FRET-PCR的引物和探針，可以特異地擴增所有立克次氏體種屬的核酸，從而快速的判斷出陽性樣品；然後選擇相同基因的其他保守區間設計巢式PCR的2對引物，並通過巢式PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序確定相應陽性樣品的立克次氏體種屬。因此，此系統不僅能快速、特異的檢測到所有種屬的立克次氏體，而且能確定其種屬。
[0011](I) FRET-PCR。首先從NCBI上獲得所有立克次氏體種的gltA基因序列，並選擇相對保守的區間設計引物(FRET-上遊引物和FRET-下遊引物)和探針(FRET-6-FAM探針和FRET-LCRed640探針)。然後用該引物和探針對樣品進行實時、定量和快速檢測。對於含有立克次氏體核酸的樣品，在FRET-PCR結果中其螢光曲線會在640nm處出現或增強，同時在其高解析度熔解曲線中其熔解峰會出現在不同的溫度處。因此，可以根據熔解峰溫度區分貓立克次氏體和其它種的立克次氏體。(2)巢式PCR。基於gltA基因設計內部和外部2對引物(N-上遊引物-1和N-下遊引物-1、N-上遊引物-2和N-下遊引物_2)，然後用此引物對實時FRET-PCR檢測為陽性的樣品做巢式PCR。首先用外部引物擴增目的片段，然後用內部引物擴增外部引物的PCR產物。將最終的PCR產物進行基因測序，最後將測序結果和各個立克次氏體種的標準核酸序列進行比對，從而確定其立克次氏體的種。
[0012]從GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下立克次氏體種屬的檸檬酸合成酶基因的序列後，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進行比對:Rickettsia africae U59733, R.akari U59717, R.australis U59718, R.canadensis U59713, R.conorii U59730, R.felis JQ674484, R.helvetica U59723, R.honei AF018074,R.japonica U59724, R.massiliae U59719, R.mongolotimonae U59731, R.montana U74756, R.pakeri U59732, R.rhipicephali U59721, R.rickettsii U59734, R.solvaca U59725, R.thphi U59714, R.hoogstraalii FJ767737, R.japonica AY743327, R.prowazekii U59715。據此,本發明設計的引物和探針為(圖1_8):具體序列如下
[0013](I)定量FRET-PCR引物及探針
[0014]FRET-上遊引物:5』-TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3，(SEQ ID N0.1)
[0015]FRET-下遊引物:5，-ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3，(SEQ ID N0.2)
[0016]6-FAM 探針:5，-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3，(SEQ ID N0.3)
[0017]LCRed640 探針:5』 -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸 _3』(SEQ ID N0.4)
[0018](2)巢式 PCR
[0019]N-上遊引物-1:5』 -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3』 (SEQ ID N0.5)
[0020]N-下遊引物-1:5，-ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3，(SEQ ID N0.6)
[0021]N-上遊引物-2:5』 -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3』 (SEQ ID N0.7)
[0022]N-下遊引物-2:5』 -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3，(SEQ ID N0.8)
[0023]本發明還提供了用於實時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的試劑盒，包括:
[0024]( I)實時螢光定量PCR試劑
[0025]20 μ I的擴增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、I μ MFRET-上遊引物、I μ M FRET-下遊引物、0.2 μ M 的 6-FAM 探針、0.2 μ M 的 LCRed640 探針、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0026](2)巢式PCR試劑
