高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法
2023-11-04 00:30:22
專利名稱：：高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物藥用原料的分離純化方法，具體是高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法。(二)現有技術肝素鈉自1916年Molean發現其良好的抗凝作用以來,歷經半個多世紀，作為一種重要的生化藥物而被廣泛地應用在醫藥臨床上。肝素鈉不僅具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗過敏、抗病毒和降血脂等多種生物功能，同時也是一種防治深部靜脈血栓、肺血栓或其他血栓的有效藥物。近幾年來，肝素鈉廣泛應用於美容、保健等其它領域中，有改善局部血液循環，及消炎、消除青春痘、潤膚、軟化疤痕等作用。目前我國抗血栓藥物中肝素類佔有最大的市場份額(39%)，在肝素類中低分子肝素又佔整個抗血栓類藥物27%的市場份額。肝素在臨床應用時常伴有出血、血小板減少，骨質疏鬆等副作用。但到目前為止，尚無一種能夠完全替代它的產品，儘管存在以上副作用，但在臨床上它仍然是預防手術後血栓形成和治療急性靜脈血栓的首選藥物。為了減輕肝素的副作用，人們採取了各種方法，但效果均不能和低分子肝素相當。1976年Johnson等發現當皮下注射從肝素鈉分離出來的分子量較小的片段(即低分子肝素，簡稱LMWH)時，在人體內其抗活性X因子(FXa)的作用遠高於普通肝素(SH)，而出現副作用卻明顯降低，其報導立即引起人們廣泛的興趣與密切關注。80年代後低分子肝素以其抗血栓作用強、出血副作用小，半衰期長、生物利用率高等優異的藥用物性，成為了當今肝素研究的扭佔。"、、"、、O肝素鈉的純化過程主要是對粗品肝素鈉進行除雜和脫色，目前，國內肝素鈉的純化主要是在不同pH條件下採用高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化法或過氧化氫分次加入的二次氧化法，再以有機溶劑進行分級沉澱；但第一種工藝的缺點是產品的活性損失大、色澤差、生產的二氧化錳較難濾除:且二氧化錳對肝素鈉有部分吸附作用，同時得到肝素外用級或類肝素等副產品，使產品回收率較低；第二種方法所得產品色澤較好，目前應用比較廣泛，但可能是二次氧化對肝素鈉結構造成破壞，難以得到較高純度的低分子量肝素鈉。
發明內容本發明的目的就在於針對現有技術的不足，提供一種生產周期短、產品收率高、質量穩定的高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法。本發明包括下述步驟第一步未分級肝素鈉溶液的製備①提取將腸黏膜加2-3倍水於反應罐中以蛋白酶酶解，蛋白酶的用量為腸黏膜重量的5-8%,酶解溫度50-55"，pH8.0—9.5，酶解時間3—5小時，酶解完畢，過濾，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3-4倍的鹼性陰離子交換樹脂攪拌吸附，第一次吸附6-10小時，濾出樹脂後，再加入樹脂攪拌吸附5—8小時，過濾，合併兩次樹脂，棄去濾液；②除雜將所得樹脂置於1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中攪拌40-45分鐘，濾出樹脂；③洗脫將樹脂置於洗脫罐中，以樹脂體積2-3倍量的濃NaCl溶液進行梯度洗脫，第一次以4.0-4.5mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間6小時，第二次第三次分別用3.0-3.5mol/L的NaCl溶液洗滌3小時，合併三次洗脫液；過濾調整洗脫液pH值至ll一12，過濾，濾液再調pH至7.0-7.5，即可得未分級的肝素鈉溶液；第二步未分級肝素鈉溶液的分離純化①肝素酶酶切降解在所製得的未分級肝素鈉溶液中按肝素酶肝素鈉溶液=1:12-5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，緩慢攪拌40-50分鐘，高速離心分離除固相化肝素酶，得酶切降解後的肝素鈉溶液；②第1次超濾將所得肝素鈉溶液用截留分子量15K的超濾膜超濾，得超濾液I;③胰酶酶解將超濾液I升溫至50。C，加超濾液重量0.1-0.5%的胰酶，調pH值至6.5一8.5，恆溫酶解3小時，然後升溫至90。