[0027]巢式PCR-外部:
[0028]20 μ I的擴增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、I μ MN-上遊引物_1、1 μ M N-下遊引物-1、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP ；
[0029]巢式PCR-內部:
[0030]20 μ I的擴增體系包含:10μ I巢式PCR外部引物產物、IxPCR緩衝液、I μ M N-上遊引物_2、1μΜ N-下遊引物_2、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0031]檸檬酸合成酶-PCR特異性的確定。本發明的特異性從四個方面得到保證:
[0032]I)設計的引物和探針經過GenBank的BLAST搜索，確認本發明設計的引物能特異地擴增所有的立克次氏體，而不擴增其它非立克次氏體尤其是與其相近種屬病原體的核酸。通過BLAST確認，FRET-PCR探針和引物及巢式PCR的引物能特異地擴增和檢測所有立克次氏體種的核酸；
[0033]2)本發明檢測貓立克次氏體和傷寒立克次氏體標準品、埃立克體陽性樣品和無形體陽性樣品。結果表明，本發明系統可以擴增貓立克次氏體和傷寒立克次氏體的核酸，而不擴增埃立克體和無形體陽性樣品的核酸；
[0034]3)觀察以上擴增對象在PCR過程中螢光強度(640nm)的變化，以及PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。螢光在640nm波長出現或增強，顯示陽性；在瓊脂糖凝膠電泳中，RT-PCR顯示167鹼基對(bp)和巢式PCR外部444bp和內部352bp的條帶大小；
[0035]4)對擴增的PCR產物進行測序，測序的結果和GenBank的標準序列進行比對，從而判定其立克次氏體的種。
[0036]檸檬酸合成酶-PCR靈敏度的確定:由IDT合成立克次氏體中的貓立克次氏體和傷寒立克次氏體檸檬酸合成酶基因的序列。依據合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數目。隨後，對合成物進行稀釋，製備每IOyl合成物的稀釋試劑含10，000拷貝、1，000拷貝、100拷貝、10拷貝、I拷貝的基因。用本發明系統擴增含不同基因濃度的稀釋液，來確定本發明檢測此基因的靈敏度。結果顯示，此發明可以在反應系統中擴增單拷貝的目的檸檬酸合成酶基因。
[0037]3.有益效果
[0038]1)本發明可以特異性地檢測所有的立克次氏體。目前為止，立克次氏體可以分為斑點熱群、傷寒群和恙蟲病立克次氏體3個屬,共12個種，如R.rickettsia、R.akar1、R.conori1、R.sibirica、R.australis、R.felis、R.japonica、R.africae、R.hoogstraali1、R.prowazeki1、R.typhi等。因此,能夠同時檢測到立克次氏體的所有種很重要,尤其對於同源性差別較大的種屬。同時，檢測到所有的種可以更方便的發現新的立克次氏體的種或株，並及時的更新立克次氏體的分類，從而更好地認識該病原體。
[0039]2)本發明可以對不同種的立克次氏體進行分型。不同的立克次氏體種可以引起不同的疫病，如普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疫傷寒和斑疫傷寒的病原體，莫氏立克次氏體(Rickettsia mooseri)是地方性斑疹傷寒(也稱鼠型斑疹傷寒)的病原體，立克次氏立克次氏體(Rickettsia rickettsii)是引起落基山斑疫傷寒的病原體，恙蟲病立克次氏體(Rickettsia tsutsugamushi )是恙蟲病(叢林斑疫傷寒)的病原體。因此，確定陽性樣本的立克次氏體的種從而根據對應的病原體特點採取相應的治療和控制措施，同時可以根據不同傳染病的傳染源和傳播途徑採取相應的防治措施，從而更好的預防和控制立克次氏體的感染。
[0040]3)本發明操作便捷，適合於檢測大量樣本。由於立克次氏體是嚴格的細胞內寄生，且感染立克次氏體的人或動物在菌血症及其後期機體內(如血液)立克次氏體的細菌含量相對較低，這就需要通過鑑定較多的樣品或極其靈敏的檢測方法來確診感染。在實際應用中，如流行病學調查或檢測大量送檢樣品，對於普通PCR結合瓊脂糖凝膠電泳等方法需要極大的工作量。而本發明可以先從大量樣本中篩選出陽性樣本，然後再通過巢式PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序確定其立克次氏體的種。
[0041]立克次氏體是一種細菌，但其嚴格的細胞內寄生性、缺乏特異性的臨床表現和較短的菌血症時間等特點決定了立克次氏體檢測不同於傳統的細菌學檢測。由於檢測時間和樣本量的限制，聚合酶鏈式反應(PCR)檢測成為主要的檢測手段和方法，尤其是定量FRET-PCR 和巢式 PCR。
[0042]4)本發明綜合了定量PCR和巢式PCR的優點，而摒棄了他們的缺點。本發明能夠特異、靈敏和快速的檢測所有的立克次氏體且確定相關陽性樣品的立克次氏體的種，這將為立克次氏體感染的檢測和控制提供強有力的技術支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1.本發明的定量FRET-PCR的上遊引物。FRET-上遊引物序列:5 『-TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3 』( 27bp )，其中有一個兼併鹼基R。此兼併鹼基R可以同時擴增A和G鹼基，所以R.hoogstraalii有一個錯配鹼基,而其他種的立克次氏體和此引物完全吻合。
[0044]圖2.本發明的定量FRET-PCR的下遊引物。FRET-下遊引物序列:5』 -ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3』(21bp)，此序列為圖中獲得序列對稱鏈的核苷酸序列。在立克次氏體的所有種中，R.prowazekii和R.typhi有I個錯配，R.helvetica有2個錯配。
[0045]圖3.本發明的定量FRET-PCR的6-FAM探針。6-FAM探針序列為:5 『-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3』(21bp)，在其3』端標記有螢光激發基團。此探針在R.canadensis 和 R.slovaca 有 I 個錯配，在 R.prowazekii 和 R.typhi 有 2 個錯配，而和其他種的立克次氏體完全吻合。
[0046]圖4.本發明的定量FRET-PCR的LCRed640探針。FRET-PCR中LCRed640探針的核苷酸序列:5 『 -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3 』( 3 Ibp )，其 5 』端標記640螢光接受基團，3』端標記磷酸基團阻止其在PCR反應體系中繼續向下延伸。此段引物序列和所有種的立克次氏體檸檬酸合成酶基因完全相同。
[0047]圖5.本發明的巢式PCR的N-上遊引物-1。巢式PCR外部引物N-上遊引物-1的核苷酸序列為:5』 -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3』(32bp)，且引物中含有一個兼併鹼基K。兼併鹼基K可以同時擴增鹼基G和T，使得引物可以涵蓋更多的立克次氏體種屬。引物在R.canadensis中有2個錯配鹼基,而與其他種的立克次氏體的核苷酸序列完全吻合。
[0048]圖6.本發明的巢式PCR的N-下遊引物-1。巢式PCR中外部引物N-下遊引物-1的核苷酸序列為:5』 -ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3』( 3Ibp)，此引物序列為圖中獲得核苷酸鏈的對稱鏈序列。此引物是巢式PCR擴增外面部分的下遊引物,其在R.prowazekii中有I個錯配鹼基，而與其他立克次氏體種對應gltA基因核苷酸的序列全部相同。
[0049]圖7.本發明的巢式PCR的N-上遊引物_2。此巢式PCR內部上遊引物N-上遊引物_2的核苷酸序列為:5』 -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3』，長26個核苷酸。此引物在R.felis和R.canadensis中分別有I個錯配喊基，在R.hoogstraalii中有2個錯配喊基。
[0050]圖8.本發明的巢式PCR的N-下遊引物-2。此巢式PCR內部引物N-下遊引物_2的核苷酸序列為:5』 -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3』，其長27個鹼基，同時含有一個兼併鹼基Y。此兼併鹼基Y可以同時擴增鹼基C和T。此引物為下遊引物，其序列為圖中核苷酸鏈的對稱鏈的核苷酸序列。除兼併鹼基位點外，此引物和R.hoogstraalii有I個錯配鹼基。
[0051]圖9.本發明中立克次氏體的熔解曲線。本發明結束後，對於不同種的立克次氏體，其熔解曲線中熔解峰的溫度會不同。如圖表示貓立克次氏體、陰性對照和其它種立克次氏體的熔解曲線中的熔解峰。可以通過熔解峰溫度的不同初步判斷立克次氏體的種屬。如圖所示，貓立克次氏體溶解峰溫度為61.9°C,而其它種的立克次氏體溶解峰溫度為57.9℃。
[0052]圖10.實施例1 中 ompB-F 和 ompB-R 引物。文章 「Molecular evidence ofRickettsia felis infection in dogs from northern territory, Australia，，(Hii SFet al., Parasit Vectors.2011 ;4:198)中的 ompB-F 和 ompB-R 引物。該文章的引物只能檢測貓立克次氏體的核酸，而不能涵蓋立克次氏體其他種屬。