C，冷卻後過濾，得濾液；第2次超濾將所得濾液，用截留分子量10K的超濾膜超濾，得超濾液]I;⑤第3次超濾將超濾液II用截留分子量4K的超濾膜超濾，以超濾液1-2倍的純水衝洗2次，分別收集截留液和超濾液m，將截留液冷凍乾燥，即得低分子肝素鈉；第4次超濾將超濾液III用截留分子量3K的超濾膜超濾，以超濾液2-3倍量的純水衝洗3次，收集截留液並冷凍乾燥，即可得分子量為3000—4000的肝素鈉。所用的蛋白酶是鹼性2709蛋白酶。所用的鹼性陰離子交換樹脂是PUROLITEZ-3樹脂。所用的鹼性陰離子交換樹脂前處理方法如下a.將樹脂放在容器內用40—5(TC熱水浸泡4-5小時，再用熱水衝洗3-5次；b.用含10-12%(重量百分比)NaCl的80—90°乙醇浸泡18-20小時，抽乾，再用40—50'C的熱水反覆衝洗3-5次；c.將樹脂投入到洗脫罐中，按照1:1的比例加入7—9%氫氧化鈉溶液浸泡並攪拌3小時左右，然後用清水衝洗至中性；d.將樹脂投入到洗脫罐中，按照l:1(g/g)的比例加入5mol/L鹽酸浸泡並攪拌3-4小時；e.放出鹽酸液，再加入用2倍於樹脂量的25%NaCl溶液攪拌2-3小時，放出NaCl溶液，用清水衝洗3-5次，即可。所述第一次、第二次超濾壓力均為0.18MP，第三次超濾壓力為0.14MP，第四次超濾壓力為0.12MP，四次超濾溫度均為22—26"C，超濾膜均採用聚碸膜。所用的胰酶是由新鮮豬胰臟攪碎後，於90°%的乙醇中常溫激活13-15小時製得。本發明與傳統工藝相比，具有以下的優點(l)在提取階段，通過優化工藝參數及使用樹脂多次吸附，獲得合適分子量分布範圍的未分級肝素鈉；再通過肝素酶酶切、胰臟酶解離結合多次"超濾截留技術"有選擇性截獲不同分子量範圍的肝素鈉(6000以上，4000—6000，3000_4000)。平均分子量在4200左右道爾頓的肝素鈉符合注射級要求和能作為小分子肝素鈉原料的低分子肝素鈉；3000—4000分子量的肝素鈉用於美容領域，變廢為寶；6000分子量以上的肝素鈉用於醫用外用級或重新降解。本工藝生產周期短，產品收率高、分布更加均勻，可實現低分子肝素生產的連續化，不會破壞肝素的有效基因成分，保留了生物活性，通過多次除雜，提高了產品純度和生物利用度，可減少藥物臨床使用時出現過敏、不適等症(2)針對樹脂在肝素鈉生產中出現的一些問題，對樹脂進行前期處理，使其吸附能力增強，各項性能指標均得到改善。本發明中所使用的PUROLITEZ-3鹼性陰離子交換樹脂，其鹼性稍強於其他同類樹脂，更有利於生成R+He—(R代表樹脂，He代表肝素，ROH+He—=R+He—+OH—);此樹脂交聯度低，孔隙率大，He—易於透入，交換平衡快，可獲較高純度和產率。樹脂用量減少，與傳統工藝相比，用量減少至約l/6左右。(3)使用樹脂兩次吸附，可提高收率20%，樹脂的量控制適當，保證了肝素鈉最大程度吸附且不浪費樹脂。(4)在洗脫過程中，用不同高濃度NaCl溶液多次梯度洗脫，從而確保肝素鈉最大量洗脫，可提高收率6%左右。(5)在肝素酶黴切前，通過調pH值和過濾，進一步除去了肝素鈉溶液中一些雜質，提高了肝素鈉得率和質量。(6)使用固相化肝素酶和胰臟酶降解肝素，產品和肝素易於分離，生產中十分方便，同時，酶可以反覆使用，可極大的節約成本。(7)直接用未分級肝素鈉溶液分離純化，乙醇用量大為減少(每公斤低分子肝素產品減少了乙醇消耗40升以上)，降低了製造成本，提高了生產工藝的防火防爆安全性，有利於減排和環境保護；減少了乙醇沉澱後離心分離的高勞動強度。(8)多次利用超濾截留不同分子量範圍的肝素鈉並使其產業化，不會改變肝素鈉分子結構，不僅生產成本低，質量穩定，而且所得的高純度低分子肝素得率高，分子分布合理。(9)自製的胰臟蛋白酶工藝簡單，原料來源廣，價格便宜，解離效率高。本發明可以通過測量240nm處的吸收值來控制產品質量。本發明工藝生產的低分子肝素有關數據如下-tableseeoriginaldocumentpage10具體實施方式實施例1第一步未分級肝素鈉溶液的製備①提取取腸黏膜加2倍的水於反應罐中，以氫氧化鈉溶液調節pH8.0，加入腸黏膜重量5%的鹼性2709蛋白酶，在5(TC下酶解3小時，酶解完畢，過濾，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3倍的PUROLITEZ-3鹼性陰離子交換樹脂攪拌吸附，第一次吸附6小時，濾出樹脂後，再加入樹脂攪拌吸附5小時，過濾，合併兩次樹脂，棄去濾液；②除雜將所得樹脂置於1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中攪拌40分鐘，濾出樹脂；③洗脫將樹脂置於洗脫罐中，以樹脂體積2倍量的濃NaCl溶液進行梯度洗脫，第一次以4.0mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間6小時，第二次第三次分別用3.0mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間3小時，合併三次洗脫液；過濾以氫氧化鈉溶液調整洗脫液pH值至ll，過濾，濾液再以鹽酸溶液調pH至7.0，即可得未分級的肝素鈉溶液；第二步未分級肝素鈉溶液的分離純化①肝素酶酶切降解在所製得的未分級肝素鈉溶液中按肝素酶肝素鈉溶液為1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，緩慢攪拌40分鐘，高速離心分離除固相化肝素酶，得酶切降解後的肝素鈉溶液；②第1次超濾將所得肝素鈉溶液用截留分子量15K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.18MP，超濾溫度為22。C，得超濾液I，截留液為較高分子量(6000以上)的低抗Xa因子比活性肝素鈉，可用於醫用外用級或重新降解；③胰酶酶解將超濾液I升溫至5(TC，加超濾液重量0.1%的胰酶，調pH值至6.5，恆溫酶解3小時，然後升溫至9(TC，冷卻後過濾，得濾液；④第2次超濾將所得濾液，用截留分子量10K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.18MP，超濾溫度為22"C，得超濾液II;⑤第3次超濾將超濾液II用截留分子量4K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.14MP，超濾溫度為22°C，超濾後以超濾液1倍的純水衝洗2次，分別收集截留液和超濾液III，將截留液冷凍乾燥，即得分子量為4000-6000的低分子肝素鈉；⑥第4次超濾將超濾液III用截留分子量3K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.12MP，超濾溫度為22。C，超濾後以超濾液2倍量的純水衝洗3次，收集截留液並冷凍乾燥，即可得分子量為3000—4000的肝素鈉。實施例2第一步未分級肝素鈉溶液的製備①提取取腸黏膜加3倍的水於反應罐中，以氫氧化鈉溶液調pH至9.5，加入腸黏膜重量8%的鹼性2709蛋白酶，在55。C下酶解5小時，酶解完畢，過濾，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量4倍的PUROLITEZ-3鹼性陰離子交換樹脂攪拌吸附，第一次吸附10小時，濾出樹脂後，再加入樹脂攪拌吸附8小時，過濾，合併兩次樹脂，棄去濾液；②除雜將所得樹脂置於1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中攪拌45分鐘，濾出樹脂；③冼脫將樹脂置於洗脫罐中，以樹脂體積3倍量的濃NaCl溶液進行梯度洗脫，第一次以4.5mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間6小時，第二次第三次分別用3.5mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間3小時，合併三次洗脫液；過濾以氫氧化鈉溶液調整洗脫液pH值至12，過濾，濾液再以鹽酸溶液調pH至7.5，即可得未分級的肝素鈉溶液；第二步未分級肝素鈉溶液的分離純化①肝素酶酶切降解在所製得的未分級肝素鈉溶液中按肝素酶肝素鈉溶液為1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，緩慢攪拌50分鐘，高速離心分離除固相化肝素酶，得酶切降解後的肝素鈉溶液；②第1次超濾將所得肝素鈉溶液用截留分子量15K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.18MP，超濾溫度為26。C，得超濾液I，截留液為較高分子量(6000以上)的低抗Xa因子比活性肝素鈉，可用於醫用外用級或重新降解；③胰酶酶解將超濾液I升溫至5(TC，加超濾液重量0.5%的胰酶，調pH值至8.5，恆溫酶解3小時，然後升溫至90'C，冷卻後過濾，得濾液；第2次超濾將所得濾液，用截留分子量10K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.18MP，超濾溫度為26"C，得超濾液II;⑤第3次超濾將超濾液II用截留分子量4K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.14MP，超濾溫度為26'C，超濾後以超濾液2倍的純水衝洗2次，分別收集截留液和超濾液III，將截留液冷凍乾燥，即得分子量為4000-6000的低分子肝素鈉；⑥第4次超濾將超濾液III用截留分子量3K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.12MP,超濾溫度為26。