[0053]圖11.實施例1 中引物 CS-78、CS-323、CS-239 和 CS-1069 以及引物 CS-5 和CS-6。(I)文章「A novel Rickettsia infecting Amblyomma dubitatum ticks inBrazil^ (Almeida AP et al.，Ticks Tick Borne Dis.2011; 2 (4):209-212)中的引物CS-78,CS-323,CS-239和CS-1069。此套引物需要和瓊脂糖凝膠電泳相結合，這會加大檢測時的工作量，尤其是面對大量樣本。
[0054](2)文章「Rickettsia Species Infecting Amblyomma cooperi Ticks froman Area in the State of Sa ~o Paulo, Brazil, Where Brazilian Spotted Fever IsEndemic^dabruna MB et al.,J Clin Microbiol.2004; 42 (I):90-98.)中的引物 CS-5 和CS-6。此文章中的引物和探針只是檢測到了蜱中立克次氏體的存在，並沒有通過更多動物種類樣品的檢測。
[0055]圖12:本發明定量FRET-PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶位置。圖中共11個泳道，其中I泳道為標準品，8泳道為陰性樣品，其餘泳道為陽性樣品。本試驗所使用的標準品條帶大小如圖標註，從下到上依次為IOObp，250bp, 500bp, 750bp等。本發明中FRET-PCR產物的條帶大小為167bp。
[0056]圖13.本發明巢式PCR內部引物和外部引物PCR產物的條帶位置。巢式PCR用內外兩對引物分兩步擴增目的條帶，首先用外部引物擴增目的片段，然後用其產物作為模板並用內部引物擴增。圖中共12個泳道，其中1、12泳道是標準品，2-6泳道為外部引物擴增的產物，7-11泳道為內部引物擴增產物。在樣品中，2 (7)、5 (10),6 (11)泳道為陽性樣品，3 (8)、4 (9)泳道為陰性樣品。本試驗所用的標準品的條帶大小如圖所示，從下到上依次為lOObp，250bp, 500bp, 750bp等。巢式PCR產物中，外部產物的條帶大小為444bp，而內部產物的條帶大小為352bp。
【具體實施方式】
[0057]1.立克次氏體PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下:
[0058](1) FRET-PCR
[0059]FRET-上遊引物:5 』 -TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3 』
[0060]FRET-下遊引物:5 』 -ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3 』
[0061 ]6-FAM 探針:5，-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3，
[0062]LCRed640 探針:5，-LCRed640_GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3，
[0063](2)巢式 PCR
[0064]N-上遊引物-1:5 』 -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3 』[0065]N-下遊引物-1:5』 -ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3』
[0066]N-上遊引物-2:5 』 -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3 』
[0067]N-下遊引物-2:5』 -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3』
[0068]2.製備PCR用的標準定量試劑。由IDT合成立克次氏體種屬(貓立克次氏體、傷寒立克次氏體)的基因gltA的序列。依據合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數目。隨後，對合成物進行稀釋，製備每?ο μ I合成物的稀釋試劑分別含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝、I拷貝的基因，作為PCR用的標準定量試劑；
[0069]3.製備待檢樣品的DNA模板。本發明所用的檢測模板包括人全血、犬全血、跳蚤、蜱、蝨子以及蚊子。
[0070]I)從貓和犬身上採集跳蚤、蜱和蝨子經種屬鑑定後，以單個個體保存於含有400ul核酸保護劑的試管中，經PRECELLUS粉碎器60秒粉碎後，用商業化核酸提取試劑盒對所有樣品進行核酸抽提。核酸提取的相關操作流程按照相應試劑盒的使用說明書操作，且最後用 T10Eai (含 IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, ρΗ8.5)洗脫核酸至 IOOul 作為 PCR 擴增模板。
[0071]2)收集人和犬的全血樣品於含EDTA的採血管中，用商業化核酸提取試劑盒對相關樣品進行核酸提純。核酸提取的相關程序按照相應的商業化試劑盒的使用說明書操作，最後洗脫在200 μ I TltlEai洗脫液中作為PCR的擴增模板；
[0072]3)被捕捉的單個蚊子經屬種鑑定後，立即保存於含有400微升核酸保護劑的試管中，經PRECELLUS粉碎器30秒粉碎後，用於DNA純化；按照商業化試劑盒相關操作說明對粉碎後的蚊子樣品進行核酸提純，最後洗脫在80 μ I TltlEai洗脫液中作為PCR的擴增模板；
[0073]4.PCR擴增體系。
[0074]I)實時螢光定量PCR
[0075]20 μ I的擴增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、I μ MFRET-上遊引物、I μ M FRET-下遊引物、0.2 μ M 的 6-FAM 探針、0.2 μ M 的 LCRed640 探針、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0076]2)巢式 PCR
[0077]巢式PCR-外部:20 μ I的擴增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、I μ M N-上遊引物-1、I μ M N-下遊引物-1、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP ο
[0078]巢式PCR-內部:20μ I的擴增體系包含:10μ I巢式PCR外部引物產物、IxPCR緩衝液、I μ M N-上遊引物_2、1μΜ N-下遊引物_2、2個單位的商業化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0079]5.PCR擴增循環參數。
[0080]I) FRET-PCR
[0081]PCR擴增包括:預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、40個欠嚴謹的螢光獲得循環、I個持續螢光獲得的熔解循環和I個降溫循環。預變性:lX2min@95°C ；18個溫度遞減的高嚴謹循環:6xlsec@95 °C，12seci70 °C,8seci72 °C ；9xlseci95 °C, 12seci68 °C,8seci72 °C ; 3xlseci95 °C，12seci66 °C，8seci72 °C ;40 個欠嚴謹的螢光獲得循環:40xlseci95°C，8seci57°C (在此收集螢光)，30seci67°C，and30seci72°C ；1 個熔解循環:lxlseci95°C，10sec@38°C，@85°C持續收集螢光；降溫循環:lxlsec@38°C。
[0082]2)巢式PCR (內部和外部巢式PCR兩部分反應用以下相同的PCR循環程序)[0083]PCR擴增包括:預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、40個欠嚴謹的螢光獲得循環和I個降溫循環。預變性:lX2min@95 °C ;18個溫度遞減的高嚴謹循環:6xlsec@95 °C , 12seci70 °C,8seci72 °C ；9xlseci95 °C, 12seci68 °C,8seci72°C ; 3xlseci95°C, 12seci66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴謹的螢光獲得循環:40xlsec@95°C，8seci57°C，30seci67°C，and30seci72°C ;降溫循環:lxlsec@38°C。
[0084]6.PCR結果的判定。
[0085]DNA模板的製備過程均設有DNA提取的陰性和陽性對照，隨後的PCR擴增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照。此發明有著高度的特異性，不僅能檢測到所有立克次氏體的核酸，而且能夠確定相應樣品的立克次氏體種屬。陽性樣品和陽性對照在FRET-PCR的螢光擴增曲線中有螢光的出現或增強，且熔解曲線中有熔解峰出現。對於不同種屬的立克次氏體，其熔解峰的溫度會有差異。PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中的條帶大小不同，FRET-PCR目的條帶大小出現在167bp，巢式PCR外部產物條帶大小為444bp、內部產物為352bp。I) FRET-PCR對於陽性樣品和陽性對照，螢光在640nm出現或增強；在熔解曲線中會有熔解峰出現，且對於貓立克次氏體和其它種的立克次氏體其熔解峰會出現在不同的溫度值處(圖9)。2)巢式PCR首先使用外部引物(N-上遊引物-2和N-下遊引物-2)擴增陽性樣品；然後用外部引物的PCR產物作為模板，用內部引物(N-上遊引物-1和N-下遊引物-1)擴增目的核酸。且二者在瓊脂糖凝膠電泳的條帶大小為:外部引物444bp，內部引物352bp。
[0086]實施例1:本發明檢測方法與相關分子檢測方法的比較
[0087]本發明可以快速、準確、特異的檢測各種物種樣本中的立克次氏體核酸，並確定其立克次氏體的種。