C，超濾後以超濾液3倍量的純水衝洗3次，收集截留液並冷凍乾燥，即可得分子量為3000—4000的肝素鈉。實施例3第一步未分級肝素鈉溶液的製備①提取取腸黏膜加2.5倍的水於反應罐中,以氫氧化鈉溶液調節pH9.0，加入腸黏膜重量5-8%的鹼性2709蛋白酶，在52。C下酶解4小時，酶解完畢，過濾，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3.5倍的PUROLITEZ-3鹼性陰離子交換樹脂攪拌吸附，第一次吸附8小時，濾出樹脂後，再加入樹脂攪拌吸附6.5小時，過濾，合併兩次樹脂，棄去濾液；②除雜將所得樹脂置於1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中攪拌40分鐘，濾出樹脂；③洗脫將樹脂置於洗脫罐中，以樹脂體積2.5倍量的濃NaCl溶液進行梯度洗脫，第一次以4.2mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間6小時，第二次第三次分別用3.2mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間3小時，合併三次洗脫液；過濾以氫氧化鈉溶液調整洗脫液pH值至11.5，過濾，濾液再以鹽酸溶液調pH至7.2，即可得未分級的肝素鈉溶液；第二步未分級肝素鈉溶液的分離純化①肝素酶酶切降解在所製得的未分級肝素鈉溶液中按肝素酶肝素鈉溶液為1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，緩慢攪拌45分鐘，高速離心分離除固相化肝素酶，得酶切降解後的肝素鈉溶液；②第1次超濾將所得肝素鈉溶液用截留分子量15K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.18MP，超濾溫度為24t:，得超濾液I，截留液為較高分子量(6000以上)的低抗Xa因子比活性肝素鈉，可用於醫用外用級或重新降解；(D胰酶酶解將超濾液I升溫至5(TC，加超濾液重量0.3%的胰酶，調pH值至7.0，恆溫酶解3小時，然後升溫至90。C，冷卻後過濾，得濾液；第2次超濾將所得濾液，用截留分子量10K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.18MP，超濾溫度為24。C，得超濾液II;⑤第3次超濾將超濾液II用截留分子量4K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.14MP，超濾溫度為24'C，超濾後以超濾液1倍的純水衝洗2次，分別收集截留液和超濾液III，將截留液冷凍乾燥，即得分子量為4000-6000的低分子肝素鈉；⑥第4次超濾將超濾液III用截留分子量3K的聚碸超濾膜超濾，超濾壓力為0.12MP，超濾溫度為24'C，超濾後以超濾液2.5倍量的純水衝洗3次，收集截留液並冷凍乾燥，即可得分子量為3000—4000的肝素鈉。上述實施例中所用的PUROLITEZ-3鹼性陰離子交換樹脂均先以下述方法進行前處理a.將樹脂放在容器內用40—50'C熱水浸泡4-5小時，再用熱水衝洗3-5次；b.用含10-12。％(質量百分比)NaCl的80—90°乙醇浸泡18-20小時，抽乾，再用40—5(TC的熱水反覆衝洗3-5次；c.將樹脂投入到洗脫罐中，按照1:1的比例加入7—9%(質量百分比)氫氧化鈉溶液浸泡並攪拌3小時左右，然後用清水衝洗至中性；d.將樹脂投入到洗脫罐中，按照1:1(g/g)的比例加入5mol/L鹽酸浸泡並攪拌3-4小時；e.放出鹽酸液，再加入用2倍於樹脂量的25%(質量百分比)NaCl溶液攪拌2-3小時，放出NaCl溶液，用清水衝洗3-5次，即可。所用的胰酶是由新鮮豬胰臟攪碎後，於90°%的乙醇中常溫激活13-15小時製得。