[0088]I)本發明可以檢測所有的立克次氏體種屬。立克次氏體可以分為斑點熱(spotted fever group SFG)、斑疫傷寒(typhus group)和恙蟲病(scrub typhus group)等，而對於不同的種屬會引起不同的疾病，如普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疫傷寒和斑疫傷寒的病原體，莫氏立克次氏體(Rickettsia mooseri)是地方性斑疹傷寒(也稱鼠型斑疹傷寒)的病原體，立克次氏立克次氏體(Rickettsiarickettsii)是落基山斑疹傷寒的病原體，而恙蟲病立克次氏體是恙蟲病(叢林斑疹傷寒)的病原體。目前很多檢測方法只能檢測出斑點熱或者斑疹傷寒，而不能檢測所有的立克次氏體，如 「Molecular evidence of Rickettsia felis infection in dogs fromnorthern territory, Australia，，(Hii SF 等，Parasit Vectors.201 IOctlI; 4:198.do1:10.1186/1756-3305-4-198)中的 ompB-F 和 ompB-R (圖 10.)就只能檢測所有的斑點熱且不能通過PCR螢光發光來快速判斷樣品是否為陽性，所以操作較為繁瑣。
[0089]2)本發明可以快速檢測從而減少工作量。對於普通PCR，必須要通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷PCR產物中目的條帶的有無，對於從大量樣品中篩選陽性樣品就需要及其繁瑣的工作，由此勢必會影響樣本檢測的速度和準確性。如「A novel Rickettsia infectingAmblyomma dubitatum ticks in Brazil，，(Almeida AP et al., Ticks Tick BorneDis.2011; 2 (4):209-12)中的引物 CS-78 (forward)和 CS-323 (reverse)及引物 CS-239和CS-1069 (圖11.)就是通過普通PCR和電泳來判斷樣品中是否含有立克次氏體相關種屬的。[0090]3)本發明從更多的物種的不同類型的樣品中檢測到了立克次氏體的相關種屬。對於一種檢測方法需要從來自多種物種的樣本中檢測到目的核酸才更能說明其可行性，為相關立克次氏感染的檢測和診斷提供技術支持。如「Rickettsia Speciesinfecting Amblyomma cooperi ticks from an area in the state of Sa ~oPaulo, Brazil, where Brazilian spotted fever is endemic，，(Labruna MB et al.,J ClinMicrobiol.2004; 42 (I):90-98.)中的引物 CS-5 (forward)和 CS-6 (reverse)(圖-11)及探針5，6-FAM d (CATTGTGCCATCCAGCCTACGGT) BHQ-13，只是從蜱中檢測到了立克次氏體種屬的相關核酸，未能通過其他種類的樣本進行確定。
[0091]實施例3:檢測人血樣中的貓立克次氏體。
[0092]從揚州市某醫院獲取人全血樣品822份，置於含有EDTA的商業採血管中。然後用商業核酸提取試劑盒並按照相關說明書操作對人全血樣品進行核酸提取，作為PCR擴增模板。然後通過FRET-PCR和巢式PCR相結合的方式判斷出陽性樣品並確定其立克次氏體的種。結果顯示，在822份人全血樣品中檢測出1份立克次氏體陽性樣品。這是揚州市首次也是中國國內首次證實人感染貓立克次氏體的病例。
[0093]實施例4:檢測狗血樣中的立克次氏體。
[0094]從雲南省昆明市和上海市某動物醫院和動物門診共採取犬全血146份。其中昆明162份，上海84份。運用本發明對所有樣品進行檢測，結果顯示，有8隻犬的樣品感染了立克次氏體。在感染立克次氏體的狗中，有6隻來自雲南省昆明市，有2隻來自上海市。對陽性樣品經測序種屬鑑定後發現，有6個陽性樣品為貓立克次氏體，而另外2個陽性樣品為新的立克次氏體菌株，並且將該新型菌株提交到NCBI(http://www.ncb1.nlm.nih.gov),並獲得了對應的編號(GenBank N0.:KJ440515和KJ440516)。這不僅是在昆明市和上海市，同時也是在中國國內首次貓立克次氏體的報導，同時也發現了新的立克次氏體菌株。
[0095]實施例5:檢測尼加拉瓜犬血樣中的立克次氏體。
[0096]從中美洲加勒比海島國-尼加拉瓜採集39份狗全血樣品，並用本發明方法進行檢測。結果顯示，其中有2隻犬感染了立克次氏體，且該立克次氏體屬於貓立克次氏體。這是該國家首次報導貓立克次氏體，同時也是該國家首次在犬血樣中發現貓立克次氏體。
[0097]實施例6:檢測哥斯大黎加的犬血樣中的立克次氏體。
[0098]從中美洲的島國-哥斯大黎加採集犬全血樣品40份，並用本發明系統體系檢測其立克次氏體的感染狀況。結果顯示，樣品全部顯示陰性，即沒有立克次氏體的感染。同時用此40份狗全血樣品,通過埃立克體(Ehrlichia)和無形體(Anaplasma)的引物及探針分別檢測埃立克體和無形體病原體。結果顯示,感染埃立克體的個體達36個，同時有3份樣品感染了無形體。此結果同時也說明了，本發明不僅可以特異的檢測到所有立克次氏體的種屬，而且不會擴增非立克次氏體種屬，尤其是與其同源性較高的種屬，如埃立克體、無形體等。
[0099]實施例7:檢測跳蚤、蜱、蝨子樣本中的立克次氏體。
[0100]從揚州市的流浪貓身上採集60隻跳蚤，經種屬鑑定全部為貓櫛首蚤；從揚州市某狗場的商業狗身上採集146隻蜱和47隻蝨子，經種屬鑑定蜱全部為血紅扇頭蜱。用商業化核酸提取試劑盒對全部樣品進行核酸抽提後作為PCR擴增模板，然後用本發明檢測所有樣本。結果顯示，在60隻跳蚤中有57隻感染了立克次氏體，且所有的立克次氏體為貓立克次氏體；所有的蜱樣本中有15隻為陽性，其中14隻為貓立克次氏體，有I只攜帶的立克次氏體為新的菌株(GenBank N0.:KJ440521) ；47隻蝨子中有6隻為陽性，其中有3隻為貓立克次氏體，其他3個為新的立克次氏體菌株(GenBank N0.:KJ440517、KJ440518、KJ440522)。這是揚州地區首次報導跳蚤、蝨子和蜱感染立克次氏體，同時也是中國國內首次從跳蚤、蝨子和蜱中檢測到貓立克次氏體的報導，而且發現了新的立克次氏體菌株。
[0101]實施例8:檢測蚊子樣本中的立克次氏體。
[0102]從揚州市捕捉428隻蚊子檢驗本發明方法，從而為本發明更廣闊的樣本應用範圍提供理論支撐。用商業化核酸提取試劑盒對所有蚊子樣品進行核酸提取後，通過本發明方法檢測蚊子樣本是否攜帶了立克次氏體病原體。結果表明，在428隻蚊子中有153隻蚊子攜帶立克次氏體病原體。其中，有150隻蚊子攜帶的立克次氏體為貓立克次氏體，而其餘的3隻蚊子 攜帶了三種新的立克次氏體菌株(GenBank N0.:KJ440519、KJ440520、KJ440523)。這是揚州市首次立克次氏體的報導、首次蚊子攜帶立克次氏體的報導，同時也是中國國內首次報導貓立克次氏體、首次報導蚊子攜帶貓立克次氏體病原體報導，而且發現了新的立克次氏體菌株。
【權利要求】
1.用於實時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的引物及探針，其特徵在於，由FRET-PCR引物、探針，以及巢式PCR引物組成，所述引物、探針的具體序列如下: (1)FRET-PCR 引物、探針: FRET-上遊引物:5』 -1TRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3』 FRET-下遊引物:5』 -ATCCAGCCTACGGITCTTGCT-3』
6-FAM 探針:5』 -ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3』 LCRed640 探針:5』 -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3』 ； (2)巢式PCR: N-上遊引物-1:5』 -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3』 N-下遊引物-1:5』 -AnTTCTCTCAATAAAATAITCATCTTTAAG-3』 N-上遊引物-2:5』 -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3』 N-下遊引物-2:5』 -AGCTTCAAGTTCTAITGCTAITTGYAA-3』。
2.用於實時FRET-P CR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的試劑盒，其特徵在於由以下構成: .1)實時螢光定量PCR試劑 . 20 u I的擴增體系包含=IOiU的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、IU MFRET-上遊引物、I U M FRET-下遊引物、0.2 y M 的 6-FAM 探針、0.2 y M 的 LCRed640 探針、2個單位的Taq酶、200 U M dNTP ； . 2)巢式PCR試劑 巢式PCR-外部: .20 u I的擴增體系包含=IOiU的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩衝液、Iii MN-上遊引物-l、lii M N-下遊引物_1、2個單位的Taq酶、200 ii M dNTP ； 巢式PCR-內部:. 20 u I的擴增體系包含:10u I巢式PCR外部引物產物、IxPCR緩衝液、Iii M N-上遊引物-2、Iii M N-下遊引物_2、2個單位的Taq酶、200 ii M dNTP。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789442SQ201410061800
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月24日 優先權日:2014年2月24日
【發明者】王成明, 張繼壘, 陸光武, 張毅 申請人:揚州大學