權利要求1、高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，其特徵在於包括下述步驟第一步未分級肝素鈉溶液的製備①提取將腸黏膜加2-3倍水於反應罐中以蛋白酶酶解，蛋白酶的用量為腸黏膜重量的5-8％，酶解溫度50-55℃，pH8.0—9.5，酶解時間2—5小時，酶解完畢，過濾，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3-4倍的鹼性陰離子交換樹脂攪拌吸附，第一次吸附6-10小時，濾出樹脂後，再加入樹脂攪拌吸附5-6小時，過濾，合併兩次樹脂，棄去濾液；②除雜將所得樹脂置於1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中攪拌40-45分鐘，濾出樹脂；③洗脫將樹脂置於洗脫罐中，以樹脂體積2-3倍量的濃NaCl溶液進行梯度洗脫，第一次以4.0-4.5mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫時間6小時，第二次第三次分別用3.0-3.5mol/L的NaCl溶液洗滌3小時，合併三次洗脫液；④過濾調整洗脫液pH值至11—12，過濾，濾液再調pH至7.0-7.5，即可得未分級的肝素鈉溶液；第二步未分級肝素鈉溶液的分離純化①肝素酶酶切降解在所製得的未分級肝素鈉溶液中按肝素酶肝素鈉溶液＝1∶12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，緩慢攪拌40-50分鐘，高速離心分離除固相化肝素酶，得酶切降解後的肝素鈉溶液；②第1次超濾將所得肝素鈉溶液用截留分子量15K的超濾膜超濾，得超濾液I；③胰酶酶解將超濾液I升溫至50℃，加超濾液重量0.1-0.5％的胰酶，調pH值至6.5—8.5，恆溫酶解3小時，然後升溫至90℃，冷卻後過濾，得濾液；④第2次超濾將所得濾液，用截留分子量10K的超濾膜超濾，收集超濾液II；⑤第3次超濾將超濾液II用截留分子量4K的超濾膜超濾，以超濾液1-2倍的純水衝洗2次，分別收集截留液和超濾液III，將截留液冷凍乾燥，即得低分子肝素鈉；⑥第4次超濾將超濾液III用截留分子量3K的超濾膜超濾，以超濾液2-3倍量的純水衝洗3次，收集截留液並冷凍乾燥，即可得分子量為3000—4000的肝素鈉。2、根據權利要求1所述的高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，其特徵在於所用的蛋白酶是鹼性2709蛋白酶。3、根據權利要求1或2所述的高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，其特徵在於所用的鹼性陰離子交換樹脂是PUROLITEZ-3。4、根據權利要求1或3所述的高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，其特徵在於所用的鹼性陰離子交換樹脂的處理方法如下a.將樹脂放在容器內用40—50。C熱水浸泡4-5小時，再用熱水衝洗3-5次；b.用含10-12%(重量百分比)NaCl的80—90°乙醇浸泡18-20小時，抽乾，再用40-50"C的熱水反覆衝洗3-5次；c.將樹脂投入到洗脫罐中，按照1:1的比例加入7—9%(質量百分比)的氫氧化鈉溶液浸泡並攪拌3小時左右，然後用清水衝洗至中性；d.將樹脂投入到洗脫罐中，按照1:1(g/g)的比例加入5mol/L鹽酸浸泡並攪拌3-4小時；e.放出鹽酸液，再加入用2倍於樹脂量的25%(質量百分比)NaCl溶液攪拌2-3小時，放出NaCl溶液，用清水衝洗3-5次，即可。5、根據權利要求l所述的高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，其特徵在於，所述第一次、第二次超濾壓力均為0.18MP，第三次超濾壓力為0.14MP，第四次超濾壓力為0.12MP，四次超濾溫度均為22—26t:，超濾膜均採用聚碸膜。6、根據權利要求l所述的高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，其特徵在於所用的胰酶是由新鮮豬胰臟攪碎後，於90%的乙醇中常溫激活13-15小時製得。全文摘要高純度低分子量肝素鈉的生產純化方法，包括通過酶解、預處理後樹脂吸附和洗脫製得未分級肝素鈉溶液，然後通過肝素酶酶切、胰臟酶解離結合多次超濾截留，有選擇性截獲不同分子量範圍的肝素鈉，從而分離出不同分子量、適合不同領域使用的肝素鈉產品；本工藝方法生產周期短，產品收率高，分布均勻，可實現低分子肝素生產的連續化，不會破壞肝素的有效基因成分，保留了生物活性，通過多次除雜，提高了產品純度和生物利用度，可減少藥物臨床使用時出現過敏、不適等症狀的風險。文檔編號C12P19/14GK101544999SQ20091006161公開日2009年9月30日申請日期2009年4月10日優先權日2009年4月10日發明者晴方,梅正杰申請人:湖北五瑞生物工程有限公司